生物传感器的利记博彩app

专利名称：生物传感器的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器，该生物传感器可迅速且高精 度地定量生物试样等中所含的中性脂肪。
背景技术：
通常，作为中性脂肪的测定方法，有(1 )使用铬变酸的方法、(2)乙酰丙酮法、(3)酶法、(4)使用浊度计的方法等， 这些方法都需要复杂的分析操作和长的分析时间。因此，开发 了生物传感器，其为在测定试样所含的特定成分时，不进行试 样的稀释、搅拌等就简易且迅速地定量目标物的产品。作为这样的中性脂肪测定用生物传感器，有一种甘油三酯 传感器，其特征在于，在覆盖在pH敏感性离子选择性场效应晶 体管的栅绝缘膜上的多孔高分子膜或在亲水性的均质高分子膜 上固定了甘油酯水解酶(日本特开昭59 - 210356号公报)。另外，还已知使用了脂蛋白脂肪酶和甘油氧化酶的中性脂 肪传感器(日本特开昭59 - 228158号公报)。该传感器具有第一 电极和第二电极，在一个电极附近配置固定化酶，基于膜电极 间流通的电流来测定被测定溶液中所含的中性脂肪，其中所述 传感器使用脂蛋白脂肪酶和甘油氧化酶作为固定化酶。然而， 该装置很复杂，由玻璃制的内管和玻璃制的外管构成，前述内 管的底部设有第一电极，在前述内管与前述外管之间装入内部 液体，在该内部液体中配置有第二电极，将该电极放入维持在 30。C的水槽中，在该水槽中注入测定试样。作为更简便的装置，提出了一种传感器在绝缘性基板上 形成至少具有测定极和对电极的电极系统，在电极系统中电化
学地检测酶、电子受体以及试样液在反应时的物质浓度变化，测定试样液的基质浓度(日本特开2001 - 343349号公报)。该传 感器是如下的中性脂肪测定用传感器在测定极上装载保持体 而形成第一层，该保持体保持有脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘 油磷酸氧化酶和表面活性剂，并且可4吏试样液通过；在对电极 上装载保持体而形成第二层，该保持体保持有表面活性剂，并 可使试样液通过。发明内容然而，上述日本特开昭59 - 210356号/>净艮中记载的甘油三 酯传感器是使用pH敏感性离子选择性场效应晶体管测定通过 甘油酯水解酶而游离的脂肪酸的传感器，由于响应值与试样浓 度的对数成比例，因此测定精度不充分。另外，也有装置复杂 的问题。另外，上述日本特开昭59 - 228158号公报记载的中性脂肪 传感器为了正确测定而必须有将温度固定的加热装置，测定试 样也必须从传感器外部供给，因此试样量必须多，少量的试样 则难以测定。另外，日本特开2001 - 343349号公报记载的传感器由于酶 与电子受体构成不同的层，因此装置非常复杂，除了脂蛋白脂 肪酶以外，还必须使用甘油激酶、甘油磷酸氧化酶这样的两种 昂贵的酶。进年来，作为生活习惯病的高血脂症的患者的数目日益增 加，现在，迫切希望开发出可迅速并且高精度地测定血液等试 样中的中性脂肪的浓度的传感器。于是，本发明的目的在于，提供一种不必进行试样的前处 理，就可由生物试样等试样迅速并且高精度地测定中性脂肪的
浓度的传感器。本发明人们发现 一种生物传感器，其具备绝缘性基板、 被形成在所述绝缘性基板上的含有工作电极和对电极的电极系 统、被形成在所述电极系统的上部或附近的反应层，该生物传 感器用于基于所述电极系统中流通的电流值来测定中性脂肪的 浓度，其中，前述反应层中包含脂蛋白脂肪酶、甘油脱氢酶以 及电子受体，从而可迅速并且高精度地测定试样中的甘油浓度， 从而完成了本发明。即，本发明的一种方式是关于一种生物传感器，其具备 绝缘性基板；被形成在所述绝缘性基板上的含有工作电极和对 电极的电极系统；被形成在所述电极系统的上部或附近的、包 含脂蛋白脂肪酶、甘油脱氢酶以及电子受体的反应层，该生物 传感器用于基于所述电极系统中流通的电流值来测定中性脂肪 的浓度。本发明的其它目的、特征以及特质，通过参考以后的说明 和附图中所例示的优选的实施方式会明确。


图l是表示本发明的生物传感器的各构成要素的形成模式 的平面图。(a)是表示绝缘性基板上的引线部以及连接部的形 成模式的平面图。(b)是表示构成电极系统的参比电极的形成 模式的平面图。(c)是表示构成电极系统的工作电极和对电极 的形成模式的平面图。(d )是表示绝缘层的形成模式的平面图。 (e)是表示隔膜和反应层的形成模式的平面图。图2是表示图1的各图所示出的各构成要素的层叠顺序的分 解立体图。图3是表示图1和图2的各图所示出的各构成要素所形成的 生物传感器的平面图。图4是表示实施例1 - l的结果的图。图5是表示实施例1 - 2的结果的图。 图6是表示实施例2 - 1 ~ 2 - 3的结果的图。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的优选的一种实施方式进行说明， 但本发明的保护范围并不仅限于下述的方式。本发明的一种方式是关于生物传感器，其具备绝缘性基 板；被形成在所述绝缘性基板上的含有工作电极和对电极的电 极系统；被形成在所述电极系统的上部或附近的、包含脂蛋白 脂肪酶、甘油脱氢酶以及电子受体的反应层，该生物传感器用 于基于所述电极系统中流通的电流值来测定中性脂肪的浓度。图l是表示本发明的生物传感器10的各构成要素的形成模 式的平面图。另外，在图l的各图中，图示出了各图中说明的构 成要素、以及表示绝缘性基板20的外形的假想线。图l(a)是 表示绝缘性基板2 0上的引线部3 0以及连接部3 2的形成模式的平 面图。图l (b)是表示构成电极系统40的参比电极42的形成模 式的平面图。图l (c)是表示构成电极系统40的工作电极44和 对电极46的形成模式的平面图。图l (d)是表示绝缘层50的形 成模式的平面图。图l (e)是表示隔膜60和反应层70的形成模 式的平面图。另外，在图l的各图中，图示出了各图中说明的构 成要素和绝缘性基板20。图2是表示图l的各图中所示出的各构 成要素形成的生物传感器IO的平面图。在图2所示的生物传感器 IO中，在绝缘基板20上，被一体化的引线部30和连接部32、电 极系统40、绝缘层50、隔膜60和反应层70从绝缘基板20的一侧 按该顺序层叠。另外，生物传感器10有时还以被覆盖物覆盖的
状态被使用和贮藏，但在图1及图2中省略了这样的覆盖物的图 示。另外，为了便于说明，图的尺寸比率被夸大，有时，图示 的形态与实际不同。生物传感器10是用于测定体液等试样中的中性脂肪的浓度 的装置。以下，详细说明构成生物传感器10的各部件。生物传感器10具备作为其基体的绝缘性基板20。绝缘性基 板20可由聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚乙烯等树脂、玻璃、 陶资、纸等的目前公知的绝缘性材料构成。绝缘性基板20的形 状、大小没有特别限定。如图1及图2所示，在绝缘性基板20上形成有引线部(30a、 30b、 30c)和连接部(32a、 32b、 32c )。连接部(32a、 32b、 32c )作为用于电连接后述的电极系统40与生物传感器IO外部的 单元而发挥作用，并通过引线部(30a、 30b、 30c)与电极系统 40电连接。引线部(30a、 30b、 30c)如图2所示，从连接部(32a、 32b、 32c)延长到电极系统40的位置，构成电极系统40的各电 才及(42、 44、 46)的基层。构成引线4P ( 30a、 30b、 30c )详口连 接部(32a、 32b、 32c)的材料没有特别限制，可适当使用在形 成传感器的引线部和连接部时一直使用的材料。其中，从更进 一步提高生物传感器10的响应灵敏度的观点来看，引线部(30a、 30b、 30c )和连接部(32a、 32b、 32c )优选由表面电阻值较小 的材料构成。具体而言，优选由在10(am的厚度时具有50mQ/口 以下、更优选40mQ/口以下的表面电阻值的材料构成。使用表 面电阻值比上述范围还大的材料构成引线部和连接部时，基质 浓度与响应值之间的线性降低，可能不能充分得到本发明带来 的测定灵敏度的提高效果。另一方面，该材料的表面电阻值的 下限没有特别限制，为了确保引线部30和连接部32与基板的粘 接性而考虑添加粘合剂时，预测引线部30和连接部32的表面电
阻值在10lim的厚度时为0.1mQ/口以上的程度。但是，引线部30 和连接部32当然也可以由具有这些范围以外的表面电阻值的材 料构成。作为具有上述优选的表面电阻值的材料，可列举出例 如，以银、金、铂和钯等金属作为主要成分的材料。构成各引 线部(30a、 30b、 30c)和各连接部(32a、 32b、 32c)的材料， 可以各自相同，也可以各自不同。其中，从低成本的观点出发， 引线部和连接部优选都由银构成。引线部和连接部的形成的方 法没有特殊限制，可通过丝网印刷法、溅射法等目前公知的方 法形成。此时，构成引线部和连接部的材料，可以以包含聚酯 等树脂粘合剂的糊剂形式提供。通过上述方法形成涂膜后，为 了使涂膜硬化，可以在50~ 200。C左右的温度下实施加热处理。 如图1和图2所示，在引线部(30a、 30b、 30c)延长所形成 的基层的上层形成有电极系统40。在使用生物传感器10时，该 电极系统40作为用于对后述反应层70中的试样施加电压的电压 施加单元、以及用于检测试样中流通的电流的电流检测单元而 发挥作用。在图示的方式中，电极系统40由参比电极42、工作电极44 和对电极46三个电极构成。即，图示的形态的生物传感器10是3 电极式传感器。但是，本发明的生物传感器并不仅限于3电极式， 也可以是具备不包括参比电极的电极系统的2电极式传感器。另 外，从以较高灵敏度进行电极系统40的电压的控制的观点来看， 与2电极式相比，优选使用3电极式。工作电极4 4和对电极4 6在使用生物传感器10时是 一 对，其 作为用于测定对后述的反应层70中的试样施加电压时流通的氧 化电流(响应电流)的电流测定单元而发挥作用。在使用生物 传感器IO时，在参比电极42与工作电极46之间施加规定的电压。 构成各电极的材料没有特别限制，可适宜使用在形成生物传感
器的电极系统时一直使用的材料。但是，从更进一步提高生物传感器10的响应灵敏度的观点来看，电极系统4 0优选由在10 fi m 的厚度时具有100mQ/口以下、更优选为80mQ/口以下的表面电 阻值的材料构成。使用表面电阻值比上述范围还大的材料构成 电极系统40时，基质浓度与响应值之间的线性降低，可能不能 充分得到本发明带来的测定灵敏度的提高效果。另一方面，该 材料的表面电阻值的下限没有特别限制。构成各电极(42、 44、 46)的材料，可以各自相同，也可以各自不同。4旦是，从耐腐 蚀性和成本的观点来看，各电极(42、 44、 46)优选都以碳为 主要成分构成。但是，根据情况，也可以由各种金属等碳以外 的材料构成电极系统40。电极系统的形成方法没有特别限制， 可通过丝网印刷法、賊射法等目前/>知的方法形成。此时，构 成电极系统的材料可以以包含聚酯等树脂粘合剂的糊剂形式提 供。通过上述方法形成涂膜后，为了使涂膜硬化，可以实施加 热处理。本方式的生物传感器10中，如图3所示，构成电极系统40 的各电极(42、 44、 46)从被形成在电极系统40的上层的绝缘 层50所具有近似矩形的开口部露出。在此，乂人前述开口部露出 的工作电极44与对电极46的露出面积的比值优选控制在规定的 范围内。具体地说，对电极46从前述开口部露出的面积是工作 电极44从前述开口部露出的面积的1.2 ~ 3.0倍。对电极46露出 的面积不足工作电4及44露出的面积的1.2倍时，测定氧化电流值 时，在对电极46的氧化还原反应的饱和不能被充分抑制，可能 不能充分得到提高生物传感器IO的测定灵敏度的本发明的效 果。另一方面，对电才及46露出的面积超过工作电才及44露出的面 积的3.0倍时，可能难以将生物传感器IO小型化。如图l和图2所示，被形成在绝缘性基板20上的引线部(30a、 30b、 30c)和连4妻部(32a、 32b、 32c)、以及电才及系乡克40的上 层，形成有绝缘层50以便电极系统40露出。绝缘层50作为用于 防止构成电极系统40的各电极间的短;咯的绝缘单元而发挥作 用。构成绝缘层50的材料没有特别限制，例如，可由抗蚀油墨、 PET、聚乙烯等树脂、玻璃、陶瓷、纸等构成。关于绝缘层50 的形成方法也没有特殊限制，可通过丝网印刷法、粘合法等目 前公知的方法形成。如图l和图2所示，电极系统40和绝舌彖层50的上层形成有隔 膜60和反应层70。在使用生物传感器10时，在反应层70中进行 后述的酶反应。另外，通过设置隔膜60,可防止在使用生物传 感器10时反应层70和试样溶液的漏出。在图示的方式中，隔膜 60在与电极系统40对应的部位有矩形开口部，在该开口部设有 反应层70。其中，隔膜60所具有的开口部的形状并不仅限于矩 形，可使用任意的形状。构成隔膜60的材料没有特殊限制，可 由例如，PET、聚乙烯等树脂、玻璃、陶瓷、纸等构成。隔膜 60和反应层70的形成方法没有特殊限制，例如，可4吏用如下方 法在规定的部位装载具有开口部的隔膜60，在该开口部滴加 用于形成反应层70的溶液，使之干燥。本方式的生物传感器中，反应层70包含脂蛋白脂肪酶、甘 油脱氬酶以及电子受体。目前有这样的传感器，即，在绝缘性基板上形成有具有工 作电极和对电极的电极系统、并在前述电极系统上或电极系统 的附近形成有反应层的生物传感器，也有在反应层中组合脂蛋 白脂肪酶和其它酶的传感器。但是在本发明中，通过配合脂蛋 白脂肪酶和甘油脱氢酶，可简便并且廉价地进行中性脂肪的测 定。并且，由于反应层还含有电子受体，因此没有必要分别设 置含有酶的反应层和含有电子受体的层，可简化结构。在本方
式的生物传感器中添加包含脂蛋白的试样时，反应层中所含有 的脂蛋白脂肪酶分解脂蛋白中的中性脂肪，从而使甘油和脂肪 酸游离。而且，反应层中存在甘油脱氢酶和电子受体时，甘油 被氧化并且电子受体被还原。因此，从所得的电子受体的氧化 电流值可正确定量基质的浓度。下面，对本发明的特征性的组 成进行详细^兌明。本方式的生物传感器所使用的脂蛋白脂肪酶，只要是可分 解脂蛋白而游离出甘油就没有特殊限制，目前公知的脂蛋白脂 肪酶或者再将它改性而提高稳定性、反应性的物质等，都可适 当使用。反应层中该脂蛋白脂肪酶的含量也可根据所使用的生 物试样的种类、其添加量等进行适宜选择。通常，反应层中含有的脂蛋白脂肪酶的量为0.001 ~ 1000活性单位、优选为O.l ~ 500活性单位、特别优选O.l ~ 300活性单位。另外，脂蛋白脂肪 酶的活性单位的定义以及测定方法如下。 [脂蛋白脂肪酶活性的测定方法]在lmL 20mM的磷酸緩沖剂(pH7 )中添加2mL大豆油乳剂， 充分搅拌后，添加lmL含脂蛋白脂肪酶的溶液，在37。C下振荡 20分钟。4展荡后，添加10mL反应停止液，再添加6mL正庚烷和 4mL离子交换水，充分搅拌。另外，"大豆油乳剂"是在以20mM 磷酸緩冲液(pH7)调制的10。/。牛血清白蛋白溶液16mL中，添 加24mL大豆油并充分搅拌得到的物质。另外，"反应停止液，， 是正庚烷/2 -丙醇/2N硫酸(10/40/1, w/w/w)的混合液。接着，取6mL上层(正庚烷层)，在其中滴加2滴曱酚红指 示剂，用以乙醇制备的0.01M氢氧化钾溶液进行滴定，将溶液 变为紫色的时间点作为滴定终点，求出游离脂肪酸的量。作为 对照，用lmL 20mM的磷酸緩冲液代替含脂蛋白脂肪酶的溶液 来进行同样的操作，求出游离的脂肪酸的量。
在上述条件下，将l分钟使lpmol脂肪酸游离的脂蛋白脂肪酶的量定义为l活性单位。另外，甘油脱氢酶也同样，只要是能将甘油氧化而将电子 受体还原的物质就没有特殊的限制，目前公知的甘油脱氢酶或 者再将它改性而提高稳定性、反应性的物质等都可适当使用。 特别优选甘油脱氢酶为辅酶依赖型。作为这样的辅酶，可适当使用吡咯喹啉醌(PQQ)、 CoQ等 醌类辅酶、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD )、 FMN、 NAD、 NADP、 生物素等维生素类辅酶等。在这些辅酶中优选为PQQ或FAD， 更优选为PQQ。在此，例如，甘油脱氢酶作为酶包含在反应层 中时，使用溶液中的溶解氧进行反应，因此难以正确进行中性 脂肪的测定。与此相对，采用上述方式的生物传感器时，辅酶 依赖型的甘油脱氢酶在反应中仅使用溶液中的电子受体，因此 不受溶解氧的影响。因此，只要测定氧化被还原了的电子受体 而得到的氧化电流，就可正确地测定甘油的浓度。反应层中的 甘油脱氢酶的含量可根据使用的生物试样的种类、其添加量等 适当选择。通常，反应层中所含有的甘油脱氢酶的量为O.Ol ~ 200活性单位、更优选为0.05 ~ IOO活性单位、特别优选为0.1 80活性单位。另外，甘油脱氢酶的活性单位的定义以及测定方 法可参考后述的实施例的记载。本方式中4吏用的甘油脱氢酶，可以购入市售的商品而使用， 也可使用自己制备的物质。作为自己制备该酶的方法，例如， 有利用产生该酶的细菌的方法。作为产生该酶的细菌，可列举 出例如，属于葡糖杆菌属、假单胞菌属等各种属的细菌。本实 施方式中，特别优选使用在属于葡糖杆菌属的细菌的膜组份中 存在的PQQ依赖性甘油脱氢酶。进而，从获取的难易来看，可 使用葡糖杆菌属，特别是氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter
oxydans ) NBRC 3171、 3253、 3258、 3285、 3289、 3290、 3291, Gluconobacter frateurii NBRC 3251 、 3260、 3264、 3265、 3268、 3286, Gluconobacter Ceri画NBRC 3262等。作为这样的微生 物的代表菌林，可列举出氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans ) NBRC 3291。从这些细菌得到P Q Q依赖性甘油脱氢酶的方法没有特别限 制，可适宜参照目前7>知的方法。本方式的生物传感器中，甘油脱氢酶是PQQ依赖性的情况 下，该甘油脱氢酶优选为在表面活性剂的存在下，通过2价的交 联试剂进行化学修饰所得到的修饰甘油脱氢酶。在这样的修饰 甘油脱氩酶中，疏水性的酶不凝集地被导入交联结构而结构变 得坚固，可提高热稳定性。因此，通过上述实施方式的生物传 感器，能更高精度地测定试样中的中性脂肪浓度。2价的交联试剂只要是与PQQ依赖性甘油脱氢酶中所含有 的氨基等反应而能导入交联结构，则没有特殊限制，可适当使 用在固定化酶的领域中可作为酶的交联剂使用的二醛化合物、 二羧酸化合物、二异氰酸酯系化合物、亚胺酸酯化合物等。作 为二醛化合物有戊二醛、丁二醛、己二醛等，作为二羧酸化合 物有己二酸、二甲基己二酸等，作为二异氰酸酯系化合物有六 亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯等，作为亚胺酸酯化合物 有辛二酸亚胺二甲酯(dimethyl suberimidate )、庚二酸亚胺二 甲酉旨(dimethyl pimelimidate )等。本发明在上述2价的交联试 剂中特别优选戊二醛。另一方面，作为表面活性剂，只要是通常用于使膜蛋白质 可溶化的物质就没有特殊限制，可适宜参照目前公知的知识。 可列举出例如，TritonX-100、辛基葡糖苷、胆酸钠等。交联反应时的反应温度可根据使用的2价的交联试剂适宜
选择，通常优选在0~ 40。C左右进行，反应时间为l分钟~ 4小时， 优选为5分钟~ 2小时左右、特别优选为5分钟~ l小时。低于l 分钟时，交联不充分且未交联的酶数量变多，另一方面，超过4 小时时，交联率过大且有酶丧失活性的情况。可通过添加甘氨酸溶液或Tris-HCl緩沖液那样的停止剂进 行反应，从而停止交联反应。上述交耳关剂处理后，未反应的甘 氨酸、2价的交联试剂、2 -氨基-2 -羟曱基-1,3 -丙二醇以 及停止剂与2价的交联试剂的反应物可通过进行透析法、色谱 法、超滤法等除去。本发明中特别优选透析法。理由是因为操 作简便、不需要成本。在使用生物传感器10时，电子受体接受通过氧化还原酶的 作用而生成的电子，即被还原。然后，被还原的电子受体在酶 反应结束后通过在电极系统40中流通的电流一皮电化学性氧化。 通过此时流通的电流(称为氧化电流)的大小，可计算出试样 溶液中所期望的成分的浓度。本方式的生物传感器所使用的电子受体没有特殊限制，只 要是在由甘油脱氬酶氧化甘油的同时被还原，并通过向电极系 统施加电压被氧化即可。具体而言，可列举出例如，《失氰化物 离子、对苯醌、对苯醌衍生物、吩。秦硫酸甲酯、吩。秦硫酸曱酯 衍生物、亚甲蓝、硫堇、靛蓝胭脂红、掊花青、碱性藏红、二 茂铁及其衍生物、a-萘醌以及a-萘醌衍生物等。在此，作为 对苯醌衍生物、吩溱硫酸曱酯衍生物、a-萘醌衍生物可列举 出在对苯醌、吩嗪硫酸曱酯、a-萘醌上结合了碳原子数为l或 2的烷基的物质、结合了碳原子数为1或2的烷氧基的物质、结合 了氟原子、氯原子、溴原子等囟素原子的物质等。另外，作为 甘油脱氢酶如上叙述的PQQ依赖性甘油脱氢酶被包含在反应层 中时，作为电子受体，优选采用吩溱硫酸甲酯、吩溱硫酸曱酯
衍生物l -曱氧基-5-甲基吩嗪硫酸曱酯、对苯醌、对苯醌衍生物2 -曱基-1，4 -苯醌、a-萘醌。另夕卜，这些电子受体可以仅单独使用 一种，也可以两种以上组合使用，例如将l -甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸曱酯与铁氰 化物离子组合。反应层中的电子受体在反应层中的浓度，可根据使用的氧 化还原酶、作为对象的试样的种类、添加量等适宜选择，通常， 添力口0.5 ~ 10pL的试样时，平均l个传感器优选为O.Ol ~ lOOOpg、 更优选为O.l ~ 100ng、特另'H尤选为1 ~ 50pg。反应层优选还含有表面活性剂和pH缓沖剂。这是因为如下 的理由。即，使用本方式的生物传感器的目的是测定试样中的 中性脂肪的浓度。因此，滴加到传感器中的试样含有作为脂溶 性物质的中性脂肪。在此，根据反应层还含有表面活性剂和pH 緩冲剂的本实施方式，可抑制因试样中的中性脂肪的脂溶性而 引起的测定灵敏度下降。以下，就上述实施方式进行详细说明。本实施方式的生物传感器中，反应层70含有表面活性剂。 通过在反应层70中含有表面活性剂，可促进试样中所含有的中 性脂肪溶解到反应层70中。结果可提供测定灵敏度优异的生物 传感器。反应层70中含有的表面活性剂的种类没有特殊限制，可使 用目前公知的表面活性剂。在此，表面活性剂可大致分为阳离 子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂以及 非离子性表面活性剂。可使用这些中的任意一种。在此，作为 阳离子性表面活性剂，可列举出例如，鲸蜡基三曱基铵盐、十 二烷基三曱基铵盐等。作为阴离子性表面活性剂，可列举出例 如，烷基硫酸钠、烷基苯磺酸盐、胆酸盐等。作为两性表面活 性剂，可列举出例如，卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂等。
作为非离子性表面活性剂，可列举出例如，酰基脱水山梨糖醇(acylsorbitan )、烷基葡糖苷、吐温(Tween )系表面活性剂、 曲拉通(Triton)系表面活性剂、Brij系表面活性剂等。但是， 当然也可以使用这些以外的表面活性剂。其中，优选使用非离 子性表面活性剂，更优选使用吐温系、曲拉通系表面活性剂。反应层70中的表面活性剂的含量没有特殊限制，可根据试 样溶液中的脂溶性物质的量等适宜调节。举一个例子，添加 0.5 ~ 10pL的试样溶液而使用的生物传感器10的反应层70，通常 可含有O.l ~ 500pg、优选为1 ~賜pg、更优选为1 ~ 50(tig的表面 活性剂。另外，在本实施方式的生物传感器10中，反应层70含有pH 緩沖剂。反应层70含有pH緩冲剂时，生物传感器10的灵敏度可 进一步提高。其理由推测如下。即，添加试样溶液引起反应层 70溶解时，根据试样溶液的组成，反应层70的pH会变化。举一 个pH变化的例子，在反应层70中，试样中的中性脂肪分解而使 脂肪酸游离，伴随与此，pH降低。在此，生物传感器10的机理 是间接定量被氧化还原酶氧化的基质的量，因此反应层70的pH 变化时，根据该酶的种类不同，反应层70的pH与酶的最佳pH 有偏差，引起传感器的测定灵敏度降低。对此，反应层70含有 緩沖剂时，可抑制这种pH变化，防止传感器的测定灵敏度随pH 变化而降低。反应层70含有的pH緩沖剂的种类没有特殊限制，可根据所 使用的酶的最佳pH适宜选择，举一个例子，可列举出甘氨酸-HC1、甘氨酸-NaOH、柠檬酸-柠檬酸钠、MES - NaOH、 MOPS -NaOH、磷酸、Tris-盐酸、醋酸等。另外。pH緩冲剂的pH 优选为6~9。而且，这些pH緩冲剂可以在反应层70中单独仅含 有一种，也可以在反应层70中组合含有2种以上。另外，当然也
可以在反应层70中含有上述以外的pH緩冲剂。进而，反应层中可含有其它成分。作为其它成分，可列举 出例如，亲水性高分子、酶稳定化剂等。通过反应层含有亲水性高分子，可防止反应层从电极系统 表面剥离。另外，亲水性高分子还有防止反应层表面破裂的效 果，对提高生物传感器的可靠性有效果。进而，还可抑制蛋白 质等吸附性成分吸附到电极系统40。作为这种亲水性高分子， 没有特殊限制，可列举出例如，纤维素、瓜胶、羧甲基纤维素、 羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧 曱基乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等 聚氨基酸，磺化聚苯乙烯、明胶、丙烯酸及其盐、曱基丙烯酸 及其盐、淀粉、无水马来酸及其盐、琼脂糖凝胶、单宁酸、果 胶、酪蛋白、角叉胶、帚叉藻胶、普鲁兰、胶原、几丁质、壳 聚糖、软骨素硫酸钠、木质素磺酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷 酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇以及这些的糸T生物。这些当中，单 宁酸、果胶、酪蛋白、角叉胶、帚叉藻胶、普鲁兰、胶原、几 丁质、壳聚糖、软骨素硫酸钠、木质素磺酸以及这些的衍生物 包含在反应层70中时，可进一步抑制吸附性成分向电极的吸附。 可特别优选使用单宁酸、果胶、酪蛋白、以及它们的衍生物。 另夕卜，上述的亲水性高分子可以在反应层70中仅单独含有一种， 也可以在反应层70中组合含有2种以上。另外，这样的亲水性高 分子的配合量，通常平均l个传感器优选为O.l ~ 1000|ig、更优 选为l 500pg、净争另'H尤选5 ~ 100|ig。反应层70可以为仅由 一层构成的层，也可以为由2层以上构 成的层。作为反应层70由2层构成的方式，可列举出例如一种反 应层70,其包含第一反应层，其含有电子受体和亲水性高分 子，基本上不含甘油脱氢酶；第二反应层，其被形成在前述第
一反应层的上层，含有甘油脱氢酶和亲水性高分子，基本上不含有电子受体。另外，作为反应层70由3层构成的方式，可列举 出例如一种反应层70,其包含第一反应层，其含有电子受体 和亲水性高分子，基本上不含甘油脱氢酶；第二反应层，其被 形成在前述第一反应层的上层，含有亲水性高分子，基本上不 含有甘油脱氢酶和电子受体；第三反应层，其被形成在前述第 二反应层的上层，含有甘油脱氢酶和亲水性高分子，基本上不 含有电子受体。另外，在图示的方式中，反应层70被形成在电极系统40的上层，但根据情况不同，与图示的方式不同，可以是在电极系 统40的附近形成反应层70,并且电极系统40与反应层70不直接 接触的方式。另外，作为在电极系统40的"附近"形成反应层 70的方式，可举出在电极系统40与反应层70之间的存在空间、 过滤器的方式，在试样供给口与电极系统40之间形成有反应层 70的方式等。以上，详细说明了本发明的生物传感器10的结构，但并不 仅限于上述的方式，还可参照目前7>知的知识实施各种改良。 作为目前公知的知识，可列举出例如，日本特开平2-062952号 公报、日本特开平5-87768号公报、日本特开平11-201932号公报等。接着，说明本发明的生物传感器10的工作。 首先，将规定量的含有希望测定浓度的成分的试样供给给 生物传感器10的反应层70。试样的具体形态没有特殊限制，可 适宜使用含有生物传感器10所使用的甘油脱氢酶的基质即中性 脂肪的溶液。作为试样，可使用例如，血液、尿、唾液等生物 试样、水果、蔬菜、加工食品原料等食品等。但是也可以使用 其它的溶液作为试样。另外，特别是使用中性脂肪的含量较高
的试样溶液的话，可更进一步显现本发明的效果。另外，可以 将原液不加处理来作为试样使用，也可以使用以调节粘度等为 目的而用适当的溶剂稀释的溶液。将试样供给到反应层70的方式没有特殊限制，可以将规定量的试样对反应层70垂直地直接 滴加来供给，也可以由另外设置的试样供给单元对反应层70从 水平方向供给试样。向反应层70供给试样时，试样中作为基质的中性脂肪，通 过反应层70所含有的脂蛋白脂肪酶的作用被分解为甘油和脂肪 酸。接着，游离的甘油在甘油脱氢酶的作用下被氧化，自身氧 化的同时放出电子。从基质中放出的电子被电子受体捕捉，伴 随于此，电子受体从氧化型变为还原型。添加试样后，将生物 传感器10放置规定的时间，从而通过脂蛋白脂肪酶和甘油脱氢 酶的作用，试样中的中性脂肪被完全氧化， 一定量的电子受体 从氧化型变为还原型。用于使试样中的中性脂肪与酶的反应结 束的放置时间没有特殊限制，试样添加后，生物传感器10通常 放置0 5分钟、优选0 3分钟。之后，为了将还原型的电子受体氧化，通过电极系统40， 在工作电极44和对电极46之间施加规定的电压。从而，反应层 70中流通电流(以下，称"氧化电流")，还原型的电子受体通 过该电流被电化学氧化，转变成氧化型。从此时测定的氧化电 流的值，可以算出电压施加前的还原型电子受体的量，进而， 可定量与甘油脱氢酶反应的甘油的量。于是，最终可以计算出 试样中的中性脂肪的浓度。在氧化电流流通时所施加的电压的 值没有特殊限制，可参照目前公知的知识来进行适当调节。举 一个例子，可以在参比电极42和工作电极44之间施力口-200 ~ 700mV左右、优选0~ 600mV的电压。用于施加电压的电压施加 单元没有特殊限制，可适宜使用目前/>知的电压施加单元。 根据本发明的其它的形态，可提供使用了上述生物传感器 IO的试样中的中性脂肪浓度的测定方法。作为氧化电流的测定、以及从该电流值换算成基质浓度的 方法，可4吏用计时安培法，该方法对施加^L定的电压起一定时 间后的电流值进行测定，也可以使用计时库仑法，该方法对将 计时安培法的电流响应值对时间积分所得到的电荷量进行测 定。从用简单的装置系统就可以测定的观点来看，优选使用计 时安培法。以上，已举例说明了通过测定将还原型电子受体氧化时的 电流(氧化电流)而计算出中性脂肪的浓度的方式，根据情况 不同，也可以釆用通过测定将未被还原而残留的氧化型电子受 体还原时的电流(还原电流)而计算出中性脂肪的浓度的方式。实施例接着，举出实施例来具体说明本发明，但本发明并不受这 些实施例的任何限制。 (酶活性)在含有50jiM DCIP 、 0.2mM PMS 、 含400mM甘油的 0.2%Triton X - IOO的lOmM磷酸緩冲液(pH7.0 )中，溶解PQQ 依赖性甘油脱氢酶，制备PQQ依赖性甘油脱氢酶溶液。通过 DCIP在600nm处吸光度的变化，追踪该溶液中含有的酶与基质 的反应，将其吸光度的减少速度作为酶的反应速度。l分钟内 l(amol的DCIP被还原的酶活性作为l单位(U )。另夕卜，DCIP在 pH为7.0时的摩尔吸光系数为16.3mM"。 (参考例l )将由山梨醇(2质量％)、酵母提取物(0.3质量％)、肉提取物 (0.3质量％)、玉米浸渍液(0.3质量％)、聚蛋白胨(1质量％)、 尿素(0.1质量％)、 KH2P04 ( 0.1质量％)、 MgS04 7H20 ( 0.02 质量％)、 CaCl2 ( 0.1质量％)、 pH为7.0组成的400mL培养基向每 个500mL的磨口烧瓶中各转移100mL，在121。C下进行高压灭菌 20分钟。作为种菌，接种 一 接种环的氧化葡萄糖酸杆菌 (Gl腳nobacter oxydans ) NBRC 3291抹，30。C培养24小时，作 为种培养液。接着，将与上述同样组成制备的培养基6.6L移入10L容量的 发酵罐中，在121。C下进行高压灭菌20分钟，放置冷却后，转移 400mL种培养液。将其在750rpm下，以通气量7L/分钟，30。C培 养24小时。离心分离培养液收集细菌，用蒸馏水悬浮，然后通过弗氏 压碎器破碎菌体。离心分离破碎液，超速离心分离所得到的上 清液，得到作为沉淀物的膜组^^。该膜组〗分在10mM的Tris-HCl 緩冲液(pH8.0 )中悬浮后，加入Triton X - IOO使最终浓度成为 1%,于4。C搅拌2小时。超速离心分离，用含有0.2质量。/。的Triton X- 100的10mM的磷酸緩沖剂(pH7.0 )将上清液透析一晚，将 其作为可溶化膜组份。将该可溶化膜组份在快速液相色谱仪 (FPLC)中用ResourceQ ( 6mL )分级，得到的活性组份用含 有0.2质量。/。的TritonX- 1 OO的1 OmM的磷酸緩冲液(pH7.0 )透 析一晚，然后冷冻干燥，得到比活性为3U/mg蛋白的酶制剂。 以下，将该氧化葡萄糖酸杆菌来源的甘油脱氲酶简称"G1 yDH，，。 (实施例1-1 )准备市售的传感器电极(BVT公司生产；AC1.W5.R1 )作 为形成有电极系统的传感器基板。在该传感器基板中，电极系 统为直径约6mm的近似圆形。另外，在上述准备的电极系统的 上部贴合开有直径为6mm的孔的厚0.2mm的PET薄片，形成隔 膜。在电极系统上的隔膜的孔的内部，滴加混合了上述参考例l
得到的GlyDH ( 20U/mL )和脂蛋白脂肪酶(Amano Enzyme Inc. 生产，lOOOOU/mL )以及作为电子受体的1 -甲氧基-5 -曱基 吩溱硫酸甲酯(同人化学研究所生产10mmol/L;以下，也称 "m-PMS"的磷酸緩冲生理食盐水10iiL，室温下使之干燥形 成反应层。在该反应层上，滴加1 OjxL含有50mg/dL三油精的试样液。 试样中含有的三油精在脂蛋白脂肪酶的作用下水解为脂肪酸和 甘油，该甘油在GlyDH的作用下被氧化，同时，反应层中的电 子受体被还原。滴力口试液5分钟后，对工作电极施加相对于参比电极+ 150mV的电压，测定电子受体的氧化电流值。测定中使用电化 学测定系统HZ- 5000 (北斗电工生产，HAG1512m/BP )。该电 流值(响应电流)与电子受体的还原体的浓度、即试样中三油 精的浓度成比例。通过测定该电流值来评价试样中三油精的浓 度。另夕卜，试样为在含有10质量。/oTriton X-100的磷酸緩沖生 理食盐水中溶解三油精(东京化成工业生产)得到的物质。接着，将试样中含有的三油精的量改为Omg/dL、 100mg/dL、 150mg/dL以及200mg/dL之外，与上述同样才栗作，测定响应电流。 在图4中描绘了关于含有各浓度的三油精的试样在施加电压后1 秒钟后的电流量的结果。如图4所示，可确认响应电流与三油精浓度之间成良好的线性。(实施例1-2 )在实施例l - l使用的电极系统上，滴加0.5。/q(w/v)的羧 曱基纤维素钠(和光纯药生产；以下，也称"CMC")水溶液 并干燥后，滴加含有与实施例1同样操作得到的GlyDH(20U/mL )、脂蛋白脂肪酶(10000U/mL )以及m - PMS (10mmol/L)的0.5。/。CMC溶液，使之干燥形成反应层。使用该生物传感器，与实施例1 - l同样考察响应电流值与 三油精浓度间的相关性。结果在图5中示出。如图5所示，所得的响应电流值受C M C的影响降低若干， 但响应电流值与中性脂肪的浓度比实施例1有更高的相关性。 (实施例2-l )作为形成有电极系统的传感器基板，准备市售的传感器电 极(BVT公司生产；AC1.W5.R1)。在该传感器基板中，电极系 统为直径约6mm的近似圆形。另外，在上述准备的电极的上部， 贴合开有直径为6mm的孔的厚0.2mm的PET薄片，形成隔膜。另一方面，在pH7.0的磷酸緩冲生理食盐水(PBS)中，添 加上述参考例中得到的氧化还原酶GlyDH (30U/mL)、月旨蛋白 脂肪酶(Amano Enzyme Inc.生产，10000U/mL)、作为电子受 体的l -曱氧基-5 -曱基吩嗪硫酸曱酯(以下，也称"m-PMS")(林式会社同仁化学研究所生产，10mM)、羧曱基纤维 素(CMC) ( 0.5质量％)以及表面活性剂Triton X- 100 ( 2质量 %),制备反应层形成用组合物。在隔膜所具有的孔的内部滴加10pL上述制备的反应层形 成用组合物，室温下干燥，形成反应层。进而，在含有10质量。/。TritonX- 1 OO的pH7.0的磷酸緩沖生 理食盐水(PBS)中，溶解三油精(东京化成工业林式会社生 产)，使其浓度为100mg/dL,制备试样溶液。将10(iL所制备的试样溶液滴加到上述反应层中。试样溶液 中的三油精在脂蛋白脂肪酶的作用下，水解为脂肪酸(油酸) 和甘油，该甘油在GlyDH的作用下纟皮氧化。此时，在甘油一皮氧 化的同时，反应层中的电子受体(m-PMS)被还原。对工作电极施加相对于参比电极+150mV的电压，测定电子受体的氧化电流值。测定中使用电化 学测定系统HZ- 5000 (北斗电工生产、HAG1512m/BP )。该氧 化电流(响应电流)的值与还原型电子受体的浓度、即试样中 三油精的浓度成比例。进而，将试样溶液中的三油精的浓度改为300mg/dL和 500mg/dL,除此以外，通过与上述同样的方法测定氧化电流值。 另外，作为对照试样，制备不含有三油精的试样溶液，同样测 定氧化电流值。在图中描绘所测定的氧化电流值，该图在图6 中示出。图6所示的图，其斜率越大，意味着传感器的测定灵敏 度越高。在本实施例中，可得到如图6所示的斜率较大的图。同 时，根据本实施例，可提供灵敏度优异的传感器。 (实施例2-2 )在制备反应层形成用组成物时，不添加表面活性剂Triton X -100，除此以外，通过与上述实施例2-l同样的方法，在传感 器基板上形成隔膜和反应层，进行添加试样溶液后的氧化电流 (响应电流)值的测定。图6示出描绘了所得的结果的图。在本 实施例中，如图6所示，所得到的图的斜率小，但有一定程度的 线性关系。(实施例2-3 )在制备反应层形成用组成物时，用蒸馏水代替磷酸緩冲生 理食盐水使用，除此以外，通过与上述实施例2-l同样的方法， 在传感器基板上形成隔膜和反应层，并进行添加试样溶液后的 氧化电流(响应电流)值的测定。图6示出描绘了所得的结果的 图。在本实施例中，如图6所示，所得到的图的斜率小，但有一 定程度的线性关系。另外，本申请基于2005年3月29日申请的日本专利申请第
2005誦095169号以及日本专利申请第2005國096427号，将它们所 公开的内容，作为参照全体引用。
权利要求
1.一种生物传感器，其具备绝缘性基板；被形成在所述绝缘性基板上的含有工作电极和对电极的电极系统；被形成在所述电极系统的上部或附近的、包含脂蛋白脂肪酶、甘油脱氢酶以及电子受体的反应层，该生物传感器用于基于所述电极系统中流通的电流值来测定中性脂肪的浓度。
2. 根据权利要求l所述的生物传感器，其中，所述电极系 统还包含参比电才及。
3. 根据权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述甘油 脱氢酶是辅酶依赖型的。
4. 根据权利要求3所述的生物传感器，其中，所述辅酶为 吡咯查啉醌或黄素腺噤呤二核苷酸。
5. 根据权利要求l ~ 4中任一项所述的生物传感器，其中， 所述电子受体是选自铁氰化物离子、对苯醌、对苯醌衍生物、 吩。秦硫酸曱酯、吩。秦硫酸甲酯衍生物、亚甲蓝、硫堇、靛蓝胭 脂红、掊花青、碱性藏红、二茂铁及其衍生物、a-萘醌以及a -萘醌衍生物所组成的组中的一种或两种以上。
6. 根据权利要求l ~ 5中任一项所述的生物传感器，其中， 所述反应层还包含表面活性剂以及pH緩沖剂。
7. 根据权利要求6所述的生物传感器，其中，所述表面活 性剂是非离子性表面活性剂。
8. 根据权利要求6或7所迷的生物传感器，其中，所述pH 緩冲剂的pH为6 9。
9. 根据权利要求l ~ 8中任一项所述的生物传感器，其中， 所述反应层还含有亲水性高分子。
10. 根据权利要求9所述的生物传感器，其中，所述亲水性高分子是单宁酸、果胶、酪蛋白、角叉胶、帚叉藻胶、普鲁兰、 胶原、几丁质、壳聚糖、软骨素硫酸钠、木质素磺酸以及它们 的衍生物所组成的组中选择的 一 种或两种以上。
11. 根据权利要求9或10所示的生物传感器，其中，所述的 反应层包括第一反应层，其含有所述电子受体以及所述亲水性高分子、 基本上不含有所述甘油脱氳酶；和第二反应层，其被形成在所述第一反应层的上层，含有所 述甘油脱氢酶和所述亲水性高分子、基本上不含有所述电子受体。
12. 根据权利要求ll所述的生物传感器，其中，在所述第 一反应层与所述第二反应层之间，形成有基本上由所述亲水性 高分子构成的第三反应层。
13. 根据权利要求l ~ 12中任一项所述的生物传感器，其其 特征在于，在所述电极系统的上层形成有具有近似矩形的开口 部的绝缘层，所述对电极从所述开口部露出的面积是所述工作 电极从所述开口部露出的面积的1.2 ~ 3.0倍。
14. 根据权利要求l ~ 13中任一项所述的生物传感器，其 中，还具备用于将所述电极系统与生物传感器外部电导通的引 线部以及连^妻部，构成所述电极系统的材料是在10pm的厚度时具有100n/口 以下的表面电阻值的以碳为主要成分的材料，构成所述引线部 以及所述连接部的材料是在10(im的厚度时具有50mQ/口以下 的表面电阻值的以金属为主要成分的材料。
15. 根据权利要求14所述的生物传感器，其中，所述金属 为选自银、金、铂以及钯所组成的组中的一种或两种以上金属。
16. 根据权利要求3 ~ 15中任一项所述的生物传感器，其 中，所述甘油脱氢酶是在表面活性剂的存在下，通过2价的交联 试剂化学修饰而成的修饰甘油脱氢酶。
17. 根据权利要求16所述的生物传感器，其中，所述甘油 脱氢酶源自属于葡糖杆菌属的细菌。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种不需进行试样的前处理，可迅速并且高精度地从生物试样等试样中测定中性脂肪的浓度的生物传感器。该目的通过一种生物传感器被实现，该生物传感器具备绝缘性基板；被形成在所述绝缘性基板上的含有工作电极和对电极的电极系统；被形成在所述电极系统的上部或附近的、包含脂蛋白脂肪酶、甘油脱氨酶以及电子受体的反应层，该生物传感器用于基于所述电极系统中流通的电流值来测定中性脂肪的浓度。
文档编号G01N27/327GK101151526SQ200680010499
公开日2008年3月26日 申请日期2006年3月27日 优先权日2005年3月29日
发明者山田正之, 村濑博宣, 桑原基晶 申请人:Cci株式会社;究极酵素国际股份有限公司