专利名称：一种用于评价细胞生长因子促肿瘤生长安全性的检测方法
技术领域：
本发明设计一种用于评价细胞生长因子促肿瘤生长安全性的检测方法。
背景技术：
生物制药，特别是基因工程制药的发展历史相对较短。从目前技术水平发展来看，基因 工程制药的上下游技术，包括质粒构件、发酵工艺、蛋白质纯化以及其后一系列的相关技术 已经基本解决，且较为成熟。目前人们最为担心的主要就是这些基因工程药物对人体的安全 性，即药理与毒理部分。细胞生长因子是一类能够促进细胞生长的调节因子，与肿瘤的生长、 发育紧密相关，其安全性是人们非常关心的一个重要问题。目前国内外有关基因工程药物安 全性的评价方法与指标主要是参考传统的化学药物的评价方法和指标体系。但由于基因工程 药物本身有其特殊生物学特性和作用机制，对这一类特殊的生物制品如再用传统的评价方法
显然不能反映其真实的生物学特性，因此，迫切需要建立能满足生长因子新药安全性评价的
特殊指标体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于评价细胞生长因子促肿瘤生长安全性的检测方法，能够 从分子生物学和细胞生物学的水平上对细胞生长因子的促生长作用及致瘤作用进行评价。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下 -一、用于细胞分裂和生长的测定方法
取原代细胞或细胞株进行培养，加入一定浓度的待检测细胞生长因子溶液或对照液，根 据细胞种类的不同，培养一定时间后采用CFSE标记流式细胞术测定细胞分裂，用^H]掺入法 测定细胞生长速度。
二、 用于评价CREB通路的体外测定方法
取原代细胞或细胞株进行培养，加入一定浓度的待检测细胞生长因子溶液或对照液，根 据细胞种类的不同，培养一定时间后用Western Blotting方法或流式细胞术测定CREB蛋白的 磷酸化水平；用Western Blotting方法或流式细胞术测定ICER和CREM蛋白的表达水平；用 染色质免疫沉降法测定CREB、 CREM、 ICER、 CBP、 P300与控制该细胞生长的特定基因(如 调节T细胞生长的I12基因)的启动子的结合程度。另外，利用实时定量RT-PCR技术对整个 CREB通路的主要基因表达进行分析，如ATFl-3、 CREB、 CREM、 CBP、 Ep300、 ICER、 Elkl、 GTF2b、 Polr2a-c、 Tbp等。
三、 用于评价CREB通路的体内测定方法用待评价的细胞生长因子或对照品加入细胞如AT6.3细胞株培养液中，在软琼脂胶上培 养一定时间如2周后，计算各组的克隆形成数量。用待评价的细胞生长因子或对照品加入细 胞如八丁6.3细胞株培养液中，培养一定时间后用皮下注射的方法将其注射到裸鼠体内，3周后 测量肿瘤体积。同时分析提取克隆和肿瘤的总RNA，分析CREB、 ICER、 CREM等基因的表 达水平。
本发明具有的优点是本发明利用分子生物学和细胞生物学技术，测定细胞生长因子药 物的促肿瘤生长的作用，检测方法虽然有些复杂，但是体内体外实验结果可靠。在目前还没 有评价细胞生长因子药物甚至基因工程药物毒理作用的统一标准的情况下，可作为细胞生长 因子药物甚至基因工程药物毒理评价的一个重要指标。 实施方式
如果细胞生长因子组的细胞分裂和生长速度明显高于对照组；如果细胞生长因子组细胞 的CREB蛋白的磷酸化水平、CREB、 CBP、 P300、 ATFl-3、 Elkl、 GTF2b、 Polr2a-c、 Tbp 等的基因或蛋白表达水平显著高于对照组，而同时CREM、ICER的表达水平显著低于对照组， 则可初步判断则该生长因子有过度促进细胞分裂和生长的可能。相反，则表示该药物没有促 进细胞分裂和生长的作用。如果细胞生长因子组的克隆形成数量和肿瘤体积的显著大于对照 组，则可初步判断该生长因子具有诱促肿瘤发生、生长的可能。
权利要求
1、一种用于评价细胞生长因子促肿瘤生长安全性的检测方法，其特征在于先测定待检测药物对细胞分裂和生长速度的影响；再CREB通路相关基因与蛋白的表达水平、磷酸化水平和DNA结合水平；最后检测克隆形成数量和肿瘤体积，结合所有检测结果综合判断的细胞生长因子促生长的可能性。
2、 权利要求1中细胞分裂和生长速度的测定分别应用CFSE标记流式细胞术和[SH]掺入法。
3、 权利要求1中含CREB通路相关基因与蛋白的表达水平、磷酸化水平和DNA结合水 平分别应用实时定量RT-PCR技术、Western Blotting方法、流式细胞术染色质免疫沉降法。 CREB通路相关基因与蛋白包括ATFl-3、 CREB、 CREM、 CBP、 Ep300、 ICER、 Elkl、 GTF2b、 Polr2a-c、 Tbp等。
4、 权利要求l中的克隆形成数量和肿瘤体积，分别应用软琼脂胶细胞培养和用皮下注射 的方法将细胞注射到裸鼠体内的方法诱导克隆和肿瘤的形成，然后测定克隆形成数量和肿瘤 体积。
全文摘要
本发明公开了一种用于评价细胞生长因子促肿瘤生长安全性的检测方法。先用CFSE标记流式细胞术和[<sup>3</sup>H]掺入法分别测定细胞分裂和生长速度。然后测定CREB通路相关基因与蛋白的表达水平，并测定CREB蛋白的磷酸化水平和CREB、CREM、ICER、CBP、P300与生长调空基因启动子的结合。最后评价克隆形成数量和肿瘤体积。应用分子生物学、细胞生物学技术，结合体外、体内实验结果这评价细胞生长因子促生长的安全性。本发明方法也可用于其他基因工程药物的安全性评价。
文档编号G01N33/48GK101419222SQ20071003105
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者昊 吴, 姚成灿, 美 屠, 查振刚 申请人:暨南大学