甲状腺细针抽吸分子测定的利记博彩app

专利名称：甲状腺细针抽吸分子测定的利记博彩app
专利说明甲状腺细针抽吸分子测定
背景技术：
在美国，每年诊断出大约25,600例新甲状腺癌病例，且1,400位患者会死于该疾病。所有甲状腺癌中约75％属于乳头状甲状腺癌类型。剩余的由10％的滤泡性癌、5％-9％的髓样甲状腺癌、1％-2％的退行发育性癌、1％-3％的淋巴瘤和小于1％的肉瘤和其它罕见肿瘤组成。通常，甲状腺中的块(结节)是甲状腺癌的第一症征。在美国，有1000-1800万人具有单个甲状腺结节，且每年有大约490,000人变成临床上明显的。幸运地，这些结节中仅约5％是癌性的。
甲状腺癌诊断的常用方法是细针抽吸(FNA)活组织检查。细胞学地检查FNA样品，以确定结节是良性的还是癌性的。FNA的灵敏性和特异性范围分别是68％-98％和72％-100％，这取决于机构和医生。不幸地，在25％的病例中，样品不足以进行诊断，或通过细胞学不能确定。在现有的医学实践中，对具有不确定结果的患者进行外科手术，结果是，仅25％患有癌症，且75％以不必要的外科手术结束。具有高灵敏性和更好的特异性(高于25％)的分子测定，会极大地提高甲状腺癌的现有诊断准确性，并省去非癌性患者的不必要的手术。
比较基因组杂交(CGH)、基因表达的系列分析(SAGE)和DNA微阵列已经用于鉴别甲状腺癌中发生的遗传事件，例如杂合性丢失、基因上调和下调和基因重排。已经证实，PAX8和PPARγ基因重排事件与滤泡性甲状腺癌(FTC)有关。ret原癌基因的重排与乳头状甲状腺癌(PTC)有关。在FTC和PTC中都观察到了甲状腺过氧化物酶(TPO)基因的下调。据报道，半乳凝素-3是区分恶性甲状腺肿瘤和良性病变的候选标记。但是，其它研究证明，半乳凝素-3不是癌特异性的标记。意图用于甲状腺癌诊断的许多基因缺少精确的分子测定所需的灵敏性和特异性。
发明概述 本发明包括诊断甲状腺癌的方法，其通过下述实现，从患者获取生物样品；和测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括区分甲状腺癌和良性甲状腺疾病的方法，其通过下述实现，从患者获取样品；和测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括测试不确定的甲状腺细针抽吸(FNA)甲状腺结节样品的方法，其通过下述实现从患者获取样品；和测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括确定甲状腺癌患者治疗规程的方法，其通过下述实现从甲状腺癌患者获取生物样品；和测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平足以预示癌症，以使医生能够确定治疗该疾病的推荐外科手术类型和/或疗法。
本发明包括治疗甲状腺癌患者的方法，其通过下述实现从甲状腺癌患者获取生物样品；和测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着癌症；且如果他们是癌阳性的，则用甲状腺切除术治疗患者。
本发明包括交叉验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法，其通过下述实现a.从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；b.使样品次序随机化；c.留出来自约10％-50％样品的数据；d.对剩余的样品，计算所有变量的目标因子，和选择满足p-值截止(p)的变量；e.如下选择拟合预测模型的变量使用正向搜索，并评价训练误差，直到它命中预定误差率；f.在留出的10-50％样品上，测试预测模型；g.用取出的新样品集合，重复步骤c)-g)；和h.继续步骤c)-g)，直到已经测试100％样本，并记录分类性能。
本发明包括独立地验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法和由此得到的基因概况，其通过下述实现从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；使基因表达数据中的来源变异性标准化；计算以前选择的所有变量的目标因子；和在样品上测试预测模型，并记录分类性能。
本发明包括产生后验概率评分以使得能够诊断甲状腺癌患者的方法，其通过下述实现从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；将线性判别分析应用于数据上，以得到选择的基因；和将加权表达水平应用于选择的具有判别函数因子的基因上，以得到可以用作后验概率评分的预测模型。
本发明包括产生甲状腺癌预后患者报告的方法和由此得到的报告，其通过下述实现从患者得到生物样品；测量样品的基因表达；向其应用后验概率；和使用由此得到的结果以产生报告。
本发明包括组合物，其含有选自下述的至少一个探针集合SEQ IDNO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354；或与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids。
本发明包括试剂盒，其用于进行确定生物样品中的甲状腺癌诊断的测定，其含有用于检测选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。
本发明包括用于评估甲状腺癌状态的物品，其含有用于检测选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。
本发明包括用于执行本文提供的方法的微阵列或基因芯片。
本发明包括诊断/预后包(portfolio)，其含有选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分与SEQID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的，其中该组合足以表征甲状腺癌状态或在生物样品中复发的危险。
附图简述

图1是98个训练样品中4-基因标记的LOOCV的ROC曲线。
图2是98个训练样品中5-基因标记的ROC曲线。
图3a是74个独立验证样品中4-基因标记的ROC曲线；3b是74个独立验证样品中5-基因标记的ROC曲线。
图4a是对三-甲状腺对照基因标准化的4-基因标记的ROC曲线；4b是对三-甲状腺对照基因标准化的5-基因标记的ROC曲线。
图5a是47个甲状腺样品中具有一轮扩增的4-基因标记的ROC曲线；5b是47个甲状腺样品中具有二轮扩增的4-基因标记的ROC曲线；5c是47个甲状腺样品中具有一轮扩增的5-基因标记的ROC曲线；5d是47个甲状腺样品中具有二轮扩增的5-基因标记的ROC曲线。
图6a和6b描述了83个独立的新鲜冷冻的甲状腺样品的交叉验证ROC曲线。
图7a和7b描述了47个细针抽吸(FNA)甲状腺样品的标记验证ROC曲线。
图8a和8b描述了28个配对的新鲜冷冻的和FNA甲状腺样品的标记性能ROC曲线。
详细描述 在该研究中，目标是鉴别可以用于测定(例如基于DNA芯片的测定)中来区分甲状腺癌和良性甲状腺疾病的标记。使用Affymetrix人U133A基因芯片，分析了31个原发性乳头状甲状腺肿瘤、21个滤泡性甲状腺癌、33个滤泡性腺瘤样品和13个良性甲状腺疾病。对比甲状腺癌和良性组织之间的基因表达概况已使我们能够鉴别出2个标记通过百分位数分析和手工选择鉴别出的5-基因标记，和通过线性判别分析(LDA)方法选择的4-基因标记。这2个标记分别具有92％/70％和92％/61％的灵敏性/特异性性能，且已经在74个独立的甲状腺样品中验证。本文提出的结果证实，这些候选标记以比现在可得到的诊断操作更好的灵敏性和特异性，促进甲状腺癌的诊断。这2个标记适用于测试不确定的FNA样品。
通过在Affymetrix U133a芯片上对98个代表性甲状腺良性和肿瘤样品进行基因概况分析，我们已经为甲状腺FNA分子测定选择出2个基因标记，5-基因标记和4-基因标记。选择标记，以达到接近95％的最好测定灵敏性。除了纤连蛋白和甲状腺过氧化物酶以外，来自这2个标记的其它7个基因以前没有涉入甲状腺肿瘤发生。已经用独立的74个甲状腺样品验证了这2个标记，并且所述标记达到与在98个训练样品中的标记等同的性能。2个基因标记的性能分别是92％灵敏性和70％/61％特异性。当将这2个标记对特定的甲状腺对照基因标准化时，该性能比未标准化的标记有所提高。此外，该标记的表现与2个不同的靶制剂等同，即一轮扩增和二轮扩增。该验证对于FNA样品(其通常含有有限数目的甲状腺细胞)的甲状腺测定是极其重要的。
特定核酸序列在组织样品中的单纯存在或不存在，仅仅很少地发现具有诊断或预后价值。另一方面，关于各种蛋白、肽或mRNA的表达的信息，日益显得重要。基因组内具有表达蛋白、肽或mRNA的潜力的核酸序列(这样的序列称作“基因”)的单纯存在本身对该蛋白、肽或mRNA是否在给定细胞中表达是非决定性的。无论能表达蛋白、肽或mRNA的给定基因是否发生表达、和这样的表达发生的程度如何，如果发生表达的话，由许多复杂的因素决定。不论理解和评估这些因素的困难，测定基因表达都可以提供关于重要事件(例如肿瘤发生、转移、细胞凋亡和其它临床上相关的现象)的发生的有用信息。在基因表达概况中，可以发现基因有活性或无活性程度的相对指征。本发明的基因表达概况可以用于为甲状腺癌患者提供诊断和治疗。
样品制备需要收集患者样品。在本发明的方法中使用的患者样品是被怀疑含有患病细胞的样品，所述患病细胞例如在细针抽吸(FNA)甲状腺组织中从结节采集的细胞。从活组织检查或外科手术样品得到的大块组织制备和激光捕获显微解剖，也适用于该用途。激光捕获显微解剖(LCM)技术是选择待研究的细胞的一种方式，其使细胞类型异质性造成的变异性最小化。结果，可以容易地检测正常细胞或良性细胞和癌性细胞之间基因表达的中等或微小变化。样品也可以包含从外周血提取的循环上皮细胞。它们可以根据许多方法得到，但是最优选的方法是美国专利6,136,182所述的磁分离技术。一旦已得到含有目标细胞的样品，就提取RNA，扩增，并得到适当包(portfolio)中的基因的基因表达概况，优选地通过微阵列。
本发明包括诊断甲状腺癌的方法，其通过下述实现，从患者获取生物样品；和测量样品中来自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括区分甲状腺癌和良性甲状腺疾病的方法，其通过下述实现，从患者获取样品；和测量样品中来自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括测试不确定的甲状腺细针抽吸(FNA)甲状腺结节样品的方法，其通过下述实现从患者获取样品；和测量样品中来自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
本发明包括确定甲状腺癌患者治疗规程的方法，其通过下述实现从甲状腺癌患者获取生物样品；和测量样品中来自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平足以预示癌症，以使医生能够确定治疗该疾病的推荐外科手术类型和/或疗法。
本发明包括治疗甲状腺癌患者的方法，其通过下述实现从甲状腺癌患者获取生物样品；和测量样品中来自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着癌症；且如果他们是癌阳性的，则用甲状腺切除术治疗患者。
上面方法中的SEQ ID NO可以是36、53、73、211和242或199、207、255和354，或45、215、65、29、190、199、207、255和354。
本发明也包括含有进一步测量至少一个编码下述mRNA的基因的表达水平的步骤的上述方法与SEQ ID NO142、219和309相对应的；和/或与SEQ ID NO9、12和18相对应的；或被来自与表25所述的SEQID NO130、190和276相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO9、12和18相对应的psids的探针集合特异性识别的。本发明也包括含有进一步测量至少一个在样品中组成型表达的基因的表达水平的步骤的上述方法。
在US20030194406；US 20050037439；和US 20040137539中提及了钙粘着蛋白3，1型(SEQ ID NO53)。在US6436642和US20030104419中提及了纤连蛋白(SEQ ID NO242)。在US20030232350；和US20040002067中提及了分泌颗粒，神经内分泌蛋白1(SEQ ID NO76)。在US20030108963；和US20050037463中提及了睾丸蛋白聚糖-1(SEQID NO36)。在US6066449、US20030118553；US20030054571；WO9102061；和WO9856953中提及了甲状腺过氧化物酶(SEQ ID NO211)。在WO2005005601和US20020114806中提及了趋化因子C(C-C)基序配体18(SEQ ID NO354)。在US20030219760；和US20030232350中提及了肺表面活性剂-相关蛋白B(SEQ ID NO355)。在US20030096782；和US 20020168638中提及了K+通道β亚基(SEQ IDNO207)。在WO2005020784中提及了推定的前列腺癌抑制子(SEQ IDNO178)。在WO2004040014；和WO2005020784中提及了骨髓基质细胞抗原1(SEQ ID NO142)。在US20030060614中提及了白细胞免疫球蛋白-样受体-6b(SEQ ID NO219)。在EP1393776；WO02057414；WO0116158和US6831063中提及了桥接综合者(integrator)2(SEQ IDNO309)。在WO2004030615；和WO9733995中提及了富含半胱氨酸的、生血管的诱导物61(SEQ ID NO9)。在US20040241653和WO2005015236中提及了含硒蛋白P，血浆1(SEQ ID NO12)。在WO2005015236；WO9203469；WO9203152；和EP0546053中提及了胰岛素-样生长因子-结合蛋白4(SEQ ID NO18)。
在本发明中，在本文提供的方法中分析患者的基因表达模式的最优选的方法，是通过使用线性判别分析程序。本发明包括产生后验概率评分以使得能够诊断甲状腺癌患者的方法，其通过下述实现从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；将线性判别分析应用于数据上，以得到选择的基因；和将加权表达水平应用于选择的具有判别函数因子的基因上，以得到可以用作后验概率评分的预测模型。其它分析工具也可以用于解决相同的问题，例如，逻辑回归和神经网络方法。
例如，可以使用下式进行线性判别分析 其中， I(psid)＝括号内围住的探针集合的底为2的对数(log base 2)强度 d(CP)＝癌阳性类别的判别函数 d(CN)＝癌阴性类别的判别函数 P(CP)＝癌阳性类别的后验p-值 P(CN)＝癌阴性类别的后验p-值 可以得到许多其它众所周知的模式识别方法。下面的参考文献提供了一些实例加权表决(Weighted Voting)Golub等(1999)；支持向量机(Support Vector Machines)Su等(2001)；和Ramaswamy等(2001)；K-最近邻(K-nearest Neighbors)Ramaswamy(2001)；和相关系数(Correlation Coefficients)van′t Veer等(2002)。
优选地，确立包，从而使得包内基因组合相对于单个基因或随机选择的基因组合表现出提高的灵敏性和特异性。在本发明的上下文中，包的灵敏性可以反映在患病状态基因的表达相对于正常状态表现出的倍数差异中。特异性可以反映在基因表达的信号传导与目标状况的关联的统计学测量中。例如，标准差可以用作这样的测量。在考虑一组包含在包内的基因时，表达测量中的小标准差与更大的特异性相关联。其它变异测量例如相关系数，也可以用于该能力。本发明也包括这样的上述方法，其中特异性是至少约40％、至少约50％和至少约60％。本发明也包括这样的上述方法，其中灵敏性是至少约90％和至少约92％。
本发明也包括这样的上述方法，其中利用模式识别方法，进行表达模式的对比。一种本发明的方法包含，对比各种基因(或包)的基因表达模式，以解释诊断。将构成该包的每个基因的基因表达模式固定在介质中，例如计算机可读介质。这可以采取许多形式。例如，可以确立表，向其中输入指示疾病的信号范围(例如，强度测量)。然后，可以将实际的患者数据与表中的值相对比，以确定患者样品是正常的、良性的或患病的。在更复杂的实施方案中，数字地或图形地记录表达信号(例如，荧光强度)的模式。然后，将与患者样品一起使用的来自基因包的基因表达模式与该表达模式相对比。
然后，可以使用模式对比软件来确定患者样品是否具有指示疾病的模式。当然，这些对比也可以用于确定患者是否可能经历该疾病。然后，将样品的表达概况与对照细胞包相对比。如果样品表达模式与癌的表达模式相一致，则(在不存在抵消性医学考虑的情况下)如治疗甲状腺癌患者一样治疗患者。如果样品表达模式与正常/对照细胞的表达模式相一致，则将患者诊断为癌阴性的。
优选地，基于杂交的微阵列探针的强度测量的倍数变化，区分上调和下调的水平。对于进行这样的区分，1.5倍差异是优选的(或p-值小于0.05)。也就是说，在认为基因在患病细胞相对于正常细胞中差异表达之前，发现患病细胞产生为正常细胞的至少约1.5倍、或2/3的强度。倍数差异越大，使用该基因作为诊断或预后工具是越优选的。为本发明的基因表达概况选择的基因，具有导致信号产生的表达水平，所述信号使用临床实验室仪器操作，通过超过背景的量，可以与正常的或非调节的基因的信号区分开。
统计学值可以用于确信地辨别调节的和非调节的基因与噪音。统计学检验发现在不同样品组之间存在最明显差异的基因。斯氏T-检验是可以用于发现2组之间的显著差异的有力统计学检验的实例。p-值越低，该基因在不同组间表现出差异的证据越有力。尽管如此，由于微阵列每次测量超过一个基因，所以可以同时查询好几万统计学检验。鉴于此，人们不可能仅仅偶然地观察到小p-值，且使用Sidak校正以及随机化/排列试验，可以对此进行调整。T-检验小于0.05的p-值，证明该基因是显著不同的。更有力的证据是，进行Sidak校正后包括小于0.05的p-值。对于每组中的大数目的样品，随机化/排列试验后小于0.05的p-值，是显著差异的最有力证据。
本发明包括用于执行本文提供的方法的微阵列或基因芯片。微阵列可以含有来自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的，其中该组合足以表征甲状腺癌或在生物样品中复发的危险。微阵列优选地测量或表征至少约1.5-倍超表达或表达不足，提供统计学上显著的p-值超表达或表达不足，或p-值小于0.05。优选地，微阵列含有cDNA阵列或寡核苷酸阵列，且可以含有一种或多种内部对照试剂。一种优选的内部对照试剂是，检测PAX8基因表达的方法，所述PAX8基因表达可以使用SEQ ID NO409-411测量。
优选地，阵列中的寡核苷酸与待测量其表达的基因的3’非编码区相对应。
可以用于选择产生大于非调节的基因或噪音的信号的基因的另一个参数是，测量绝对信号差异的应用。优选地，调节的基因表达产生的信号至少20％不同于正常的或非调节的基因的信号(在绝对基础上)。甚至更优选地，这样的基因产生至少30％不同于正常的或非调节的基因的表达模式。
确立基因表达概况的优选方法包括，测定可以编码蛋白或肽的基因生成的RNA的量。这可以通过反转录酶PCR(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差别展示RT-PCR、RNA印迹分析和其它相关试验来实现。尽管使用单个的PCR反应可能实施这些技术，最好扩增从mRNA生成的互补的DNA(cDNA)或互补的RNA(cRNA)，并通过微阵列对其进行分析。许多不同的阵列构型和它们的生产方法是本领域技术人员已知的，且记载在美国专利，例如5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734；和5,700,637中。
微阵列技术允许同时测量数千个基因的稳态mRNA水平，从而代表鉴别诸如失控细胞增殖的发作、停滞或调节的作用的有力工具。目前，广泛地使用2个微阵列技术。第一个是cDNA阵列，且第二个是寡核苷酸阵列。尽管这些芯片的结构存在差异，但几乎所有下游数据分析和输出都是相同的。这些分析的结果通常是从标记探针接收到的信号的强度的测量，所述标记探针用于检测来自样品的、与在微阵列的已知位置处的核酸序列杂交的cDNA序列。通常，信号的强度与在样品细胞中表达的cDNA，且因而mRNA的量成比例。许多这样的技术是可以得到和有用的。测定基因表达的优选方法可以参见，美国专利6,271,002；6,218,122；6,218,114；和6,004,755。
通过对比这样的信号强度，进行表达水平的分析。这最好通过生成试验样品中基因表达强度与对照样品中基因表达强度的比率矩阵来进行。例如，可以将来自患病组织的基因表达强度与从相同类型的良性或正常组织产生的表达强度相对比。这些表达强度的比率，指示着试验样品和对照样品之间基因表达的倍数变化。
基因表达概况也可以以许多方式展示。最常见的方法是，将原始荧光强度或比率矩阵排列成图解树形图，其中列代表试验样品，且行代表基因。将数据这样排列，从而具有类似表达概况的基因彼此邻近。每个基因的表达比率用颜色显现。例如， 小于1的比率(指示下调)可以出现在谱的蓝色部分，而大于1的比率(指示上调)可以呈现在谱的红色部分中的颜色。可以得到商业上可得到的计算机软件程序，以展示这样的数据，包括来自Silicon Genetics，Inc.的“GENESPRING”，和来自Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”软件。
在实施例中描述了用于本发明方法中的调节的基因。与良性甲状腺疾病患者相比，在甲状腺癌患者中，有差别地表达的基因受到上调或下调。上调和下调是相对的术语，表示与一些基线相比，发现了基因的表达量的可检测差异(超过用于测量它的系统中的噪音的贡献)。在该情况下，基线是测量的良性疾病患者的基因表达。然后，使用相同的测量方法，患病细胞中的目标基因相对于基线水平受到上调或下调。在该背景下，患病指，随着失控的细胞增殖而发生的身体状态的改变，该改变打断或扰乱身体功能的正确表现、或具有扰乱身体功能的正确表现的潜力。当一个人的基因型或表型的有些方面与疾病的存在相一致时，则诊断出某人患有疾病。但是，进行诊断或预后的行为包括测定疾病/体质问题，例如测定复发的可能性、治疗的类型和治疗监控。在治疗监控中，通过对比基因随时间推移的表达，以确定基因表达概况是否已经改变或正在改变成与正常组织更一致的模式，对给定治疗进程的作用作出临床判断。
可以将基因分组，从而使得关于组内基因集合得到的信息提供作出临床上相关判断，例如诊断、预后或治疗选择的可靠基础。这些基因集合构成本发明的包。关于大多数诊断标记，经常需要使用最少数目的、足以作出正确医学判断的标记。这阻止在进一步分析之前治疗的延迟、以及时间和资源的无价值的使用。
确立基因表达包的一种方法是通过最优化算法的使用，例如在确立股票包中广泛使用的平均方差算法。该方法详细描述在美国专利公开号20030194734中。基本上，该方法需要确立一组输入值(财务应用中的股票，通过这里的强度测量的表达)，它们会最优化使用它时接收到的返回值(例如，产生的信号)，同时使返回值的变异性最小化。许多商业化的软件程序可以用于进行这样的操作。“Wagner Associates Mean-VarianceOptimization Application”贯穿本说明书称为“Wagner软件”，它是优选的。该软件使用来自“Wagner Associates Mean-Variance OptimizationLibrary”的函数以确定有效界限，且在Markowitz意义上的最佳包是优选的。这类软件的应用，要求当该软件用于它们的计划财务分析目的时，微阵列数据被转换从而使得它可以以股票返回方式作为输入值处理和使用危险测量。
选择包的方法也可以包括应用启发式规则。优选地，这样的规则在生物学和对用于产生临床结果的技术的理解的基础上建立。更优选地，它们应用于来自最优化方法的输出值。例如，包选择的平均方差方法可以应用于在癌症受试者中有差别地表达的许多基因的微阵列数据。来自该方法的输出值是最优化的基因集合，其可包括在外周血以及患病组织中表达的有些基因。如果在测试方法中使用的样品是从外周血获得的，且在癌症情况下有差别地表达的某些基因也会在外周血中有差别地表达，则可以应用启发式规则，其中从有效界限选择包，不包括在外周血中有差别地表达的那些。当然，可以在形成有效界限之前应用该规则，例如，通过在数据预选择过程中应用该规则。
可以应用不一定与正被讨论的生物学相关的其它启发式规则。例如，人们可以应用这样的规则，其中仅规定百分比的包可以由特定基因或基因组代表。商业上可得到的软件，例如Wagner软件，容易地适应这些类型的启发式研究。这可能是有用的，例如，当除了准确度和精密度以外的因素(例如，预期的许可费)对包括一个或多个基因的需要性具有影响时。
本发明的基因表达概况也可以与用于癌症诊断、预后或治疗监控的其它非遗传诊断方法联合使用。例如，在有些情况下，有益的是组合上述基于基因表达的方法的诊断能力和来自常规标记、例如血清蛋白标记(例如， 癌抗原27.29(“CA 27.29”))的数据。存在许多这样的标记，包括诸如CA 27.29的分析物。在一种这样的方法中，从治疗的患者外周地采集血液，然后进行上述一种血清标记的酶免疫测定。当标记的浓度暗示肿瘤的回复或治疗的失败时，采集顺从基因表达分析的样品来源。当存在可疑块时，进行细针抽吸(FNA)，且然后如上所述，分析从该块采集的细胞的基因表达概况。或者，组织样品可以采自以前去除肿瘤的组织的邻近区域。当其它测试产生不确定的结果时，该方案是特别有用的。
本发明包括交叉验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法，和这样得到的概况，其通过下述实现a.从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；b.使样品次序随机化；c.留出来自约10％-50％样品的数据；d.对剩余的样品，计算所有变量的目标因子，和选择满足p-值截止(p)的变量；e.如下选择拟合预测模型的变量使用正向搜索，并评价训练误差，直到它命中预定误差率；f.在留出的10-50％样品上，测试预测模型；g.用取出的新样品集合，重复步骤c.-g.；和h.继续步骤c)-g)，直到已经测试100％样品，并记录分类性能。在该方法中，优选地，在步骤h.中得到的基因表达数据由来自编码下述mRNA的那些的基因代表与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的；或被来自表25中与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的psids的探针集合特异性识别的。
本发明包括独立地验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法，和这样得到的概况，其通过下述实现，从统计上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；使基因表达数据中的来源变异性标准化；计算以前选择的所有变量的目标因子；和在样品上测试预测模型，并记录分类性能。在该方法中，优选地，在步骤d.中得到的基因表达数据由来自编码下述mRNA的那些的基因代表与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的；或被来自表25中与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的psids的探针集合特异性识别的。
本发明包括产生后验概率评分以使得能够诊断甲状腺癌患者的方法，其通过下述实现从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；将线性判别分析应用于数据上，以得到选择的基因；将加权表达水平应用于选择的具有判别函数因子的基因上，以得到可以用作后验概率评分的预测模型。例如，可以使用下式进行线性判别分析 其中， I(psid)＝括号内围住的探针集合的底为2的对数强度 d(CP)＝癌阳性类别的判别函数 d(CN)＝癌阴性类别的判别函数 P(CP)＝癌阳性类别的后验p-值 P(CN)＝癌阴性类别的后验p-值 本发明包括产生甲状腺癌诊断患者报告的方法和由此得到的报告，其通过下述实现从患者得到生物样品；测量样品的基因表达；向其应用后验概率评分；和使用由此得到的结果以产生报告。该报告也可以含有患者结果的评估和/或与相对于患者群体的危险可能性。
本发明包括组合物，其含有来自下述的至少一个探针集合SEQ IDNO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354；或与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids。
本发明包括试剂盒，其用于进行确定生物样品中的甲状腺癌诊断的测定，其含有用于检测来自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。SEQ ID NO.可以是36、53、73、211和242，199、207、255和354和45、215、65、29、190、199、207、255和354。
根据本发明制备的试剂盒包括用于测定基因表达概况的格式化测定。它们可以包括实施该测定所需的全部或一些材料，例如试剂和说明书和测定核酸序列、它们的互补体或其部分的介质。
本发明的物品包括用于治疗、诊断、预测和以其他方式评估疾病的基因表达概况的代表物(representation)。这些概况代表物化为可以被机器自动读取的介质，例如计算机可读介质(磁的、光学的等)。该物品也可以包括关于评估这样的介质中的基因表达概况的指令。例如，该物品可以包含CD ROM，其具有关于对比上述基因包的基因表达概况的计算机指令。该物品也可以具有数字地记录在其中的基因表达概况，以便可以将它们与来自患者样品的基因表达数据进行对比。或者，可以以不同的代表格式记录概况。图形记录是一种这样的格式。聚类算法，例如整合进上述来自Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”软件中的那些，可以最好地辅助显现这样的数据。
不同类型的根据本发明的制品是用于揭示基因表达概况的介质或格式化的测定。它们可以包含例如微阵列，其中序列互补体或探针固定在基质上，指示目标基因的序列与它们结合，从而产生它们存在的可读决定因子。或者，根据本发明的物品可以制成试剂盒，其用于进行杂交、扩增和信号产生，后者指示着用于检测癌的目标基因的表达水平。
本发明包括用于评估甲状腺癌状态的物品，其含有用于检测来自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。SEQ ID NO.可以是36、53、73、211和242；199、207、255和354；或45、215、65、29、190、199、207、255和354。
本发明包括诊断/预后包，其含有来自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或被来自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或被来自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的，其中该组合足以表征甲状腺癌状态或在生物样品中复发的危险。优选地，该包测量或表征至少约1.5-倍超表达或表达不足，或提供统计学上显著的p-值超表达或表达不足。优选地，p-值小于0.05。
提供下面的实施例来解释、而不是限制要求保护的发明。本文引用的所有参考文献都在本文中引作参考。
实施例1 材料和方法 组织样品 从不同的商业供应商获取新鲜冷冻的甲状腺良性疾病、滤泡性腺瘤、滤泡性癌和乳头状癌样品，包括Genomics Collaborative，Inc.(Cambridge，MA)、Asterand(Detroit，MI)和Proteogenex(Los Angeles，CA)。根据Institutional Review Board批准的规程，收集所有样品。也收集患者人口统计和病理学信息。评论每个样品的组织病理学特征，以证实诊断、估计样品保存和肿瘤含量。
RNA分离 使用标准的TriZol规程进行所有RNA分离。在TriZol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)中匀浆组织。从TriZol分离总RNA，并用异丙醇在-20℃沉淀。用75％乙醇洗涤RNA沉淀，溶于水中，并保藏在一80℃备用。用Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 NanoAssay(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)，检查RNA完整性。
线性判别分析 使用下述步骤，进行线性判别分析计算共同的(合并)协方差矩阵和组内平均值；从共同协方差和组内平均值，计算线性判别函数的集合；和使用线性判别函数进行分类。
将每个探针的芯片强度读数插入下述方程式可以用于推论出未知甲状腺样品是癌症阳性还是阴性的后验概率。例如，如果在测定中测试甲状腺样品，并产生p(CP)>0.5，则该样品分类为甲状腺癌。
对于4基因标记 d(CP)＝-50.9964+0.220424(I(32128_at))+1.520185(I(209810_at))+3.09431(I(210078_s_at))+6.11283(I(213423_x_at)) d(CN)＝-46.7445+0.374751(I(32128_at))+1.010852(I(209810_at))+3.645515(I(210078_s_at))+5.337296(I(213423_x_at)) 对于5基因标记 d(CP)＝-135.931+4.737838(I(202363_at))-1.23763(I(203256_at))+1.984148(I(203889_at))+6.638082(I(210342_s_at)+10.7704(I(212464_s_at)) d(CN)＝-128.978+4.610498(I(202363_at))-1.28685(I(203256_at))+1.656772(I(203889_at))+6.859133(I(210342_s_at)+10.24482(I(212464_s_at)) 其中， I(psid)＝括号内围住的探针集合的底为2的对数强度 d(CP)＝癌阳性类别的判别函数 d(CN)＝癌阴性类别的判别函数 P(CP)＝癌阳性类别的后验p-值 P(CN)＝癌阴性类别的后验p-值 二轮aRNA扩增 使用RiboBeast 2-轮氨基烯丙基-aRNA扩增试剂盒(Epicentre，WI)，基于T7的RNA线性扩增规程，经一些修改，从10ng总RNA扩增aRNA。使用含有T7 RNA聚合酶启动子序列的寡(dT)引物和Superscript III RT，逆转录总RNA。使用Bst DNA聚合酶，进行第2链合成。用Exo I和Exo VII的外切核酸酶混合物进行额外的温育步骤，以减少背景。将双链cDNA用作通过体外转录的T7-介导的线性扩增的模板。对于第2轮扩增，不使用RiboBeast试剂，而使用ENZOBioArray HighYield RNA转录物标记试剂盒(Affymetrix，CA)替代氨基烯丙基-aRNA的体外转录步骤。通过Agilent Nano Chip技术，定量aRNA。
实施例2 微阵列分析 制备标记的cRNA，且其与含有共22,000探针集合的高密度寡核苷酸阵列Hu133A Gene Chip(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。根据生产商提供的标准规程，进行杂交。使用Affymetrix规程和扫描仪，扫描阵列。对于随后的分析，将每个探针集合视作独立的基因。使用Affymetrix基因芯片分析软件MAS 5.0，计算每个基因的表达值。所有芯片都满足下述质量控制标准“存在”请求(“presence”call)的百分比、比例因子、背景水平和噪音水平必须在平均值+或-3标准差的范围内。用于随后分析的所有芯片都已经通过这些质量控制标准。在表1中总结了用于标记选择和独立验证的样品收集。
表1.用于标记训练和验证的样品收集 训练样品集合
实施例3 结果标记鉴别 A.基因选择 使用Affymetrix人U133A基因芯片，分析了共98个样品，包括31个原发性乳头状甲状腺肿瘤、21个滤泡性甲状腺癌、33个滤泡性腺瘤和13个良性甲状腺组织。将5个基因选择标准应用于整个数据集合，以得到用于随后基因标志或标记鉴别的有限数目的基因 1.考虑在该样品集合中具有至少一个“存在请求(Present Call)”的基因。
2.排除在12个PBL样品中具有超过一个“存在请求”的基因。
3.只选择在所有样品中具有大于200的芯片强度的基因。
4.使用通过上面3个标准的基因，我们进行了表2所列的许多分析，以鉴别在甲状腺肿瘤中上调或下调的基因。
5.最后，选择表达变化大于1.4-倍的基因。
表2.不同类型的百分位数分析的总结
为标记鉴别选择的基因的最终数目是322，在表25中描述为，SEQID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363。从322个选择的基因得到的数据，提供在表3中，并总结在表4中。
表3 3a 3b 3c 3d 3e 3f 3g 3h 3i 3j 3j 3k 表4.98个训练样品中的4-基因标记性能 肿瘤良性 阳性48 18 阴性4 28 灵敏性 92％(0.82，0.97) 特异性 61％(0.46，0.74) B.使用线性判别分析的标记鉴别 我们使用每次添加一个基因的正向选择方法，直到通过线性判别器评估的后验误差(posterior error)小于或等于0.1。使用该方法，利用322个基因，发现了4-基因标记。在表5和16中列出了这4个基因的同一性，且在表6和7中显示了它们的芯片数据。
表5.4-基因标记 SEQ ID NO基因名称 354趋化因子(C-C基序)配体18(肺的和激活-调节的) 199肺表面活性剂-相关蛋白B(SP-B) 207K+通道β亚基 255推定的前列腺癌肿瘤抑制子 留一交叉验证(Leave One Out Cross Validation)(LOOCV)产生了92％灵敏性和61％特异性，示于表4中。ROC曲线产生0.897的AUC，如图1所示。
表6

表7

C.标记的手工选择 选择单独的基因的目的是，设计基于RT-PCR的测定。甲状腺癌和非癌组织之间基因表达概况的对比，已经从这322个基因中鉴别出了5-基因标记。在表8和16中示出了这5个基因的同一性，且在表9中显示了芯片数据。使用LDA，评估98个样品中该标记的性能，且该标记产生92％灵敏性和70％特异性，示于表10中。ROC曲线产生0.88的AUC，如图2所示。
表8.5-基因标记 SEQ ID NO基因名称 53 钙粘着蛋白3，1型(P钙粘着蛋白) 242纤连蛋白 73 分泌颗粒，神经内分泌蛋白1 36 睾丸蛋白聚糖-1 211甲状腺过氧化物酶(TPO) 表9


表10.98个训练样品中的5-基因标记性能
D.74个独立的甲状腺样品的交叉验证 处理74个独立的甲状腺样品，并用U133a芯片进行概况分析，且在表11中显示了这2个标记的芯片数据。使用LDA，评估4-基因和5-基因标记的性能。与98个训练样品相比，2个标记在这些样品中产生等同性能。2个标记的灵敏性和特异性示于表12中，且ROC曲线如图3a和3b所示。
表11


表12.74个验证样品中的4-基因和5-基因标记性能 4-基因标记
E.对照基因标记鉴别 使用98个甲状腺样品和12个PBL样品，我们选择2组基因作为取样对照。一组由在甲状腺中表达、但是不在PBL中表达的基因组成，第二组包括在PBL中表达、但是不在甲状腺中表达的基因。全基因列表和对应的芯片数据如表13a和13b所示。从这些基因中，我们选择6个丰富的基因，且甲状腺和PBL之间的差别相对较大。在74个独立的甲状腺样品中，验证它们的表达概况。在表14中列出了这6个基因的同一性，且它们的芯片数据示于表15a和15b中。
表13a 13a1 ThyMixBen_......_信号 SEQ 02014_40062_H 02014_40063_H 02014_40064_ 02014_40065_ 02014_40066_ 02014_40067_ ID 133A_800TT133A_801TTH133A_802TT H133A_804TT H133A_805TT H133A_806TT 2 2789.6 2676.23009.2 2957.5 3644.5 3 6346.1 794.7 623.9772 2977.3 622.7 5 845.5 3039.14452.6 2982.5 8283.2 1627.6 6 2730.4 1108.51155.6 2201.2 1954.3 1750 9 2248.9 12094.5 7529.2 2827.3 7701.7 1548.3 1210625.3 3137.2 2382.7 5727.8 6238 4685.1 183171 5947.9 13241.7 10294.9 7849.3 4037.4 222715.2 9522.5 6429.7 2590.9 5294.3 6490.4 2519159.3 1467.3 550.12838 11294.7 1374.2 28722.7835.1 727.1568.11336.7 740.7 324160.6 8115.2 4061.8 6625.3 7348.9 3964.1 39314.31243.1 1486.8 742.51027.7 1185.9 74323.91227.6 1965.1 1281.5 760.1505.4 78250.8677 1029.5 403.7795.2355 143 1337.3 1339.1 2607.9 1758.8 1933.5 1809 174 1263.1 4430.7 6041.6 3543.2 7346 3920.5 175 1996.3 1829.5 3632.7 1646.5 2847.5 3054.2 191 7108.4 848.3 2063 1133.9 1482.4 1149 212 258.21405.8 1196.9 882.41296.8 1790 222 20586.8 1371.2 2411.9 2573.9 1228.6 1342 233 1410.6 14126.8 3020.4 2186.1 8439.4 6024.4 234 5048.1 2183.3 3215.5 4103.9 4096.9 2220.2 237 905 3397.9 2525.1 2135.4 2822 2492.3 238 198 1937.7 1289.5 804.51538.6 1454.7 245 143.71598.5 1964.2 897.92276.6 1348.2 250 1300.9 777 1405.9 1466.4 1301.318 65.3 252 945.61547.3 1210.2 1357 1437.1 1141.1 264 455.1988.1 932.8631.71253.9 845.4 290 345.6327.2 533.1470.2700.5231.9 294 1043 3655.8 4435.4 3563.9 4377.4 2734.8 296 845.51242.5 1068.6 1506.5 2423.4 1527.3 342 771.4535.9 998.5922.51108.1 605.4 13a2信号 ThyMixBen_0201 02014_40198 SEQ 4_40068_H133A_ _H133A_871T 02014_40321_ 02014_40322_ 02014_40323_ 02014_40324_H ID 807TT T H133A_913TT H133A_914TT H133A_915TT 133A_917TT 2 1749.6 1571.1 2634.4 2419.2 2697.4 2901.1 3 377.2508 2322.7 259.811 23.4 875.2 5 2762.9 1795.8 6670.2 2094.7 11425.7 4957.2 6 1280.1 2033.3 1910.3 2543.7 2173.2 1358.7 9 3346.8 548.3 11398.5 953.42085.2 10684.4 126927.1 4060.5 6664.4 2730.5 4322.8 2616.2 187418.9 14860.4 3134.7 26576.3 9585.4 8588.9 221797.5 744.5 7334.3 317.95120.1 8611.7 251245.8 815.8 7201.1 253.72882.9 1053.4 28301.1640.8 1325.9 4092 762.7838.8 322992.4 3260.2 3588.1 792.55413.2 2581 39435.8958.1 1152.1 499.6556.9898.6 74689.21453.7 491.7736.6986.91217 78160.1383 151.2172.9597.4745.6 143 1338.8 1466.6 1069.9 2070.9 2377.2 1976.3 174 2464.3 1616.3 829.81365.2 4938 4804.3 175 1701 1511.5 1101.1 2325.4 2530.2 2237.6 191 763.62383.3 2013.2 1274.2 601.21100.2 212 481 1131.9 912.5663.2666.41081 222 280.815744944.1 342.21225.9 449 233 1289.5 1272.4 6285.6 866.8 1839.3 5797.4 234 1645.4 3271.1 2263.3 1789.3 6497.4 3416 237 1732.6 879.63780 1345.3 2154.2 2802.8 238 493.5 893.11098.7 405.9 592.81326.4 245 661.9 1378.3 1244.1 645.4 1124.2 1171.1 250 736.7 1305.6 6331409.4 1368.9 1146.7 252 1145.8 1986 1203.2 1323.5 1544.6 757 264 462.7 891.3629.4 649.7 872.11319.5 290 295.8 697.1987.8 819.9 440.6268.7 294 1909.1 1128.4 924.1 1519.2 3225.3 2954.9 296 898.4 1232.2 925.1 1290.3 738.11089.6 342 482.4 712.6476.1 694.8 801.2605.7 13a3 信号 ThyFolBen_0201 ThyFolBen_02014 ThyFolBen_02 ThyFolBen_020 SEQ 02014_40325_ 02014_40326_ 4_40079_H133A _40080_H133A_8 014_40081_H 14_40082_H13 ID H133A_918TT H133A_919TT _818TT 19TT133A_820TT 3A_821TT 2 3457.7 2769.1 4234.5 5589.2 3035.3 2681.6 3 920.5 1289.3 627690.9 585.4610 5 1805.2 5184.1 1487.2 19422663.8 1231.8 6 1560.8 1519.3 996.2 1140.3 2093.4 841.6 9 11354.89921.9 3894 2165.4 7467 7685.6 127531.7 6887.2 1379.1 1292.4 5085.1 3585.9 188220.1 5452.2 7762.8 7277.4 5374.9 2379.1 224750.8 5739.1 5655.3 7618.6 6227.9 1551.9 251557.9 3017.5 1200.4 881.1 1279.8 406.4 28886.6 1189.2 731.4 681.6 1225.7 473.9 924134.1 10964.4 927.6 3075.2 2775 608.8 391259.2 1022.1 1423.7 1632.9 899.5688.9 74741.8 948.9770674.6 1139.7 213 78447.9 488.2790.6 602.8 776.3332.1 143 3165.1 1865.5 2330.7 1160.7 1676 1672.4 174 607.5 2151.8 4026.2 4702.6 10677.1 3826.8 175 5358.5 2402.7 3765.6 1231.9 2531.9 2307.7 191 2685.9 1183.6 1661.4 1657.1 1377.8 368.2 212 1306.3 1072.1 2181.8 2035.6 954.21663.4 222 2332.8 431.21015.6 1651.7 3755.4 1669.9 233 5181.8 123773400.9 4679.3 2476 1506.6 234 3760.2 1988.2 3527.4 3971.4 4526.5 997.6 237 2712 3073.8 1930.6 3521.8 2951.3 2673.5 238 1552.2 1636.1 1333.5 837.6 1069.7 1860.5 245 1722.2 1981.5 1978.8 2170763.61392.9 250 1502.7 1094 1083.3 710.8 864.91823.2 252 1609.9 1679.3 1599.4 1463.9 1199.9 1019.2 264 860.1 835.61451.1 1315.6 1221.6 936.8 290 773.4 490.4218.3 507.2 648.3294.6 294 555.3 2490.7 1854.9 2997.4 7108.2 2160.7 296 1240.1 1863 1139.6 1245.4 1172.5 1318.3 342 738.7 509.31018.4 728.8 977.2710.6 13a4 　　信号 SEQ ThyFolBen_02014_40 fa__EA40173_V fa__EA40191_fa__EA40192 fa__EA40193 fa__EA40194 ID 083_H133A_822TTDX842TT VDX862TT_VDX863TT _VDX864TT _VDX865TT 2 3403.4 3423.52246.6 2723.3 4130.4 2828.3 3 644.4950.1 1313.2 344.4 1731.1 2576.9 5 3439.5 754.3 21193324.7 1663.9 4423 6 1373.7 987.7 834.7 1399.9 1115.4 1872.1 9 7457.5 2730.99307.8 7048.5 3775.7 6931.3 123978.9 9462.8777.5 4280.8 48212268.2 186386.9 1591.29546.6 4979.5 5005.2 4409.5 222652.5 7124.711054.7 4669.9 4776.9 5782.5 251887.7 470.8 703.9 714.5 445.9 698.2 28548.5562.4 596.8 915.9 1194.1 1041 324425.5 2120.31084.1 2638.9 2593.1 1919.9 391103.1 1110.2898.4 1375.1 1520.4 1744.1 74285.9895.8 532.1 841.2 1938.6 1109.5 78643.1346.6 533.3 680.5 621.5 385.8 143 1979.9 3302.91686.6 2406.6 2255.4 3419.1 174 5408.1 608.2 5072.8 5907.1 2956.1 2670.2 175 2650.3 6596.82600.8 4704.8 31235286.8 191 667.72665.71382.1 740.2 1133.3 3678.2 212 1357.8 2545.21590.2 1326.3 1135.1 1079 222 2239.9 471 548.8 584.1 899.4 1002.2 233 7318.7 11617.9 10868.4 6925.9 5416.9 14212.9 234 2395.9 2832.76005.3 2493.8 2128.8 6818.7 237 2275.3 2639.32406.6 2595.1 1857.2 2546.1 238 1181.8 2124.41586.7 2125.3 2039.5 1859.1 245 2082.5 2302.12846.4 2280.8 3973.8 1520.6 250 1684 1718 862.9 2782.6 1973.4 1594.3 252 1166.7 1579.6590.4 1623.2 1735.2 1584.3 264 654.21604.23062.9 1460.8 1510.1 2018.9 290 342 431.8 458.8 602.3 745 977.6 294 2978.3 651.5 3533.7 4065.9 2720.4 2292.8 296 2132.4 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2105.2 33.23401 2546.6 756.34893 1770.8 214212.6 165 1384.3 1540 636.7656.5 1213.9 21914.143.61692.6 1911.7 912 2112.21417.9 224137 228.2 2481.3 3104.2 1905.4 2292.42242.7 225109.6 153.4 2367.8 2860.8 1887.6 2052.62116.6 22641.611 797.2969.9617.1626.6 920 30920.730.65357.5 5904 3572.6 6641.93580.9 3326.8 60.2258.8304.2110.1255.3 363.3 34627 57.31584.2 1705.7 1507.5 1626.31587.1 13b17信号 SEQ IDpb6′pb7′pb8′pd10 pd11 pd12 pd9 83818.3333.4692.1709.8699.7926.2534.7 142 1287.9 565.22004.2 821.9904.81619.6 282.5 136 1039 962.21013.5 1147.9 840.9599.8284 137 1881.4 667.82058.1 2182.1 1678.9 1632.9 912.1 152 3657.7 2025 2993.5 11129.5 11824.2 11963.5 1607 160 1154.5 301.4473.21849.5 1424.7 660 242 163 628.56534.3 1863.4 148.7247.4230.24365.5 165 1485.2 889 1904.7 1404.2 1560.4 1123.6 1919.6 210 2729.4 595.15286.8 7026.5 3861.8 1028.8 1724.8 214 871.1442.3644.5936.1939.1852 347.7 219 1216.7 411.6959.71085.9 1974.4 1580.2 245.9 224 2039.1 1488.3 1844.2 2280.1 2823.4 1252.3 1246.6 225 2214.8 1494.6 2186 1961.1 2628.3 1184.1 1230.7 226 822.2437.3684.5540.5839.51062.8 273.7 309 3787.2 1401.5 3537 3522.1 4518.1 5118.1 931.7 332 218.7630.6462.4168.4220.4242.2322.8 346 1682.4 909 2317.6 1193.5 1748.9 2159 622.7 表14对照基因 血液的对照基因 SEQ ID NO基因名称 142骨髓基质细胞抗原1(BST1) 219白细胞免疫球蛋白-样受体-6b(LIR-6) 309桥接综合者2(BIN2) 甲状腺的对照基因 9 富含半胱氨酸的、生血管的诱导物，61(CYR61) 12含硒蛋白P，血浆，1(SEPP1) 18胰岛素-样生长因子-结合蛋白4(IGFBP4) 表15a SEQ ID BN_800TT BN_801TT 8N_802TT BN_804TT BN_805TTBN_806TT BN_807TT 142 28.3 7.915 28.4 26.925.8 14.2 219 21719.6 7.985.6 21.826.7 115.1 309 257.7 20.6 20.7 75.5 19.224 833.9 BN_871TT BN_913TT BN_914TT 8N_915TT FA_917TTFA_918TT FA_919TT 142 25.3 22.5 12.9 34.4 8.5 20.6 67.7 219 56.6 53.5 45.2 122.1 24.412441.3 309 37.9 37 28.2 53 10.232.6 24.2 FA_818TT FA_819TT FA_820TT FA_821TT FA_822TTFA_842TT FA_862TT 142 15 20.2 18.8 18.4 23 10 16.1 219 18.7 111.8 45.7 10.9 29.628.9 80.6 309 16.8 17.1 12.1 18.8 27.315.2 6.7 FA_863TT FA_864TT FA_865TT FA_866TT FA_867TTFA_869TT FA_907TT 142 22.4 14.5 54.8 17.1 15.815 21.9 219 7.615.9 20.9 25 10 16.5 23.4 309 15.2 9.462.6 20.2 18.415.9 10.2 Fa_EA40374 Fa_EA40376 FA_908TT FA_920TT FA_938TT FA_940TT FA_941TT_921TT _923TT 142 23.9 22.2 7.96.614.513.7 19.8 219 20.1 36.4 17.5 14.9 63.332.3 25.5 309 33.3 27.1 7.76.215.626.1 16 BN_EA40377 Fa_EA40378 Fa_EA40379 BN_EA40380 Fa_EA40387 Fa_EA40388 Fa_EA40389 _9 24TT _925TT _926TT _927TT_955TT _956TT _957TT 142 16.5 57.7 22.918.9 16.714.2 10.8 219 15.3 10.2 95.618.5 23.35129.1 309 17.8 31.8 32.649.2 18.711.4 26.7 Fa_EA40390_ Fa_EA40391 Fa_EA40392 Fa_EA40393_ 959TT _960TT _961TT 962TTPC_829TT PC_830TT PC_831TT 142 21.4 18.616.5 21.9 2634.7 22.4 219 25.7 67 20.8 21 36.8 136.4 64.9 309 44.2 20.634.1 35.2 88.8 136.6 48.8 PC_832TT PC_834TTPC_835TT PC_836TT PC_837TT PC_838TT PC_839TT 142 19.1 16.425.8 12.1 22.5 15.4 16.1 219 24.3 19.125.9 11.7 13.6 23.8 26.8 309 22.1 23.640.5 16.5 33.9 24.7 340.8 PC_879TT PC_881TTPC_882TT PC_883TT PC_884TT PC_885TT PC_886TT 142 21.2 23.57.6 21.5 30.6 26.4 22.6 219 30.4 13.378.6 34.3 34.8 131.8 12 309 33.7 32 22.8 29.8 45.9 89.7 47.4 PC_890TT PC_892TTPC_893TT PC_894TT PC_903TT PC_904TT PC_928TT 142 8.710.818.5 23.6 14.5 118.3 7.4 219 25.9 48.914.4 96.2 15.1 80.2 27.7 309 58.6 17.823.5 72.3 11.1 270.7 15.9 P c_EA40375 Pc_EA40381_Pc_EA40382 Pc_EA40383Pc_EA40384 PC_932TT PC_933TT_922TT945TT _946TT_947TT_948TT 142 8 13 1219.6 13.2 21.6 16.9 219 54.2 38.222.7 31.8 63.9 23.8 18.1 309 91.5 18.630.5 195 29.7 53.4 37.9 FC_823TT FC_824TTFC_825TT FC_827TT FC_828TT FC_840TT FC_896TT 142 19.8 12.535.7 17.7 19.6 18.9 20.5 219 24.8 64.882.1 14.1 60.2 16.2 46.2 309 15 33.338.4 14.9 19.5 17.2 40.2 FC_898TT FC_899TTFC_900TT FC_901TT FC_902TT FC_909TT FC_910TT 142246.2 18.5 20.7 25.828.6 17.8 9.9 21962.739.4 42.1 92.339.411 7.725.9 30944.343 20.2 21.363.8 745.6 9.7 Fc_EA40386_ Fc_EA40394 Fc_EA40395 Fc_EA40396_ Fc_EA40397 Fc_EA40405 Fc_EA40406 954TT _967TT _968TT969TT _970TT 982TT 983TT 14241.730.511.8 16.725.7 19.4 37.4 21943.242.12412.657.9 14.1 43.6 30953.642 23.5 14.671 20.7 30.6 pb1_Slgnal pb2_Slgnal pb3_Slgnal pb4_Slgnal pb5′_Slgnal pb6′_Signal pb7′_Slgnal 1421289.3 1088.9 659.7 732.6 1415 1287.9 565.2 2191692.6 1911.7 9122112.2 1417.9 1216.7 411.6 3095357.5 59043572.6 6641.9 3580.9 3787.2 1401.5 pb8′_Slgnal pd10_Slgnal pd11_Slgnal pd12_Slgnal pd9_Signal 1422004.2 821.9 904.8 1619.6 282.5 219959.71085.9 1974.4 1580.2 245.9 3093537 3522.1 4518.1 5118.1 931.7 表15b SEQ 信号 ID PC_984TT PC_986TT FA_987TT PC_988TT PC_989TT FA_992TT FA_993TT 142 25.1 125.8 18.5 11.4 13.7 11.8 113.6 219 17.5 25.7 22.6 11.3 32.4 61.9 25.2 309 27.6 661.8 15.7 47.4 29.8 33.2 28.4FA_994TT FA_995TT FA_996TT FA_998TT FA_999TT FA_1001TT FA_1002TT 142 20.6 25.2 34.1 21.8 31.4 12.7 74.6 219 25.9 36.3 41.5 24.9 16.4 26.5 25.5 309 16.8 26.3 19.4 22.5 14.6 32.3 47.7FA_1004TT FA_1005TT FA_1006TTFA_1010TTFA_1013TTFA_1014TTFA_1017TT 14224.7 20.1 67.7 14.9 48.9 29.8 26.9 219 27.5 11.7 53.3112.9 35.1 39.5 27.2 309 39.5 10.3 34.6 83.2 46.8 2025.7FA_1018TT FA_1020TT FA_1023TTFA_1024TTFA_1026TTFA_1027TTFA_1028TT 142 25.1 25.5 35.6 26.9 27.9 15.2 24.5 219 66.3 266.1 2659.3 18.8 31.7 309 3137.4 20.6 46.9 51.4 8.8 33.3FA_1029TT FA_1030TT FA_1031TT FA_1032TT FA_1034TT FA_1035TT FC_1037TT 142 10.6 142021.6 31.9 17.1 17.8 219 12.5 33.5 15.1 1568.5 25.6 63.5 309 20.7 1321.5 32.2 52.6 24.6 26.2 PC_1042T PC_1043TPC_1039TT PC_1040TT PC_1041TT T T PC_1044TT PC_1045TT 142 16.1 22.7 99.5 129.8 20.7 79.2 16.4 219 27.9 29.5 23.6 2921.5 19.8 38.4 309 585.3 37.6 48.7 4132.8 59.2 112.3 PC_1049T PC_1050TPC-PC_1046TT PC_1047TT PC_1048TT T T PC_1051TT FV_1052TT 142 22.4 81.2 24.7 37.5 25.9 26.6 26.4 219 11.1 97.5 61.8 14.9 14.7 109.1 30.6 309 22.5 207.8 35.4 6439.5 56.7 28.2 PC_1059T PC_1060TPC_1053TT PC_1054TT PC_1055TT T T PC_1061TT PC_1062TT 142 12.8 18.5 24.4 22.7 24.6 15.8 25.6 21912.6 19.6 10.224.5 82.6 53.7 20.7 30920.4 22.1 24 18.9 32.3 54.5 29.1 PC- PC-PC-PC-PC- PC-FV_1064TT PC-FV_1065TT FV_1066TT FV_1067TT FV_1068TT FV_1069TT FV_1071TT 14216.7 11.3 25.517.4 17.5 14 16.7 219174.4 20.3 132.4 24.8 12.3 14.8 18.8 30930.4 169.649.416.9 135.5 18.1 7.6 PC-FV_1072TT FA_1073TTFA_1074TTF A_1075TT FA_1076TT FC_1077TT FC_1078TT 1421425.5 22.727 16.4 15.8 38.9 2198.7 73.2 57 54.3 69.9 20 17.1 30929.9 145.421 53 24.3 9.132.9PC- FC_1082T FC_1079TT PC-FV_1080TT FV_1081TT pb1pb2pb3 14231.9 10.2 22 19.5 1289.3 1088.9 659.7 21940.1 17.4 38.388.1 1692.6 1911.7 912 30927.1 23.4 40.812.9 5357.5 5904 3572.6 pb4 pb5′pb6′ pb7′ pb8′ pd10 pd11 142732.6 1415 1287.9 565.2 2004.2 821.9 904.8 2192112.21417.9 1216.7 411.6 959.7 1085.9 1974.4 3096641.93580.9 3787.2 1401.5 3537 3522.1 4518.1 pd12 pd9 1421619.6282.5 2191580.2245.9 3095118.1931.7 F.对对照基因标准化的标记 作为基因芯片数据标准化算法，通过将这些基因对3个选择的甲状腺对照基因进行标准化，我们进一步检查了我们的5-基因和4-基因标记。3个甲状腺对照基因的平均荧光强度用于标记基因信号标准化。当标准化这2个标记时，轻微改进了2个标记的性能。在表16中列出了2个标记的灵敏性和特异性，且在图4a和4b中显示了ROC曲线。
表16.对对照基因标准化的4-基因和5-基因标记的性能 4-基因标记 肿瘤 良性 阳性 33 11 阴性 3 27 灵敏性92％(0.78，0.97) 特异性71％(0.55，0.83) 5-基因标记 肿瘤良性 阳性 33 8 阴性 3 30 灵敏性92％(0.78，0.97) 特异性79％(0.64，0.89) G.使用二轮扩增的探针的标记验证 为了测定FNA样品是否缺少在一轮扩增后提供足够用于杂交Affymetrix U133a基因芯片的探针材料的足够甲状腺细胞，我们使用在74个独立验证样品集合中的47个样品，进行靶RNA的二轮扩增。得到的数据表明，5-基因和4-基因标记的性能与一轮或二轮扩增相同。在图5a、5b、5c和5d中，显示了具有2个不同靶制剂的2个基因标记的ROC曲线。
实施例4 独立样品的交叉验证 A.83个独立的新鲜冷冻的甲状腺样品的交叉验证 处理了83个独立的甲状腺样品，并用U133a芯片进行概况分析。在表17中列出了每个种类的样品数。
表17.用于标记验证的新鲜冷冻的样品收集 样品类型样品数 滤泡性腺瘤 18 滤泡性甲状腺癌 1 乳头状癌，滤泡性变体18 乳头状甲状腺癌 11 腺瘤样结节 18 腺瘤样结节w/Hashimoto 1 多结节增生 16 使用与训练集合相同的截止值，用LDA评估4-基因标记和5-基因标记的性能。2个标记在这些样品中产生等价的性能，且它们与98个训练集合中的性能相当。在表18中显示了2个标记的灵敏性和特异性，且在图6a和6b中显示了ROC曲线。
表18. 83个验证样品中的4-基因和5-基因标记性能 4-基因标记 肿瘤良性 阳性 20 11 阴性 10 42 灵敏性 67％(0.49，0.81) 特异性 79％(0.67，0.88) 5-基因标记 肿瘤良性 阳性 24 24 阴性 6 29 灵敏性 80％(0.63，0.90) 特异性 55％(0.41，0.67) B.使用47细针抽吸(FNA)甲状腺样品的标记验证 处理了47个甲状腺FNA样品，并用U133a芯片进行概况分析。在表19中列出了每个种类的样品数。
表19.用于标记验证的FNA样品收集 样品类型 样品数 滤泡性腺瘤 10 滤泡性甲状腺癌 2 乳头状癌，滤泡性变体 3 乳头状甲状腺癌 13 腺瘤样结节 10 腺瘤样结节w/Hashimoto 1 多结节增生 8 用LDA模型评估了4-基因标记和5-基因标记的性能。2个标记在FNA样品中产生等价的性能，且它们与98个训练集合中的性能相当。在表20中显示了2个标记的灵敏性和特异性，且在图7a和7b中显示了ROC曲线。
表20.47个FNA样品中的4-基因和5-基因标记性能 4-基因标记 肿瘤良性 阳性15 4 阴性3 25 灵敏性 94％(0.74，0.99) 特异性 62％(0.44，0.77) 5-基因标记 肿瘤良性 阳性17 10 阴性1 19 灵敏性 94％(0.74，0.99 特异性 66％(0.47，0.80) C.28个配对的新鲜冷冻的和FNA甲状腺样品中的标记性能 在83个新鲜冷冻的和47个FNA样品收集中，存在来自相同患者的28个样品。我们的标记在这些配对样品中的直接对比，证实了标记将如何好地转化为最终的分子测定。用LDA模型评估了4-基因标记和5-基因标记的性能。2个标记在新鲜冷冻的和FNA样品中产生等价的性能。这些结果证实，我们的4-基因和5-基因标记可以在2个样品类型中表现得同样好，并证实使用新鲜冷冻的样品进行基因/标记鉴别的方法是有效的。在表21中显示了2个标记的灵敏性和特异性，且在图8a和8b中显示了ROC曲线。
表21.28个匹配的新鲜冷冻的和FNA样品中的4-基因和5-基因标记性能4-基因标记 新鲜冷冻的FNA
5-基因标记新鲜冷冻的FNA
实施例5 实时定量RT-PCR 样品采集 为了确定基因概况和/或对照的子集是否会产生足够的RT-PCR特异性和灵敏性，进行了下述实验。下述实验具有只需要一轮RNA扩增的优点。
在我们的研究中，分析了共107个甲状腺活组织检查26个滤泡性腺瘤、23个滤泡性癌、38个乳头状癌、5个正常、3个乳头状癌滤泡性变体、3个Hashimoto甲状腺炎、2个微滤泡性(microfollicular)腺瘤、1个弥漫性甲状腺肿、1个具有乳头状增生的甲状腺肿、1个Hurthle细胞腺瘤、1个具有乳头状结构的增生、1个多结节甲状腺肿、1个嗜酸瘤细胞增生、1个甲状腺炎。根据生产商的说明书，使用Trizol试剂，提取总RNA分离。使用Gene-Spec(Hitachi)分光光度计，通过260nm吸光度读数，测定RNA浓度。在-80℃在无RNA酶的水中保藏分离的RNA备用。
引物和探针设计 使用Oligo 6.0和甲状腺癌状态标记的Genebank序列，设计引物和水解探针(表22)。将这些引物和探针集合这样设计，从而引物的退火温度是62℃，探针更高5-10℃，且扩增子大小为100-150bp。通过在外显子-内含子剪接位点周围设计我们的引物，排除基因组DNA扩增。使用FAM作为报告染料，在5’核苷酸处标记水解探针，且使用TAMRA作为猝灭染料，在3’核苷酸处标记水解探针。

实时定量RT-PCR 使用TaqMan一步RT-PCR主混合物(2x)(Applied Biosystems)和ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，进行21个甲状腺癌状态基因和持家基因的基因特异性的实时定量RT-PCR扩增。在25μl一步反应中，将总RNA(10ng)加入含有下述物质的混合物中1x RT-PCR主混合物、0.25U/μl Multiscribe酶、0.6uM引物和0.25μM探针。循环参数是，48℃ 30分钟和95℃ 10分钟， 随后是95℃ 15秒和62℃ 1分钟的40个循环。通过测量每个循环退火阶段结束时的荧光信号，实现实时PCR监控。将达到荧光阈值的循环数定义为循环阈值(Ct值)。为了使样品中RNA的完整性引起的误差最小化，扩增作为内部参照的β-肌动蛋白mRNA。通过10-倍系列稀释已知甲状腺癌阳性的RNA，制备外部标准，并用于确保我们整个测定中的线性。将结果表达为平均Ct值，且排除具有大于1的标准差的样品。结果参见表23a、23b、23c、24a和24b。
数据表明，表23b所示的2个基因标记的灵敏性和特异性不如它所来源的4-基因标记。表24表明，PAX8基因在RT-PCR反应中用作甲状腺-特异性的组织的对照，在RT-PCR反应中是有效的。
尽管为了清楚理解的目的，已经借助于描述和实施例详细描述了前述发明，但所述描述和实施例不应当理解为限制本发明的范围。




























表25 序列鉴别
权利要求
1.诊断甲状腺癌的方法，其包含下述步骤
a.从患者获取生物样品；和
b.测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平
i.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
ii与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
iii.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
iv.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
2.区分甲状腺癌和良性甲状腺疾病的方法，其包含下述步骤
a.从患者获取样品；和
b.测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平
i.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
ii与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
iii.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
iv.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
3.测试不确定的甲状腺细针抽吸(FNA)甲状腺结节样品的方法，其包含下述步骤
a.从患者获取样品；和
b.测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平
i.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
ii与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
iii.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
iv.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着甲状腺癌。
4.确定甲状腺癌患者治疗规程的方法，其包含下述步骤
a.从甲状腺癌患者获取生物样品；和
b.测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平
i.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
ii.与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
iii.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
iv.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平足以预示癌症，以使医生能够确定治疗该疾病的推荐外科手术类型和/或疗法。
5.治疗甲状腺癌患者的方法，其包含下述步骤
a.从甲状腺癌患者获取生物样品；和
b.测量样品中选自编码下述mRNA的那些的基因的表达水平
i.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
ii与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
iii.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
iv.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中超过或低于预定截止水平的基因表达水平预示着癌症；且
c.如果他们是癌阳性的，则用甲状腺切除术治疗患者。
6.权利要求1-5中之一的方法，其中所述SEQ ID NO.是36、53、73、211和242。
7.权利要求1-5中之一的方法，其中所述SEQ ID NO.是199、207、255和354。
8.权利要求1-5中之一的方法，其中所述SEQ ID NO.是45、215、65、29、190、199、207、255和354。
9.权利要求1-5中之一的方法，其中通过选自下述的方法制备样品细针抽吸、大块组织制备和激光捕获显微解剖。
10.权利要求9的方法，其中所述大块组织制备从活组织检查或外科手术样品得到。
11.权利要求1-5中之一的方法，还包含，测量至少一个编码下述mRNA的基因的表达水平
a.与SEQ ID NO142、219和309相对应的；和/或
b.与SEQ ID NO9、12和18相对应的；或
c.被选自与表25所述的SEQ ID NO130、190和276相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
d.被选自与表25所述的SEQ ID NO9、12和18相对应的psids的探针集合特异性识别的。
12.权利要求1-5中之一的方法，还包含，测量至少一个在样品中组成型表达的基因的表达水平。
13.权利要求1-5中之一的方法，其中所述特异性是至少约40％。
14.权利要求1-5中之一的方法，其中所述特异性是至少约50％。
15.权利要求1-5中之一的方法，其中所述特异性是至少约60％。
16.权利要求1-5中之一的方法，其中所述灵敏性是至少至少约90％。
17.权利要求1-5中之一的方法，其中所述灵敏性是至少至少约92％。
18.权利要求1-5中之一的方法，其中用模式识别方法进行表达模式的对比。
19.权利要求18的方法，其中所述模式识别方法包括使用Cox比例危险分析。
20.权利要求1-5中之一的方法，其中所述预定截止水平是，相对于良性细胞或正常组织，样品中至少约1.5-倍的超表达或表达不足。
21.权利要求1-5中之一的方法，其中所述预定截止水平具有，相对于良性细胞或正常组织，在具有甲状腺癌细胞的样品中至少统计学上显著的p-值的超表达。
22.权利要求21的方法，其中所述p-值小于约0.05。
23.权利要求1-5中之一的方法，其中在微阵列或基因芯片上测量基因表达。
24.权利要求23的方法，其中所述微阵列是cDNA阵列或寡核苷酸阵列。
25.权利要求24的方法，其中所述微阵列或基因芯片还包含一种或多种内部对照试剂。
26.权利要求1-5中之一的方法，其中通过聚合酶链反应(PCR)对从样品提取的RNA进行核酸扩增，测定基因表达。
27.权利要求26的方法，其中所述PCR是反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
28.权利要求27的方法，其中所述RT-PCR还包含一种或多种内部对照试剂。
29.权利要求28的方法，其中所述内部对照试剂是检测PAX8基因表达的方法。
30.权利要求29的方法，其中使用SEQ ID NO409-411测量PAX8基因表达。
31.权利要求1-5中之一的方法，其中通过测量或检测该基因编码的蛋白，检测基因表达。
32.权利要求31的方法，其中通过对蛋白特异性的抗体，检测蛋白。
33.权利要求1-5中之一的方法，其中通过测量基因的特征，检测基因表达。
34.权利要求33的方法，其中所述测量的特征选自DNA扩增、甲基化、突变和等位基因变异。
35.交叉验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法，其包含下述步骤
a.从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；
b.使样品次序随机化；
c.留出来自约10％-50％样品的数据；
d.对剩余的样品，计算所有变量的目标因子，和选择满足p-值截止(p)的变量；
e.如下选择拟合预测模型的变量使用正向搜索，并评价训练误差，直到它命中预定误差率；
f.在留出的10-50％样品上，测试预测模型；
g.用取出的新样品集合，重复步骤c.-g.；和
h.继续步骤c)-g)，直到已经测试100％样本，并记录分类性能。
36.根据权利要求35的方法，其中在步骤h.中得到的基因表达数据由选自编码下述mRNA的那些的基因代表
a.与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的；或
b.被选自表25中与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的psids的探针集合特异性识别的。
37.独立验证甲状腺癌患者的基因表达概况的方法，其包含下述步骤
a.从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；
b.使基因表达数据中的来源变异性标准化；
c.计算以前选择的所有变量的目标因子；和
d.在样品上测试预测模型，并记录分类性能。
38.根据权利要求37的方法，其中在步骤d.中得到的基因表达数据由选自编码下述mRNA的那些的基因代表
a.与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的；或
b.被选自表25中与SEQ ID NO1、4、7、8、10-11、13-17、19-24、26-27、29-31、33-35、37-38、40-52、54-72、75-82、84-135、138-141、144-151、153-159、161-162、164、166-173、176-198、200-201、203-206、208-209、212-213、215-218、220-221、223、227-233、235-241、243-244、246-249、251、253-254、256-263、265-289、291-293、295-308、310-331、333-341、343-345、347-348、350-353和355-363相对应的psids的探针集合特异性识别的。
39.通过根据权利要求37或38的方法得到的基因概况。
40.产生后验概率评分以使得能够诊断甲状腺癌患者的方法，其包含下述步骤
a.从统计学上显著数目的患者生物样品，得到基因表达数据；
b.将线性判别分析应用于数据上，以得到选择的基因；
c.将加权表达水平应用于选择的具有判别函数因子的基因上，以得到可以用作后验概率评分的预测模型。
41.根据权利要求40的方法，其中使用下式进行所述线性判别分析
其中，
I(psid)＝括号内围住的探针集合的底为2的对数强度
d(CP)＝癌阳性类别的判别函数
d(CN)＝癌阴性类别的判别函数
P(CP)＝癌阳性类别的后验p-值
P(CN)＝癌阴性类别的后验p-值。
42.产生甲状腺癌预后患者报告的方法，其包含下述步骤
a.从患者得到生物样品；
b.测量样品的基因表达；
c.将复发危险评分应用于步骤b.的结果；和
d.使用在步骤c.得到的结果以产生报告。
43.权利要求42的方法，其中所述报告含有患者结果的评估和/或相对于患者群体的危险可能性。
44.通过根据权利要求42的方法产生的患者报告。
45.组合物，其含有选自下述的至少一个探针集合SEQ ID NO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354；或与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242；和/或SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids。
46.试剂盒，其用于进行确定生物样品中的甲状腺癌预后的测定，其含有用于检测选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料
a.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
b.与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
c.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
d.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述SEQ ID NO.是36、53、73、211和242。
48.权利要求46的试剂盒，其中所述SEQ ID NO.是199、207、255和354。
49.权利要求46的试剂盒，其中所述SEQ ID NO.是45、215、65、29、190、199、207、255和354。
50.权利要求46的试剂盒，还包含，用于进行微阵列分析的试剂。
51.权利要求46的试剂盒，还包含，在其中测定所述核酸序列、它们的互补体或其部分的介质。
52.用于评估甲状腺癌状态的物品，其含有用于检测选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分的材料
a.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
b.与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
c.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
d.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的。
53.权利要求52的物品，其中所述SEQ ID NO.是36、53、73、211和242。
54.权利要求52的物品，其中所述SEQ ID NO.是199、207、255和354。
55.权利要求52的物品，其中所述SEQ ID NO.是45、215、65、29、190、199、207、255和354。
56.权利要求52的物品，还包含，用于进行微阵列分析的试剂。
57.权利要求52的物品，还包含，在其中测定所述核酸序列、它们的互补体或其部分的介质。
58.用于进行权利要求1-5中之一的方法的微阵列或基因芯片。
59.权利要求58的微阵列，其包含选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分
a.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
b.与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
c.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
d.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中该组合足以表征甲状腺癌或在生物样品中复发的危险。
60.权利要求59的微阵列，其中所述测量或表征是至少约1.5-倍超表达或表达不足。
61.权利要求59的微阵列，其中所述测量提供统计学上显著的p-值超表达或表达不足。
62.权利要求59的微阵列，其中所述p-值小于约0.05。
63.权利要求59的微阵列，其包含cDNA阵列或寡核苷酸阵列。
64.权利要求59的微阵列，还包含或多种内部对照试剂。
65.诊断/预后包，其含有选自编码下述mRNA的那些的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补体或其部分
a.与SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的；和/或
b.与SEQ ID NO199、207、255和354相对应的；或
c.被选自与表25所述的SEQ ID NO36、53、73、211和242相对应的psids的探针集合特异性识别的；和/或
d.被选自与表25所述的SEQ ID NO199、207、255和354相对应的psids的探针集合特异性识别的；
其中该组合足以表征甲状腺癌状态或在生物样品中复发的危险。
66.权利要求65的包，其中所述测量或表征是至少约1.5-倍超表达或表达不足。
67.权利要求65的包，其中所述测量提供统计学上显著的p-值超表达或表达不足。
68.权利要求65的包，其中所述p-值小于约0.05。
全文摘要
本发明涉及用于下述的方法、组合物和物品诊断甲状腺癌，区分甲状腺癌和良性甲状腺疾病，测试甲状腺结节的不确定的甲状腺细针抽吸样品，和测定患者规程和结果。
文档编号G01N33/53GK101501214SQ200680026359
公开日2009年8月5日 申请日期2006年5月18日 优先权日2005年5月20日
发明者Y·蒋, J·W·巴库斯, A·马宗达, D·乔达里, F·杨, Y·王, T·亚特克 申请人:维里德克斯有限责任公司