专利名称：一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白g糖基化检测试剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断类风湿关节炎的检测试剂及制备方法。
背景技术：
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节进展性破坏为主，并累及其他多种脏器的常见病。其发病率可高达5％。RA的病情特点为反复发作，呈进展性加重，如从关节晨僵、红肿到关节破坏，及使病人丧失活动能力等。类风湿关节炎被称为“不死的癌症”，它给病人带来了极大的身心痛苦和经济负担。类风湿关节炎如能在早期予以正确诊断并合理治疗，病情将可得到缓解或趋于稳定。目前类风湿关节炎现常用的诊断方法有实验室检测和X-光片方法等。其中实验室检测方法主要包括IgG、类风湿因子(RF)、血沉、C-反应蛋白测定等。但是这些方法各有不足之处IgG测定是病人血中总IgG水平的测定，不同人IgG水平变化范围较大，且免疫功能低下的病人并不伴有IgG升高；血沉和C-反应蛋白是反映病情活动期的一个指标，在多种疾病可有不同程度的升高，如结核、血液病和炎症等；类风湿因子出现较晚，并且仪有30-40％的病人为阳性，并同时受总IgG水平的影响；X-光片诊断是依据骨关节密度等诊断类风湿关节炎的指标，当类风湿关节炎病人出现骨改变时有意义，它也是一个较晚期出现的指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异灵敏且指标与发病机制直接相关的一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及制备方法。本发明主要是利用糖与凝集素及抗原与抗体的特异结合，偶联IgG分子中的糖链和蛋白链进行测定，即通过含有N-连接糖链的IgG分子糖基化水平的凝集素-亲和免疫测定诊断类风湿关节炎的一种试剂及制备方法。
本发明的技术方案概括如下
利用凝集素-亲和免疫方法主要为选择特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素或去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的凝集素包被酶标板，BSA封闭、加入待测样品、加入标记IgG抗体、显色和分析、酶标仪检测等。通过对病人体液(血清或关节滑液等)含半乳糖末端糖链的IgG糖基化降低的测定，或去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化增加的测定，诊断类风湿关节炎；双重测定IgG糖基化的变化，即平行测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的降低，和去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化的增加，根据两测定比值来判断IgG的糖基化异常。
本发明的具体方案如下一、检测含半乳糖末端糖链的IgG糖基化变化(降低)的试剂及制备方法(一)试剂主要包括有花生凝集素(PNA)包被酶标板(条)、洗涤液吐温(Tween)20-PBS(TPBS)、牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体、显色底物(四甲基联苯胺，TMB)、反应终止液H2SO4。
(二)制备方法1.用特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素，花生凝集素(PNA)包被酶标板(条)，浓度为0.05-20μg/ml(溶于碳酸盐缓冲液中，pH9.6)，体积为150-400μl，4℃过夜。
2.用洗涤液0.01-0.1％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板(条)2-5次，每次5-30分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。
3.加200-500μl 1-3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜。
4.用TPBS洗酶标板(条)2-4次，每次3-10分钟。
5.每孔加待测体液(或对照)样品50-300μl，37℃温育1小时。
6.用TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟。
7.加100-300μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体(1∶400-3000稀释)，温育10-30分钟。
8.用TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟。
9.加100-300μl HRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色5-15分钟。用TPBS洗涤2-5次，每次2-5分钟。
10.加反应终止液40-300μl 2N H2SO4终止反应。
11.在酶标仪A450nm波长处检测反应孔的吸光值，正常值范围0.60-0.80。
二、检测去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化变化(增加)的试剂及方法(一)试剂主要包括有蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板(条)、洗涤液吐温(Tween)20-PBS(TPBS)、牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体、碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)、反应终止液NaOH。
(二)制备方法1.用特异结合去半乳糖后所暴露的糖链末端(GlcNAc)的凝集素，蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板(条)，浓度为0.05-20μg/ml(溶于碳酸盐缓冲液中，pH9.6)，体积为150-400μl，4℃过夜。
2.用洗涤液0.01-0.1％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板(条)2-4次，每次5-30分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。
3.加200-500μl 1-3％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜。
4.TPBS洗酶标板(条)洗2-4次，每次3-10分钟。
5.加入待测体液(或对照)样品50-300μl，37℃温育10分钟-1小时，或4℃过夜。
6.用TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟。
7.加100-300μl碱性磷酸酶(AKP)标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500-2000稀释)，温育10-30分钟。
8.用TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟。
9.加100-300μl碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色5-15分钟。
用TPBS洗涤2-5次，每次2-5分钟。
10.加反应终止液40-300μl 1N NaOH溶液终止反应。
11.在酶标仪A405nm波长处检测吸光值，正常值范围0.20-0.30。
三、IgG分子糖基化双重检测的试剂及制备方法1、与检测含半乳糖末端糖链的IgG糖基化变化(降低)的试剂及制备方法相同(略)。
2、与检测去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化变化(增加)的试剂及方法相同(略)。
3、计算步骤2的检测值/步骤1的检测值的比值，正常值范围2.0-4.0。
大量研究表明RA病人IgG分子的糖链结构发生改变，每分子IgG含有两条结合于重链Fc段CH2结构域的N-连接糖链，与蛋白(肽链)的连接位点为Asn297，多数IgG分子的糖链成双天线结构。根据N-糖链双天线末端糖基组成差别，IgG分子可分为三种糖型(glycoforms)IgG2糖形(正常糖链)其两个双天线末端上有半乳糖，IgG1糖形(异常糖链)其一个双天线末端缺失半乳糖及IgG0糖形(异常糖链)其两个双天线末端均缺失半乳糖)，见附图1。依据类风湿关节炎发病中IgG糖蛋白分子中的糖链结构功能变化的糖分子病理学机制，利用糖链特异结合的凝集素1及抗IgG特异抗体2，通过对IgG的糖链3和蛋白质(肽)链4双夹心检测，测定糖基化改变(低半乳糖化)的IgG水平，见附图2，如含半乳糖(Gal)末端糖链的IgG糖基化的减低，或去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)次末端糖链的IgG的增加均反映IgG的低半乳糖化异常，根据检测结果可辅助诊断类风湿关节炎。
本发明相比现有技术具有如下优点1、灵敏特异、客观可靠、简单快速。
2、糖基化异常的IgG在RA发病初期可检测到，并可先于RA临床症状前出现，与确诊的RA病例符合率高，在80-90％，优于现有的一些临床检查指标，可提高IgG早期确诊率，减少RA给病人带来的身心痛苦和经济负担。
3、本发明不仅可用于类风湿关节炎的早期诊断，还可作为RA病人病情进展、疗效观察判断的辅助指标，对临床治疗有指导意义。
图1是本发明正常及异常IgG糖链结构示意图。
图2是本发明IgG糖基化的凝集素-亲和免疫检测原理图。
具体实施例方式
例1用特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素花生凝集素(PNA)包被酶标板，浓度为0.05μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6)，150μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.01％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次30分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加200μl 3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜。用TPBS洗酶标板2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测血清或IgG标准品(10ng)样品300μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加100μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500稀释，Sigma)，温育10分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加100μl HRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色15分钟。用TPBS洗涤2次，每次5分钟。加反应终止液40μl 2N H2SO4终止反应。在酶标仪A450nm波长处分别检测IgG标准品及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG标准品的吸光值为0.70，待测血清的吸光值为0.35。
例2用特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素花生凝集素(PNA)包被酶标板，浓度为20μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6)，400μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.1％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板5次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加500μl 1％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜。用TPBS洗酶标板4次，每次3分钟。孔中分别加病人待测关节滑膜液或IgG标准品(10ng)样品50μl，37℃温育1小时。用TPBS洗涤5次，每次5分钟。加300μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500稀释，Sigma)，温育30分钟。用TPBS洗涤5次，每次5分钟。加300μl HRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色5分钟。用TPBS洗涤5次，每次2分钟。加反应终止液300μl 2N H2SO4终止反应。在酶标仪A450nm波长处分别检测IgG标准品及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG标准品的吸光值为0.70，待测关节滑膜液的吸光值为0.20。
例3用特异结合去半乳糖后所暴露的糖链末端(GlcNAc)的蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板，浓度为0.05μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6，150μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.01％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次30分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加200μl 3％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜。TPBS洗酶标板洗4次，每次3分钟。孔中分别加病人待测血清或阳性对照(10ng)样品300μl，37℃温育1小时。用TPBS洗涤5次，每次5分钟。加100μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500稀释，Sigma)，温育30分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加100μl碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色15分钟。用TPBS洗涤2次，每次5分钟。加反应终止液40μl 1N NaOH溶液终止反应。在酶标仪A405nm波长处分别检测IgG阳性对照及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG阳性对照的吸光值为0.25，待测血清的吸光值为0.55。
例4用特异结合去半乳糖后所暴露的糖链末端(GlcNAc)的蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板，浓度为20μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6，400μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.1％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板5次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加500μl 1％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜。TPBS洗酶标板洗2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测关节滑膜液或阳性对照(10ng)样品50μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加300μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma)，温育10分钟。用TPBS洗涤5次，每次5分钟。加300μl碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色5分钟。用TPBS洗涤5次，每次2分钟。加反应终止液300μl 1N NaOH溶液终止反应。在酶标仪A405nm波长处分别检测IgG阳性对照及待测关节滑膜液反应孔的吸光值，检测结果IgG阳性对照的吸光值为0.25，待测关节滑膜的吸光值为0.60。
例51.用特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素花生凝集素(PNA)包被酶标板，浓度为0.5μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6)，300μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.05％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加400μl 3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜。用TPBS洗酶标板2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测血清或IgG标准品(10ng)样品100μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加200μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500稀释，Sigma)，温育10分钟。用TPBS洗涤2次，每次20分钟。加200μl HRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色15分钟。用TPBS洗涤2次，每次2分钟。加反应终止液40μl 2N H2SO4终止反应。在酶标仪A450nm波长处分别检测IgG标准品及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG标准品的吸光值为0.70，待测血清的吸光值为0.40。
2.用特异结合去半乳糖后所暴露的糖链末端(GlcNAc)的蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板，浓度为20μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6，300μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.05％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加400μl 1％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜。TPBS洗酶标板洗2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测血清或阳性对照(10ng)样品100μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加200μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma)，温育20分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加300μl碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色10分钟。用TPBS洗涤2次，每次2分钟。加反应终止液50μl 1N NaOH溶液终止反应。在酶标仪A405nm波长处分别检测IgG阳性对照及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG阳性对照的吸光值为0.25，待测血清的吸光值为0.65。
3.以上酶标仪A405nm和A450nm吸光值的检测值的比值分别是IgG阳性对照为2.8，待测血清为0.61。
例61.用特异结合IgG半乳糖糖链末端的凝集素花生凝集素(PNA)包被酶标板，浓度为0.5μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6)，300μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.05％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加400μl 3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜。用TPBS洗酶标板2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测关节滑膜液或IgG标准品(10ng)样品50μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加200μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶500稀释，Sigma)，温育20分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加200μl HRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色15分钟。用TPBS洗涤2次，每次2分钟。加反应终止液50μl 2N H2SO4终止反应。在酶标仪A450nm波长处分别检测IgG标准品及待测血清反应孔的吸光值，检测结果IgG标准品的吸光值为0.70，待测血清的吸光值为0.30。
2.用特异结合去半乳糖后所暴露的糖链末端(GlcNAc)的蘑菇凝集素(PVL)包被酶标板，浓度为20μg/ml(溶于碳酸钠缓冲液中，pH9.6，300μl/孔，4℃过夜。用洗涤液0.05％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶标板2次，每次5分钟。洗涤过程中同时振摇(以下洗涤同)。加400μl 1％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜。TPBS洗酶标板洗2次，每次10分钟。孔中分别加病人待测关节滑膜液或阳性对照(10ng)样品50μl，37℃温育10分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加200μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma)，温育20分钟。用TPBS洗涤3次，每次10分钟。加300μl碱性磷酸酶的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色10分钟。用TPBS洗涤2次，每次2分钟。加反应终止液50μl 1N NaOH溶液终止反应。在酶标仪A405nm波长处分别检测IgG阳性对照及待测关节滑膜液反应孔的吸光值，检测结果IgG阳性对照的吸光值为0.25，待测关节滑膜液的吸光值为0.70。
3.以上酶标仪A405nm和A450nm吸光值的检测值的比值分别是阳性对照为2.8，待测关节滑膜液为0.43。
权利要求
1.一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法，其特征在于用与糖链特异结合的凝集素及标记的IgG抗体，对IgG的糖基化进行凝集素—亲和免疫检测，其包括(1)测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的降低，(2)测定去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG增加，(3)双重测定IgG糖基化的变化即同时测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的降低，和N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化的增加，并计算两者测定的比值。
2.根据权利要求1所述的早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法，其特征在于(1)所述酶标板(条)的每孔用溶于碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的一种特异结合半乳糖末端糖链的花生凝集素包被，浓度为0.05-20μg/ml，体积为150-400μl，4℃过夜，(2)用0.01-0.1％吐温(Tween)20-PBS(TPBS)洗涤酶标板2-5次，每次5-30分钟，(3)加入200-500μl 1-3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封闭液，4℃过夜，(4)用TPBS洗酶标板(条)2-4次，每次3-10分钟，(5)加入待测体液50-300μl，37℃温育10分钟-1小时，(6)TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟，(7)加100-300μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体(1∶400-3000)，温育10-30分钟，(8)TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟，(9)加100-300μlHRP的显色底物(四甲基联苯胺，TMB)，避光显色5-15分钟，TPBS洗涤2-5次，每次2-5分钟，(10)加40-300μl 2N H2SO4终止反应，(11)在酶标仪A450nm波长处测定吸光值。
3.根据权利要求1所述的早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法，其特征在于(1)所述酶标板(条)的每孔用溶于碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的一种特异结合N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的蘑菇凝集素包被，浓度为0.05-20μg/ml，体积为150-400μl，4℃过夜，(2)用0.01-0.1％ TPBS洗涤2-5次，每次5-30分钟，(3)加入200-500μl 1-3％牛血清白蛋白BSA-TPBS封闭液，4℃过夜，(4)用TPBS洗酶标板(条)2-4次，每次3-10分钟，(5)加入待测体液50-300μl，37℃温育10分钟-1小时，(6)TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟，(7)加100-300μl碱性磷酸酶标记的IgG抗体(1∶500-2000)，温育10-30分钟，(8)TPBS洗涤2-5次，每次5-20分钟，(9)加100-300μl碱性磷酸酶标记的显色底物(对-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光显色5-15分钟，TPBS洗涤2-5次，每次2-5分钟，(10)加40-300μl 1N NaOH溶液终止反应，(11)在酶标仪A405nm波长处测定吸光值。
4.根据权利要求2和3所述的早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法，其特征在于(1)采用权利要求2的方法测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的吸光值，(2)采用权利要求3的方法测定去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖链的吸光值，(3)计算步骤(2)获得的检测值/步骤(1)获得的检测值的比值。
全文摘要
一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法，其主要是用与糖链特异结合的凝集素及标记的IgG抗体，对IgG的糖基化进行凝集素—亲和免疫检测，其包括测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的降低，测定去半乳糖后所暴露的N－乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG增加，双重测定IgG糖基化的变化即同时测定含半乳糖末端糖链的IgG糖基化的降低和N－乙酰葡萄糖胺次末端糖链的IgG糖基化的增加，并计算两者测定的比值。本发明灵敏特异、客观可靠、简单快速；与确诊的RA病例符合率高，在80－90％，优于现有的一些临床检查指标，可提高IgG早期确诊率。
文档编号G01N33/543GK101074951SQ200710011899
公开日2007年11月21日 申请日期2007年6月26日 优先权日2007年6月26日
发明者燕秋, 富力, 朱正美, 张文利, 马悦, 王晓琦 申请人:大连医科大学