用于在原代免疫细胞中表征糖皮质激素受体配体的反式激活和反式阻抑活性的方法

专利名称：：用于在原代免疫细胞中表征糖皮质激素受体配体的反式激活和反式阻抑活性的方法用于在原代免疫细胞中表征糖皮质激素受体配体的反式激活和反式阻抑活性的方法
技术领域：
：本发明涉及用于通过原代免疫细胞中的基因和/或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体(GR)配体的反式激活和反式阻抑活性的方法。在临床实践中最常用的药物包括糖皮质激素。它们对炎症和免疫系统以及对代谢具有重要作用。各种作用通过经糖皮质激素受体(GR)的不同机制介导。选择性糖皮质激素受体(GR)配体代表新一类GR配体，其选择性地激动或拮抗地影响基因调节的GR机制、基因的反式激活和反式阻抑。GR配体的反式激活活性与反式阻抑活性的分离或者GR配体的激动作用与拮抗作用的分离是可能的。在这方面，GR配体的治疗谱将会选择性地受到影响。为了就反式激活和反式阻抑活性而言体外表征GR配体，目前使用人和动物细胞系，在某些情况下它们是经启动子构建体转染的。在这些细胞系中研究GR作用的选择的个别方面。此外，为了检测GR配体的相应活性，常常需要刺激细胞。从细胞系中的这些测定的结果得出关于原代细胞中GR配体的作用以及特别是关于人系统的结论的可能性只是非常有限的。一方面，为了就分子机制而言在体内表征GR配体，使用功能测试。这方面的实例是当炎症被触发时施用GR配体或者在唤醒代谢性应激时或在施用代谢调节激素之后检测GR配体的作用。在人体研究中，这种方法与较多问题相关或者是不可行的。另一方面，在试验条件下，在提取的靶器官或器官样品中直接检测GR配体介导的基因调节。这种方法对于人体研究一般是不可能的。基于现有测定法的以上提及的、明显的局限，期望开发下述测定法，其l)对于表征原代细胞中的GR配体作用具有更大的相关性和2)可以被用于在人体研究中表征GR配体的分子机制而不产生明显应激。想法是确定原代免疫细胞中的反映GR配体在它们的调节中的反式激活和反式阻抑活性的基因。为此，在用选择性GR配体的筛选中选择基因，所述选择性GR配体在未受刺激的人外周血原代免疫细胞中具有确定的反式激活和反式阻抑活性，所述基因以快速、可重复和一致的方式反映该物质在抑制或诱导基因表达方面的反式激活或反式阻抑活性。在剂量/作用和动力学研究中进一步表征所述选择性GR配体对所选基因的调节。动物模型中的动力学研究证实在体内条件下基因调节的重复性。已经证实IL-1(3、IL-8、Rantes以及特别是TNF-a基因表达的抑制特别适用于在未受刺激的原代免疫细胞中检测GR配体的反式阻抑活性。已经证实谷氨酰胺合成酶和GILZ表达的诱导以及非常特别是CD163和FKBP51表达的诱导特别适用于检测反式激活活性。利用所述参数，可能表征选择性GR配体或标准糖皮质激素在体外和在体内施用后对GR的反式激活或反式阻抑活性的激动和拮抗效应。这些参数用于表征GR配体的分子机制的用途是新的。可以从使用未受刺激的原代免疫细胞中的基因和/或蛋白质表达分析来检测GR配体的分子机制预期以下优点1)原代免疫细胞是与GR配体在生物中的活性有很大相关性的非人工细胞系统。2)检测未受刺激的原代免疫细胞中的参数避免可能歪曲参数和不能反映生物中状况的刺激的必要性。3)研究证实所述原代免疫细胞中的参数以快速、剂量依赖性、可重复和一致的方式反映在体外添加后和在体内给药后GR配体的分子机制。4)在未受刺激的原代人免疫细胞上获得的体外结果和在GR配体体内给药后的动物试验研究中获得的结果之间非常好的一致使得非常有可能将确定的参数应用于人体体内研究。5)未受刺激的原代免疫细胞中参数的可检测性也允许直接测定用GR配体处理的生物的血样中的参数。因此，容易得到用于体内研究的研究材料。6)可以在用GR配体处理的生物的血样中测定所述参数，而不引起取血方面的额外应激。用于给药相应的GR配体和用于取血的额外干预不是必需的。用于研究的绝对必需的血液体积少于1毫升。7)可以在全血测定法中检测所述参数，因此不发生例如细胞分离造成的结果损害。在这方面，可以得到可商购的检测系统。8)所述未受刺激的原代免疫细胞中参数的检测可以被用于试验性的体外和体内研究以及用于I期和临床研究。在这方面，在GR配体的发现、开发和临床使用中，GR配体分子机制的参数一致是可能的。9)所述参数适用于在人体研究中作为用于表征GR配体的体内分子机制的生物标记物。10)被选择的反式阻抑参数(抑制IL-1|3、IL-8、Rantes以及特别是TNF-oc炎症介质的表达)还允许表征GR配体的抗炎和免疫调节作用。11)因为反式激活和反式阻抑活性决定性地决定GR配体在生物中的作用，因此表征外周血的未受刺激的原代免疫细胞中确定的基因和/或蛋白质表达参数可以帮助甚至在早期研究以及甚至在健康人(例如I期研究)中获得体内分子机制的信息，从而获得期望的GR配体的作用/副作用谱。本专利中的原代免疫细胞均为活生物的免疫细胞。具体地指血液、骨髓和淋巴器官(例如胸腺、脾、淋巴结、派伊尔淋巴集结(Peyer，splaque))中的免疫细胞。血液中的免疫细胞是非常特别优选的。方法原理本发明描述了通过分析原代免疫细胞中GR敏感基因的基因和蛋白质表达表征糖皮质激素受体(GR)配体(标准糖皮质激素和选择性GR配体)的分子机制。选择性GR配体代表新一类GR配体，其不同程度地采用基因表达的GR介导的调节、敏感基因的反式激活或反式阻抑两种机制。它们可以是相应机制的激动剂、部分激动剂、部分拮抗剂和拮抗剂。对应于GR介导的抗炎、免疫抑制和代谢作用，选择性GR配体的适应症可以是例如炎性疾病或具有改变的代谢活性的病症。对于这样的新GR配体的发现、成功开发和临床使用而言，基本要求是表征其在相关体外和体内试验以及在I期和人体临床研究中的分子机制。在试验性体外或体内研究以及在I期和人体临床研究中，所述方法的目的是通过未受刺激的免疫细胞、淋巴器官和血液中基因和/或蛋白质表达或蛋白质释放的改变表征选择性GR配体和标准糖皮质激素的反式阻抑和反式激活活性。为此，在从50多个基因的筛选中选择参数，并进行更为详细的分析。基本选择标准是l)基因调节与选择性GR配体的反式阻抑或反式激活活性之间的相关性，2)在未受刺激的原代免疫细胞中的一致基因调节，和3)在体外测定中的快速反应以及在体内给药GR配体后良好和持久的可检测性。这些标准对于所述参数用作生物标记物是基本的。在体外检测和离体检测中，已经证实促炎IL-lf3、IL-8、Rantes以及特别是TNF-oc细胞因子的抑制都特别适用于表征反式阻抑活性，且已经证实谷氨酰胺合成酶和GILZ的诱导以及非常特别是CD163和FKBP51的诱导特别适用于反式激活活性。其他合适的参数是用于检测反式阻抑的共辅助分子(co-accessoiymolecules)(HLA-DR、CD86)的表达和用于检测反式激活活性的细胞因子受体(IFN画yRl、TNF-R1、IL-1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR)及其他基因(P2-肾上腺素受体、血红素加氧酶1(hemoxygenase1)、IL-2、MIF、膜联蛋白1、血小板反应蛋白l)的表达。可以通过用于mRNA检测的方法(例如定量实时PCR)和/或用于蛋白质检测的方法(例如连续流式细胞术、免疫测定法、蛋白质印迹)在原代免疫细胞中进行对所述参数的表达调节的检测。可以在培养物上清液、血清、血浆和其他生物液体中检测所分泌的蛋白。所述检测方法对于本领域技术人员是已知的，此外，它们在技术文献中有充分描述，因此它们的实施是可能的。下面基于对标准糖皮质激素泼尼松龙以及ScheringAG的两种选择性GR激动剂(SEGRA)的表征阐述所述方法的适用性。所述物质在用于GR的激动或拮抗反式激活和反式阻抑活性的常用测定法中的不同机制与所选基因在原代人免疫细胞及物质处理过的小鼠脾细胞的体外测定法中的表达调节相关。用于GR配体介导的基因和/或蛋白质表达调节的测定法可以被用于检测物质对GR的反式激活或反式阻抑机制的竞争性或非竞争性激动和拮抗活性。对于后者，研究了对另一种加入的GR配体的作用的拮抗。在体内试验中，还可以表征对内源性糖皮质激素作用的拮抗。所示的方法适用于表征GR配体在体外和体内试验中以及在I期和人体临床研究的生物标记物测定法中的分子机制。1.内源性糖皮质激素的调节和作用1.1内源性糖皮质^[素的调节健康成人的肾上腺每天产生40-80pmol(15-30mg;8-10mg/n^)的内源性可的松。血浆浓度由游离皮质醇的分泌、灭活速率和形成决定，并且显示清晰的昼夜节律曲线。通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴调节肾上腺可的松生成来控制该昼夜节律周期、与自律神经系统和与生理及情绪应激的相互作用以及与低血糖和全身炎症的反应。由上述刺激触发的下丘脑"促肾上腺皮质素释放激素"(CRH)诱导垂体产生"促肾上腺皮质激素"(ACTH)，其通过刺激肾上腺皮质来增加可的松合成。在负反馈调节的框架内，全身增加的糖皮质激素水平抑制CRH合成和ACTH释放。机体中内源性和医源性糖皮质激素的生物学效应不仅依赖于可的松血浆水平。它们另外受酶系统11P-羟基类固醇脱氢酶(11(3-HSD)的两种同工型的调节。11(3-HSDI催化无生物学活性的可的松转化成活性皮质醇。相反，lip-HSDII支持活性皮质醇转化成无活性的可的松。该系统主要位于肝，但是也位于其他组织如脂肪组织(Tomlinson,J.W.;iev.2004,25:831)。1.2.糖皮质激素经GR的作用机制糖皮质激素的作用经糖皮质激素受体(GR)介导/传递。GR属于核心受体蛋白质家族，所述核心受体在与作为转录因子的它们的相应配体结合之后被活化，并对特定耙基因的表达有影响。所述配体与存在于所述细胞的细胞浆中的GR结合诱导受体构象的变化，其进而导致现在结合了配体的GR易位到细胞核内。在那里，活化GR能够对所述耙基因的表达产生正面或负面影响。在基因表达的正调节(反式激活)中，所述GR作为同二聚体与敏感基因启动子中的特定序列(糖皮质激素应答元件，GRE)结合。体外和体内突变分析表明GR的二聚是反式激活的必要条件(Reichardt，H.M.，Ce//.1998,93:531;Heck,S.,五細OJ1994,13:4087)。但是，根据最近的认识，必须要限制性地指出，许多但是并非所有GR诱导的反式激活过程都依赖于所述受体的二聚(RogatskyI,尸^4S2003,100:13845)。被配体活化的GR也能够抑制特定靶基因的表达(反式阻抑)。负调节的最常见机制是通过活化GR作为单体与已经结合于DNA的其他转录因子结合来进行。通过这种结合，所述其他转录因子的活性受到抑制，并因此也抑制耙基因的表达。在基因表达的负调节的另一机制中，进行活化GR与所谓的负GRE的结合，所述负GRE可见于几个基因的启动子中。在这方面，通过GR的结合，导致对其他转录因子的替换，所述其他转录因子是诱导所述基因表达必不可少的。因此，所述GR与所述nGRE的结合阻止相应靶基因的转录。另外，GR能够以抑制方式抓住特定信号传递途径中的MAP激酶，并通过这种方式介导其效应。1.3重要的GK作用和机制糖皮质激素控制许多生理过程，如葡萄糖平衡的调节、蛋白质和脂肪代谢。在许多这些生理过程中，糖皮质激素通过对所涉及的蛋白质/酶的表达施加影响而发挥作用(Wang,M.，M/化Meto6.(Zo"力.2005,2:3)。糖皮质激素增加肝特异性磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及葡萄糖-6-磷酸酶表达的程度。也诱导葡萄糖转运蛋白GLUT4的表达。(Imai，E.，Mo/.Ce〃.5/。/.19卯，10:4712;Schmoll，D.，1996,383:63;Lin，B.，DA^Ce〃Sz'o/.1998,17:967;Grosfeld，A.,D/W"o/ogz'a2002,45:527)。通过糖皮质激素增强的例如酪氨酸氨基转移酶(TAT)(Becker等人，1986;Jantzen等人，1987)、谷氨酰胺合成酶或色氨酸加氧酶(Becker，P.B.,A/<^we1986,324:686;Schmid,E.,/说oc/ie附.1987,165:499;Danesch,U.,五MBOJ:1987,6:625;Gaunitz，F.,Commw".2002,296:1026)的表达导致氨基酸代谢增加，其保证生物在饥饿状况下的能量供应。糖皮质激素对脂肪平衡的干预也通过调节一些参与所述脂肪平衡的蛋白质/酶的表达来进行。因此，表明激素敏感脂肪酶HSL和脂蛋白脂肪酶LPL受糖皮质激素高度调控(Zilberfarb，V.，Z)/a6eto/og/a.2001,44:377)。参与能量或脂肪代谢的蛋白质勒帕茄碱(leptine沐VLDLR("极低密度脂蛋白受体")也是如此(Slieker,L.J.，J!S/o/.CAew.1996，271,5301;Ensler，K.，Jcto.2002,1581:36)。拔炎糊疫鄉鄉糖皮质激素通过参与炎症信号传递途径实现抗炎和免疫调节活性。这通过抑制适应性或先天免疫系统的细胞的活性或者通过直接阻断促炎的、细胞因子控制的信号传递途径而发生。反式阻抑已经被描述为糖皮质激素的抗炎和免疫抑制活性的主要机制。通过抑制几种转录因子愤别是NF-KB和AP-1)的活性，减少了许多促炎细胞因子(例如TNF-a、GMCSF、IL-l卩、IL-2、IL-3、IL-12)、趋化因子(例如IL-8、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、MIP)、酶(iNOS、COX-2)和/或粘附分子(ICAM-l、VCAM-1)的生成(Barnes,P.J.,C//".5W.(Io"力.1998，94:557;Almawi,W.Y.,JMo/.編ocW"o/.2002,28:69)。但是，抗炎蛋白(脂皮质蛋白-l、血清白细胞蛋白酶抑制剂、神经内肽酶、MKP-l)的诱导也参与糖皮质激素的抗炎作用(Bames,P.J.,C//".(ZowZ.人1998,94:557;Kassel,O.,2001,20:7108)。其他非基因组效应如阻断MAP激酶信号途径也参与糖皮质激素的抗炎和免疫抑制作用。1.4糖皮质激素的副作用糖皮质激素的上述生理作用及抗炎和/或免疫抑制作用可导致存在的糖皮质激素长期过量(例如在内源性皮质醇增多症或治疗性糖皮质激素给药的情况下)，也可导致多种不期望的效应，如诱导高血糖症成为触发糖尿病、诱导高血压、肌萎缩和/或肌病、躯干性肥胖、骨质疏松等。参与葡萄糖和脂肪平衡的特殊效应很大一部分受糖皮质激素诱导的反式激活过程调节。除了上述酶之外，糖皮质激素给药还诱导参与蛋白质分解代谢的其他酶，例如谷氨酸脱氢酶、谷氨酸-oxalazetate-氨基转移酶和丝氨酸脱水酶(Timmerman,M.,jExp.5/o/.Med^Afo"oo力2003，228:100;Barouki,R.,丄5/oc/zem.1989,186:79;Su，Y.，jrc/i5/oc/ie附.5/o/A".1992,297:239)。持久受高度调节的糖异生可导致高糖血症、胰岛素抵抗并作为结果导致糖尿病。如上所述，糖皮质激素诱导肝脏中糖异生的关键酶。长期糖皮质激素治疗或内源性皮质醇增多症所引起的持久免疫抑制可导致感染危险增加。其所涉及的机制基本上是造成治疗作用(抗炎和/或免疫抑制)的机制。但是，除了抑制许多促炎蛋白质的表达之外，GR还通过直接诱导病毒启动子而与感染危险增加有关。2选择性GR配体及其应用的适应症2.1选择性GR配体选择性GR配体(例如选择性GR激动剂-SEGRA、选择性GR调节剂-SGRM、分离或分化的GR配体)代表新一类GR配体，其不同程度地操纵调节基因表达、敏感基因的反式激活或反式阻抑的两种机制(Schaecke,H.,尸7V^S2004,101:227&O^r.Op/",/we幼'g.Dn/gs.2004,5:524)。在这方面，与内源性糖皮质激素和/或治疗性标准糖皮质激素相比，在反式激活或反式阻抑方面相当的、增加的、降低的和消除的作用以及它们的不同组合是可能的。它们可以是相应机制的激动剂、部分激动剂、部分拮抗剂和拮抗剂。虽然激动作用由GR配体对敏感基因和/或启动子构建体的表达的直接作用确定，但拮抗作用由对其他配体对GR的效应的抑制表征。下面在对来自ScheringAG的WO00/32584化合物1和WO02/10143化合物2的两个选择性GR激动剂(SEGRA)的分子机制的表征中给出关于这方面的相应样品测定法。对于反式激活，GR的激动配体通过其某种形式的结合活化受体，所述形式使得所述受体能够通过与敏感基因的启动子区中的GRE结合而诱导其转录。另外，存在通过与GR结合引起受体的拮抗构象的配体，它们不导致敏感基因的启动子活性的诱导。这样的配体被称为拮抗剂。另一组配体可以被称为部分激动剂或部分拮抗剂。后者只诱导部分激动或拮抗GR活性。GR配体的拮抗或部分激动活性基于细胞背景和调节敏感基因表达的启动子结构。对于反式阻抑，GR的激动配体通过其某种形式的结合活化所述受体，所述形式使得被配体活化的受体能够抑制特定靶基因的表达。这可以通过与其他转录因子的相互作用并最终抑制所述其他转录因子的作用或者通过与负GRE结合来进行。反式阻抑的部分激动剂、部分拮抗剂和拮抗剂只部分介导这种GR作用和/或抑制其他GR配体的反式阻抑激动作用。2.2用诜择件GR配体治疗的示例适应症一方面，用选择性GR配体的治疗的适应症是标准糖皮质激素所适用的任何适应症。这里，分离的对GR的作用可诱导就以下方面而言所述选择性GR配体的优点，即诱导与标准糖皮质激素相比减少的不期望的作用，即改善作用/副作用谱。另一方面，选择性GR配体可被用于拮抗现有GR配体的副作用。另外，选择性GR配体对内源性糖皮质激素的不适作用的选择性取代是可能的，而不出现对GR的不期望效应的副作用。这些治疗原理也可以组合存在。下面给出了示例应用。抗炎和免疫抑制治疗糖皮质激素属于最常使用的抗炎和免疫抑制药物(Franchimont,D.,^7"iVTv4a^Sc/.2004,1024:124)。但是，在一些情况中，它们的使用受到严重和不可逆的副作用的限制。己经证明GR的反式阻抑活性对于GR配体的抗炎和免疫抑制作用而言是必要的，而重要的副作用(例如诱导糖异生)由反式激活介导(Schaecke，H.，尸/^/tw"co/.77zer2002，96:23)。在所获得的反式阻抑活性方面具有降低的反式激活活性的选择性GR配体可以生产有效的抗炎和免疫抑制药物，所述药物诱导的副作用与标准糖皮质激素相比减少，且基本上由反式激活机制介导。内源性皮质醇增多症的治疗在一些情况中，讨论了组织特异性的、增加的内源性糖皮质激素活性对多种疾病和综合征(例如糖尿病、躯干性肥胖、代谢综合征、张力过高、动脉粥样硬化)而言的病理生理重要性。这些综合征的特点是内源性糖皮质激素的代谢作用增加(即高糖血症、高脂血症)以及它们的不利后果。此外，慢性炎症(低水平炎症)常常可见(UJ.J.，il/e^ca/Z^pc^^es2005,64:236;Wang,M.，胸r.Meto6.(Zo碎2005,2:3;Dandona，P.，C/簡/加'o",2005，111:1448)。但是，基于所预期的不期望的代谢效应的增加，用现在批准的标准糖皮质激素治疗并不适用。具有(部分)反式激活拮抗作用的选择性GR配体可以通过不同机制减少内源性糖皮质激素的不利代谢作用。它们包括通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴来抑制内源性糖皮质激素合成和竞争性和/或非竞争性地拮抗内源性糖皮质激素在GR中的代谢作用。此外，所述选择性GR配体的反式阻抑激动可以控制所述慢性炎症。代谢作用缺乏的病症的治疗在各种非常严重的疾病中，期望糖皮质激素的额外的代谢作用。它们包括恶病质例如肿瘤、心血管病或HIV感染中的恶病质。这些病症的特点也是免疫抑制，但是其通过用标准糖皮质激素治疗会得到增强(Mulligan,K.，Ca,叔2002，85，151;Tijerina,A.J.,CW/C7V脆2004，23:237)。具有显著反式激活激动作用和具有反式阻抑(部分)拮抗的选择性GR配体可以诱导期望的GR代谢作用，而不损害生物的防御状况。甚至可以想像通过内源性糖皮质激素的反式阻抑作用的拮抗提高感染防御。3在原代免疫细胞中表征选择性GR配体的分子机制3.1图示以上实例证明具有不同的反式激活/反式阻抑谱的选择性GR配体可以被用于多种适应症。对于这样的新的GR配体的发现、成功开发和临床使用而言重要的必要条件是在相关体外和体内试验及I期和人体临床研究中表征它们的分子机制。外周血的有核细胞(即外周血白细胞)及来源于其的蛋白质特别适用于监测由选择性GR配体和标准糖皮质激素的反式激活和反式阻抑介导的基因调节。与用于表征GR配体的分子机制的其他测定法相比，显著的优点是l)使用未受刺激的原代细胞，其与糖皮质激素的体内作用具有相关性，以及2)作为人体^F究中的生物标记物的简单适用性(在血液中检测，而不用侵入性干预例如活组织检查或其他额外的应激)。可以通过mRNA检测例如通过RT-PCR或其他扩增方法或者通过用于直接mRNA检测的方法进行原代免疫细胞中基因调节的直接检测。对于蛋白质检测，可以使用例如连续流式细胞术、免疫测定法或蛋白质印迹法。可以在细胞上或细胞内、细胞溶解产物中或细胞培养物的上清液中或者在血浆、血清或其他生物液体中进行蛋白质检测。该方法学的目的是基于原代免疫细胞中基因和/或蛋白质表达的调节表征GR配体的分子机制，并因此获得关于以等效剂量使用的该物质的可能作用谱的适应症。为了确定合适的参数，用广泛筛选方法检査了原代人免疫细胞中50多种基因的标准糖皮质激素和选择性GR配体介导的调节。在体外和体内动力学试验中进一步表征了所选基因。偏离文献工作(literaryworks)的条件在某些情况中导致相反的结果。参数选择的决定性标准是l)一致性地反映GR配体的反式激活或反式阻抑性质，2)检测未受刺激的免疫细胞中的调节，和3)体外测定法中基因表达的快速反应(筛选所用的时间是4小时)，和在体内施用GR配体后的良好及持久的可检测性。这些性质使得可能发生GR配体对基因表达的直接调节以及所述参数可用于体内研究中(例如作为生物标记物)。为了与标准GK进行比较，这些参数的受GR配体影响的基因表达被归一化成用标准GK泼尼松龙处理后的基因表达。泼尼松龙是标准GK，与泼尼松龙相比，SEGRA物质将表现出增加的分离，泼尼松龙在用SEGRA开发候选物的临床研究的情况中作为比较物质。本领域技术人员清楚，理论上也可以将该归一化与任何其他糖皮质激素相关。对于基因抑制而言，为了进行归一化，导出"泼尼松龙/GR配体"商，即，较低值(〈)表示GR配体相对较弱的抑制(剩余基因表达的值较高)。对于基因诱导而言，为了进行归一化，导出"GR配体/泼尼松龙"商，艮卩，<1的值表示GR配体的相对较弱的诱导。^一众力渡微教潘辦淑式激柳叙巡微微斜/附扁叙相对泼尼松龙的反式激活CD163FKBP51相对泼尼松龙的反式阻抑IL-lpTNF曙a泼尼松龙1小时泼尼松龙2小时泼尼松龙4小时泼尼松龙12小时泼尼松龙24小时1.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.001.00地塞米松1小时泼尼松龙2小时泼尼松龙4小时泼尼松龙12小时泼尼松龙24小时1.020.891.891.131.341.081.131.071.041.050.610.800.690.851.271.010.961.001,160.97ZK2385871小时ZK2385872小时ZK2385874小时ZK23858712小时ZK23858724小时0.840.990.520.930.490.790.480.740.490.821.160.990.870.861.280.890.971.060.730.79ZK2431851小时ZK2431852小时ZK2431854小时ZK24318512小时ZK24318524小时0.930.770.330.190.040.260.070.260.060.331.170.760.510.591.250.730.450.670.850.52目的是通过概括地反映对不同的反式阻抑和反式激活参数的表达的不同影响的值来表征物质的分离的程度。为了表征SEGRA测试物质的分离的作用，因此基于所选基因的诱导或抑制确定分离因子，其显示反式激活和反式阻抑活性的分离。下面，根据以下公式导出来自泼尼松龙归一化值的反式阻抑和反式激活参数之间的比值16公式l:~~<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在该公式中TR代表经归一化的反式阻抑参数(TR拨尼松龙=1)TA代表经归一化的反式激活参数(TA拨尼松龙-l)^代表M的m次方根例如^7=3^'代表所有Tx值的乘积，其中指数x等于l到t例如^该比值因此是n个不同泼尼松龙归一化的反式阻抑参数的乘积的n次方根除以m个不同泼尼松龙归一化的反式激活参数的乘积的m次方根。作为反式阻抑参数，所有已知的参数都适用，包括共辅助分子(HLA-DR、CD86)的表达。特别适用的参数是IL-lj3、IL-8、Rantes。TNF-a是特别优选的。作为反式激活参数，所有已知的参数都适用，包括细胞因子受体(IFN-yRl、TNF-R1、IL画1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR)和其他基因(P2肾上腺受体、血红素加氧酶1、IL-2、MIF、膜联蛋白1、血小板反应蛋白l)的表达。特别适用的参数是谷氨酰胺合成酶和GILZ的表达，而非常特别适用的是CD163和FKBP51的表达。可以从这些反式阻抑和反式激活参数中选择任一个，并可以根据上述公式将其用于确定公式I的比值。TNF-a和IL-1J3被优选地用于测定反式阻抑。CD163和FKBP51被优选地用于测定反式激活。根据该优选的参数组合，在将单个参数归一化之后，根据以下公式2导出反式阻抑参数和反式激活参数之间的比值公式2:比值=^/C濕3;c本领域技术人员清楚，上述公式1或2的比值理论上也可以自导出值(例如IC5o或EDs。)导出。从数学关系看，本领域技术人员清楚，在反式激活和反式阻抑值的差别较大的这样的变更的计算方法的情况下，该比值将任选地小于l。试验部分通过定量实时RT-PCR或者通过连续流式细胞术获得下面试验部分中所获得的基因或蛋白质表达的结果，并将其作为平均值土标准差绘图。为了mRNA检测，从相应样品(人PBMC或人全血或小鼠脾细胞)分离总RNA，将所述mRNA转录入cDNA并通过实时TaqMan-PCR(AppliedBiosystems)进行扩增及检测。与"管家"基因HPRT的表达相比进行相对定量。在每种情况中，绘制GR配体的结果与载体对照的结果的比值。用来自相应受体蛋白的可商购的荧光素标记单克隆抗体进行人免疫细胞中受体表达的连续流式细胞术检测。所述标记在全血中进行。在溶解红细胞之后，通过FACScalibur连续流式细胞仪(BectonDickinson)进行所述连续流式细胞术分析。绘制平均荧光活性。所测试的示例化合物是来自WO00/32584的化合物1(ZK238587)和来自WO03/082827的化合物2(ZK243185)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>3.2作为反式阻抑活性参数的基因/蛋白质抑制已知标准糖皮质激素对免疫细胞中多种基因的表达的抑制(Gakm,J.,i^4犯5,/2002,16:61;Hayashi，R,，五w.泡麵co/.2004,500:51)。在我们关于未受刺激的原代免疫细胞的研究中，已证实在炎症和特定免疫应答中发挥作用的基因/蛋白质适用作反式阻抑活性的指示物。此外，这些参数具有以下优点它们的抑制反映GR配体的抗炎和免疫抑制效应。下面的图显示了通过定量实时PCR检测的未受刺激的人外周单核血细胞(PBMC)的4小时培养物中标准糖皮质激素泼尼松龙对炎症细胞因子(TNF-a、IL-lj3、IL-8、Rantes)和共刺激分子CD86的基因调节。泼尼松龙(1e-7moI/L)对人PBMG的4小时培养物中基因表达的效应(n=6)TNFaIL'1ftIL-8RantesCD86吗、，二教0,20,024小时后在小鼠脾细胞中研究泼尼松龙对标准糖皮质激素抑制基因(TNF-oc、IL-ip、Rantes)表达的体内作用。己经证实IL-ip、IL-8(只在人系统中可获得)、Rantes的mRNA表达以及特别是TNF-a的mRNA表达特别适用于体外和离体检测原代未受刺激的免疫细胞中GR配体的反式阻抑活性。反映GR配体的抗炎和免疫抑制作用的自主蛋白质表达减少的样品参数是通过全血测定法中连续流式细胞术测定的单核细胞上的II型MHC(HLA-DR)表达。单核细胞上的HLA—DR表达全血培养物中的泼尼松龙效应■载体曰1e-6mol/L施用后24小时泼尼松龙(30mg/kg)对小鼠脾细胞中基因表达的效应(n-5)TNF-aIL.1B幽TES2000-15001000-500-0-4h24h鹏^来核贫I113.3作为反式激活活性参数的基因和/或蛋白质诱导免疫细胞中标准糖皮质激素对基因的诱导是己知的(Galon,J.,W犯AJ2002,16:61)。对于下面在我们的筛选中鉴定的基因，我们可以检测未受刺激的免疫细胞中的诱导与选择性GR配体的反式激活性质之间的相关性细胞因子受体(例如TNF-R1、IFN-yRl、IL-1R1、IL匿2Rot、IL-13Ra、GITR、CXCR4)、CD163、FKBP51、膜联蛋白1、IL-2、卩2-肾上腺素受体、MIF、GILZ、血红素加氧酶1、凝血酶敏感蛋白1(thrombospondinl)和谷氨酰胺合成酶。在一些情况中，这些蛋白质主要参与GR配体的抗炎和代谢作用以及参与GR作用的调节。在一些情况下，获得与文献结果相反的结果，例如，观察到IL-1RA表达的阻抑而不是诱导(未显示)。证实CD163、FKBP51、GILZ和谷氨酰胺合成酶的基因和/或蛋白质表达特别适用于体外和离体检测GR配体的反式激活活性。该图显示了在人PBMC的4小时培养物中泼尼松龙对基因的诱导。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>下面的所选GR配体的反式阻抑活性参数和反式激活活性参数的图显示泼尼松龙对基因表达的效应的剂量依赖性(泼尼松龙对人PBMC的4小时培养物中基因表达的剂量依赖性效应(n=6)<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>在经泼尼松龙处理的小鼠的脾细胞中检测泼尼松龙对所选基因的表达的体内诱导。施用后24小时泼尼松龙(30mg/kg)对小鼠脾细胞中基因表达的效应(n-5)<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>下面，绘制了通过连续流式细胞术检测的泼尼松龙对人全血培养物中总之，免疫细胞中基因表达和蛋白质表达的研究都适用于表征GR配体的抑制效应(反式阻抑)或增加效应(反式激活)。随后显示这样的结果与反式激活和反式阻抑筛选测定法的结果之间的相关性。4来自WO00/32584和WO02/10143的选择性GR激动剂(SEGRA)下面，绘制用于表征筛选中的SEGRA物质的分子机制的测定法以及具有不同反式激活活性的两种所选SEGRA物质的结果。这些测定法证实了用于基于细胞系中受体测定法或启动子测定法表征GR配体的分子机制的当前常用方法的情形。4.1表征GR配体的分子机制首先，对所述物质进行受体结合测试，以显示与GR的结合，并同时显示对GR的选择性。用重组产生的受体检查所述物质与糖皮质激素受体(GR)和其他类固醇激素受体(盐皮质激素受体(MR)、孕酮受体(PR)和雄激素受体(AR))的结单核细胞上的受体的蛋白质表达的增加效应。粒细胞也得到了相似的结果。单核细胞上的CDW3表达全血培养物中的效尼松龙效应4h24h羅敏体01"moVL单核细胞上的INF-gRl表达全血培养物中的泼尼松龙效应■载体■截体g,,4mo!A>单核细胞上的TNF-R1表达全血培养物中的龙尼松龙效应v瞎栄欲还&鬮合。为此，使用以含有相应类固醇激素受体的编码序列的杆状病毒感染的SF9细胞的提取物。与参比物质fH]-地塞米松相比，所述物质显示与GR的高至极高的亲和力。为了测定SEGRA物质的反式激活活性，使用两个测试系统。小鼠乳瘤病毒(MMTV)的启动子含有活化GR的特异性结合位点(所谓的GRE)。在报道基因(萤光素酶)之前克隆该启动子，并将构建体以稳定方式整合到人细胞系HeLa(宫颈癌细胞)的基因组中。通过添加测试物质和参比物质活化MMTV启动子并表达萤光素酶，通过光度测量可以检测萤光素酶的活性。在第二个反式激活系统中，测定糖皮质激素对酪氨酸氨基转移酶(TAT)的诱导。在TAT的基因的启动子中也存在GRE，因此通过被配体活化的GR的结合，该基因以增强的形式表达。为此，用测试物质和参比物质处理小鼠肝细胞瘤细胞(H4I正3)24小时，然后通过光度法测定TAT活性。对于两种测定法，检测SEGRA物质的反式激活激动作用以及检测其他GR配体在所述参数的诱导方面的拮抗作用都是可能的。为了测定反式阻抑活性，使用含有部分胶原酶启动子的启动子系统。在报道基因(萤光素酶)之前放置所述启动子，并将产生的构建体以稳定的形式整合到人细胞系HeLa的基因组中。在用佛波醇酯刺^[所述细胞之后，该启动子被活化。SEGRA测试物质和糖皮质激素的给药抑制佛波醇酯诱导的启动子活性。通过对萤光素酶活性的光度测定进行所述检测。与参比物质地塞米松的活性相比较测定SEGRA物质在相应的反式激活和反式阻抑系统中的活性。4.2反式激活激动剂化合物1已经在上述反式作用(transaction)测定法中测试了作为激动剂的SEGRA物质化合物1。化合物1诱导MTTV启动子的活性，功效为10±1.4nmol，且效力为最大地塞米松效应的73±2.8%(11=2)。在诱导小鼠肝细胞瘤细胞中TAT活性方面，所述物质显示5.7土0.6nmol的功效，且效力为最大地塞米松效应的86±12.7%(n=2)。其在MMTV启动子测定法和TAT启动子测定法中都没有拮抗效应。4.3反式激活拮抗剂化合物2与化合物l相反，化合物2是明确的MMTV启动子的拮抗剂。该物质拮抗由地塞米松诱导的MMTV启动子活性，功效为85土12nmo1，且效力为GR拮抗剂RU486的最大效应的119±3.6%(n=3)。在TAT启动子方面，化合物2表现为部分激动剂。化合物2诱导TAT启动子的活性，功效为67土10nmo1,且效力为最大地塞米松效应的43.5±10.6%(n=2)。在1pmol的浓度下，化合物2拮抗地塞米松诱导的TAT活性，其效力是RU486的最大效应的35%。5通过原代免疫细胞中的基因表达分析表征化合物1和化合物2的反式激活和反式阻抑活性下面，举例来说，基于两种SEGRA物质反式激活激动剂(化合物1)和反式激活拮抗剂(化合物2)比较地显示通过原代免疫细胞中的基因表达分析表征选择性GR配体的反式激活和反式阻抑活性的应用。先前用常用测定法已经表征了这些物质的分子机制(见5.2和5.3)。通过定量实时TaqMan-PCR进行该基因表达分析。显示了GR配体的结果与载体对照的结果的比值(平均值士标准差)。5.1原代人免疫细胞的体外结果所述SEGRA物质显示作为反式阻抑活性参数的人PBMC中细胞因子的表达的相当抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>水久地诱导这些基因的表达，而反式激活拮抗剂化合物2不导致基因表达的增加。另外，检査了反式激活拮抗剂是否可以选择性地阻止标准糖皮质激素泼尼松龙对所选反式激活活性参数的基因诱导。泼尼松龙和化合物2都导致人PBMC培养物中反式阻抑参数TNF-a和IL-lf3的mRNA表达的抑制。两种GR配体的组合导致与单个剂量相似的结果。<image>imageseeoriginaldocumentpage27</image><image>imageseeoriginaldocumentpage28</image>与此相反，只有泼尼松龙诱导反式激活参数CD163和FKBP51，但反式激活拮抗剂化合物2不诱导之。同时给药化合物2和泼尼松龙导致明显比单独给药的泼尼松龙低的反式^[活参数诱导。事实上，在所有批次中，化合物2都减少CD163表达。这些数据证实，在我们确定的新测试系统，即未受刺激的原代免疫细胞中，所选参数适用于检测选择性GR配体的拮抗活性。.2小鼠中的体内结果在给药所述SEGRA物质5天之后肾上腺重量的降低证实，在所选剂tC30mg/kg)下，两种物质在体内都是有活性的。小鼠肾上腺重量(5/组)SEGRAs.c.施用(30ma/kg)5天载体ZK238587ZK2431肪24小时后在SEGRA处理的小鼠的脾细胞中表征所选基因的表达的体内调节。反式激活拮抗剂化合物2对作为反式阻抑参数的炎症细胞因子的抑制不如激动剂化合物1的显著。但是，与载体对照相比，两种物质都显著地抑制这些基因的表达。,ZK238587(30mg/kg)HZK243185(加mg/kg)施用后24小时SEGRAcpds.(30mg/kg)对小鼠脾细胞中基因表达的效应(n=5)TNFaIL-1BRANTES<image>imageseeoriginaldocumentpage29</image>下面，显示了所选基因的体内调节的结果，所述基因的诱导与GR配体的反式激活活性相关。用反式激活激动剂化合物1处理导致脾细胞中FKBP51、CD163、GILZ和谷氨酰胺合成酶表达的明显诱导。与此相反，反式激活拮抗剂化合物2减少这些基因的表达。对于所有所选参数而言，不仅可以检测到所述反式激活拮抗剂对基因表达的诱导降低，甚至还可以检测到其对基因表达的抑制。这种效应可能由内源性糖皮质激素的反式激活活性的拮抗诱导。总之，基于两种所选的、ScheringAG的选择性GR激动齐U(SEGRA)，可能显示未受刺激的原代免疫细胞测试系统中确定的基因和/或蛋白质的表达的研究适用于表征选择性GR配体就其反式激活或反式阻抑体外和体内激动或拮抗活性而言的分子机制。5.3评价公式2的比值目的是通过概括地反映对不同反式阻抑和反式激活参数的表达的不同影响的值表征物质的分离的程度。为了表征SEGRA测试物质的分离的作用，因此确定分离因子，其基于对所选基因的诱导或抑制显示反式激活和反式阻抑活性的分离。f丞q;-逸弒/长2aio选择TNF-a和IL-ip作为可以生成反式阻抑机制的参照的参数。用CD163和FKBP51检测反式激活活性。下面，根据公式2导出归一化为泼尼松龙的反式阻抑和反式激活参数之间的比值比值x/丄-1/对反式激活和反式阻抑活性的因子进行几何平均，并且计算成彼此的比值。根据该公式，CD163和FKBP51的降低的基因诱导和与泼尼松龙相当的TNF-ot和IL-ip抑制导致该比值增加到比值H。所述比值越高，GR配体与泼尼松龙(比值-l)相比则越分离。下图描述了该结果。<image>imageseeoriginaldocumentpage31</image>苈.'^fi示h2、4、"浙W//、好后户5MC潜养欽(7|=力*与拔^松龙裙M所迷C^配沐游沐W分庸效^t在搭基齿表这澄力一众为渡^投龙之后，A及式超滞参教(TM^浙/丄-柳浙及式激活参教卩0)763浙i^O尸5〃游yi^T錄澄游裔W,该M澄。乎场澄i5D。地塞米松lb8M化合物1le-5M反式激活激动剂化合物2le-SM反式激活拮抗剂1小时2小时4小时12小时24小日寸总之，可以从PBMC培养物中的基因表达值得到比值(分离因子)，其表征SEGRA测试物质的分子机制，其与泼尼松龙相比被不同程度地分离。特别是对于TA拮抗剂而言，随着时间可以观察到比值增加的良好持续性(开始于2小时值)。基于该分离因子，标准GK泼尼松龙和地塞米松的反式阻抑和反式激活性质总是在很大程度上相当。5.4体内领!l试用GR配体处理的小鼠的脾细胞中的动态基因表达与体外动力学测试中一样，计算分离因子，以显示所述SEGRA测试物质的分离的体内作用。这些因子包括归一化为泼尼松龙处理后表达(不同时间的泼尼松龙组的平均值)的反式阻抑和反式激活参数的基因表达值。基因抑制参数是TNF-a和IL-ip，而基因诱导参数是CD163和FKBP51。相应于说明性公式2，从反式阻抑和反式激活参数的几何平均值的商计算所述分离因子。上图用图表显示所述SEGRA测试物质与泼尼松龙相比的分离的比值的动力学。对于所有SEGRA测试物质，可以在给药后24小时检测最大的体内分离。在6小时后观察到所有SEGRA测试物质的最小分离。对于TA激动剂和TA部分激动剂，所述值与泼尼松龙相比甚至显著低。泼尼松龙(30mg/kg)化合物1(30mg/kg)反式激活激动剂化合物2(30mg/kg)反式激活拮抗剂厭-^ff示2、6界W/力好后A4HcV、廣-5)^与发^松方裙比费述G及縱游沐力分鄉雌絲基辦这做一众为縱絲之后，渐式娜参教,-ct浙/丄-7"浙发式激活参教^0)/"莉/^B"〃游yz^r钩澄游裔^,该"澄。总之，已经证实所选参数也适用于在体内显示GR配体的反式阻抑和反式激活活性以及TA部分激动剂和TA拮抗剂的分离的作用。但是，总体上，小鼠脾细胞中的体内分离不如人PBMC的体外测试中，且不如其一致。这至少部分是因为所述SEGRA物质在体内抑制反式阻抑参数TNF-a和IL-1(3的活性较低。5.5显示使用参数以检测拮抗作用先前的结果只显示GR配体的不同激动，即，例如反式激活拮抗剂ZK243185(化合物2)对CD163和FKBP51的诱导的降低或缺乏。所述参数也可以被用于通过标准糖皮质激素如泼尼松龙阻止原代人免疫细胞中TA介导的基因诱导来直接产生拮抗，同时TR介导的抑制，例如TNFa表达不被损害。也就是说，要求拮抗的分离。<image>imageseeoriginaldocumentpage34</image>权利要求1.用于通过GR敏感基因的基因和/或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体(GR)配体的反式激活和反式阻抑活性的方法，其中进行以下步骤a)将原代免疫细胞暴露于GR配体；b)检测至少一种GR敏感基因的表达调节以测定所述反式阻抑；c)检测至少一种GR敏感基因的表达调节以测定所述反式激活；d)通过参考已知糖皮质激素将所得值归一化；e)根据公式1导出比值2.权利要求l的方法，其中为了表征所述反式激活，测定IFN-yRl、TNF-Rl、IL-1R1、IL-2Ra、IL-13Ra、CXCR4、GITR、卩2-肾上腺素受体、血红素加氧酶1、IL-2、MIF、膜联蛋白1或血小板反应蛋白1的表达。3.权利要求1的方法，其中为了表征所述反式激活活性，测定CD163、FBKP51、谷氨酰胺合酶或GILZ的诱导。4.权利要求1的方法，其中为了表征所述反式阻抑活性，测定HLA-DR、CD86或促炎细胞因子IL-P、IL-8、TFN-oc或Rantes的抑制。5.用于通过GR敏感基因的基因和/或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体(GR)配体的反式激活和反式阻抑活性的方法，其中进行以下步骤a)将原代免疫细胞暴露于GR配体；b)检测TNF-a和IL-ip的表达调节；c)检测CD163和FKBP51的表达调节；d)通过参考已知糖皮质激素将所得值归一化；e)根据公式2导出比值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.权利要求1-5的至少一项的方法，其中所述原代免疫细胞是未受刺激的。7.权利要求1-6的至少一项的方法，其中在所述细胞上或在分泌到液体中后进行所述蛋白质检测。8.权利要求l-7的至少一项的方法，其中检查来自淋巴器官、来自骨髓或来自血液的原代免疫细胞。9.权利要求1-8的至少一项的方法，其中已经除去了活生物中的血液。10.权利要求1-9的至少一项的方法，其中进行反式阻抑和反式激活参数对泼尼松龙的归一化。11.前述权利要求的方法用于检测GR配体的竞争性或非竞争性激动、部分激动、部分拮抗或拮抗活性的用途。12.权利要求1-10的方法在体外和体内试验中以及作为生物标记物测定法的用途。全文摘要本发明涉及用于通过原代免疫细胞中的基因和/或蛋白质表达分析表征糖皮质激素受体(GR)配体的反式激活和反式阻抑活性的方法及其用途。文档编号G01N33/74GK101166980SQ200680014619公开日2008年4月23日申请日期2006年5月2日优先权日2005年4月29日发明者B·舒尔茨,C·伦奇,C·施托克,H·沙克,H·雷温克尔,N·施密斯,P·戈勒茨,W-D·德克申请人:拜耳先灵医药股份有限公司