专利名称：：一种检测人源化抗cd52抗体生物活性的方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及到一种检测抗体生物活性的方法。
背景技术：
：CD52又称CAMPATH-1抗原，该抗原表达于正常及恶性的B和T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织，是一种存在于B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的抗原。针对CD52抗原的单克隆抗体在体内可以暂时清除血液内的淋巴细胞，使免疫系统处于失效状态，使器官移植入患者体内，不会遭到患者免疫系统的排斥，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致抗体依赖性溶解细胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响细胞中的恶性淋巴细胞。抗CD52单克隆抗体(CAMPATH-1系列)已经被广泛地用于临床治疗，此抗体为人源化抗CD52抗体，于2001年5月7日获得美国FDA批准上市，适应症为"烷化剂及氟达拉宾治疗无效的慢性B淋巴细胞性白血病"。人源化抗CD52抗体为IgGl亚型，具有人类抗体可变区的框架区、恒定区，以及来源于大鼠单克隆抗体(Campath-1G)的互补决定区。人源化抗CD52抗体的分子量约为150kD。对于抗体生物活性的检测方法通常有两类，一为基于结合某种类型的抗原(对于CD52抗体，为CD52抗原)上，而后再检测所结合的抗体的方法(ELISA，ADCC，CDC)，另一为已知浓度的标记抗体竞争结合(对于CD52抗体，为利用CD52表达的外周血单个核细胞或细胞系)的方法。上述方法存在着许多诸如利用合成的CD52抗原，合成的抗原与天然抗原相比亲和力较低，因此检测方法的灵敏度较差；利用天然的CD52抗原，来源困难(人类脾脏)，不同来源的抗原有很大的差异，纯化的抗原有聚集的趋势；利用抗CD52独特型抗体代替CD52抗原，检测的灵敏度低，或与血清Ig有不可避免的交叉反应;利用新鲜外周血单个核细胞，不同供者间CD52表达的差异，病毒污染，难以获得均一的足够量的一大批；其他膜抗原的差异导致的非特异结合；利用CD52阳性的细胞系，Fc受体导致的假阳性，检测灵敏度较差；ADCC或CDC方法，同位素的使用使可操作性下降，检测的灵敏度及精密度较差等问题。
发明内容为了得到长期传代稳定、密度均一的而且细胞膜表面稳定表达CD52抗原细胞的CD52阳性细胞，本发明的申请人进行了大量实验，得到了符合此要求的CD52阳性细胞CHO-C，并建立了利用此细胞对人源化抗CD52抗体生物活性进行检测的方法。本发明的目的之一是公开一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法，包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用CD52阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的CD52阳性细胞为CHO-C细胞。上述检测方法的主要原理为转染CD52的CHO-C细胞，其细胞膜表面表达CD52，抗CD52抗体可与CD52特异结合。单纯研究荧光标记抗体与细胞的结合的情况，量效曲线应为"S"形，即随着标记抗体浓度的增加，荧光强度也逐渐增加，直至达到饱和；此时的IC5。可代表该抗体与CD52的结合活性，在靶细胞相同的情况下，IC5。值越小，抗体与CD52的结合能力就越强，即抗体的活性越好。若存在未标记抗体对标记抗体的竞争，在荧光标记抗体浓度固定(结合曲线的亚饱和点)的条件下，随着加入的未标记抗体浓度的增加，细胞结合的荧光标记抗体量逐渐减少，因此量效曲线呈反"S"形或"乙"字形；在靶细胞和标记抗体相同的条件下，IC5。值越小，则说明加入的未标记抗体与标记抗体竞争的能力越强，与CD52的结合能力越强，即抗体的活性越好。本发明的另外一个目的，是公开了上述的CHO-C细胞，通过人CD52cDNA的获取、表达载体构建、转染CHO细胞及筛选获得；其中人CD52cDNA的获取和表达载体构建过程包括引物序列的设计、人CD52特异片段的获得及将该片段装入表达载体。本发明进一步公开了得到上述的CHO-C细胞需要的引物序列有义引物5，-CAAGCTTCACCATGMGCGCTTCCTCTTCCTC-3，(SEQIDNO.1)反义引物5，-C|GAATTC|TCAACTGAAGCAGAAGAGGTG-3，(SEQIDNO.2)该对引物在互补区两侧分别加入了酶切位点用于装入表达载体。本发明还公开了CHO-C细胞的表达载体，可以为pcDNA3.1、pcDNA4、pCEP4、pREP4之一，优选pcDNA3.1。本发明公开的转染了人CD52基因的CHO细胞经过荧光染色法和免疫组化法进行了鉴定，通过荧光染色法鉴定结果表明CHO-C细胞被标记后，可以使染色荧光强度的峰明显右移，即FITC-rhCD52mAb可以使CH0-C染色；通过免疫组化法鉴定结果表明转染CD52的CHO-C细胞，可被抗CD52抗体染色，抗原位于细胞膜表面。本发明的申请人对本发明公开的检测方法中利用的CHO-C细胞在体外连续传代培养，3个月(隔天传代，共计传45代)后进行CHO-C细胞的鉴定实验，荧光染色法、CH0-C细胞的鉴定实验，免疫组化法以及RT-PCR测定细胞中CD52mRNA的含量，与构建之初比较，没有显著差异。证明了本发明公开的CHO-C细胞不仅具有细胞膜表面稳定表达CD52抗原，长期传代对CD52的表达几无影响的优点，还具有荧光标记抗CD52抗体染色CV值较小，细胞表面表达CD52的密度均一和细胞膜表面CD52密度较高，从而使荧光抗体染色时具有较高的灵敏度的优点。本发明还公开了利用上述的CH0-C细胞来进行人源化抗CD52抗体生物活性检测的详细步骤，包括1.用PBSS分别稀释参比品和待测样品到一定浓度；2.用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人源化抗CD52单抗(以下简称FITC-anti-CD52MAb)继续稀释参比品和待测样品的稀释液；3.将对数生长期的CHO-C细胞，细胞悬液分至流式专用管中；4.将2得到的序列稀释液加入3中，并设相应对照组；上机检测，计算结果。更具体地，其步骤如下1.取一支分装的参比品，用PBSS稀释至2000(ig/ml，每次稀释倍数不超过10倍，加入等体积20吗/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)。2.根据待测定样品的蛋白定量，用PBSS稀释至2000吗/ml，每次稀释倍数不超过10倍，加入等体积20ng/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)。3.分别在离心管中用lOpg/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)连续2倍比稀释工作参比品或样品的稀释液。4.取对数生长期的CH0-C细胞，计数，每次测活(1个样品及工作参比品)取约107个细胞，离心弃上清，加入PBSS调整细胞密度至lxl07ml，然后将细胞悬液分至流式专用管中，0.lml/管。5.500g离心5分钟弃上清。6.将待测样品及工作参比品的序列稀释液加入步骤5的流式管中，O.lml/管，每一浓度设2复管，另外设3组对照，①只加50叫/ml的FITC-anti-CD52MAb为空白对照，②加入50^ig/mlFITC-anti-CD52區b及50(^ig/ml同型抗体的细胞悬液为阴性对照，(D只加入PBSS的细胞悬液类似于阳性对照，每组对照设2复管。冰浴避光45分钟。7.PBSS洗涤细胞两次，500g离心5分钟，重悬于300iilPBSS中。8.上机检测。待测人源化抗CD52抗体生物活性可以通过下式计算得到比活性(％)=参比品IC500ig/ml)+待测品IC50Qig/ml)x100。比活度为参比品的75-125%。上机检测步骤包括1.开机后进入CELLQUEST⑧操作软件；2.选择"ACQUIRE"菜单中的"ACQUIRE&STOREAGE"项目，设细胞数目截止数为10,000，储存参数为FSC(lin)、SSC(lin)及FL1-H(lin);3.设定文件名及储存位置；4.在"CYTOMETER"菜单中选择"DETECTORANDAMP";5.打开DDM开关，设在FL-1上；6.分别取测量图①散点图，参数FSC/SSC，NoGate，设R1，显示1000个细胞；测量图②直方图，参数FL1(FITC荧光)，G1-R1，显示1000个细胞；7."阈值"调至FL1，设定值为20;8.上阴性对照样品后进行增益调整先将FSC及SSC调整使细胞分布于测量图1的中心偏左下位置，调整R1将细胞的主群包括；然后调整FL1的增益使图2的主峰值位于10以内；9.使用同样参数进行待测样品检测。本申请中所述的上机检测步骤均按上述步骤进行。结果分析在€611(^]￡8丁@操作软件中打开测量的数据，设图(!):散点分析图，乂轴？8(:，Y轴SSC，设R1选取其中最集中的细胞区域。再设图②直方分析图，参数为FL-1H，GATE1=R1，设定适当的Y轴值，然后选取该图，统计分析FL1的几何均数，在FILE菜单项中选取"Saveas"将该图另存为为FCS文件。采用分析软件Origin6.0将测定结果拟合标准曲线，横坐标为标准品或待检测样品的浓度(对数坐标)，纵坐标为FL-1H(即流式细胞术测定结果，算数坐标)，因曲线为反"S"形，因此选用4参数方程回归模型。该软件给出的回归方程为7=-尉/+f^7C」"+S根据该方程，X-十①时，Y=B，即最高限；当乂=0时，Y=A，即最低限；而当X=C时，Y=(A+B)/2，即半数有效。因此C的数值即为半数有效浓度(IC50)。待测人源化抗CD52抗体生物活性可以通过下式计算得到比活性(％)二参比品IC50()ig/ml)+待测品IC500ig/ml)x100。-附图l:人CD52DNA序列电泳图，A为PCR产物，B为表达产物酶切后得到的片段；附图2:rhanti-CD52MAb与参比品竞争结合试验拟合曲线；附图3:转染前后CH0细胞表达CD52抗原的检测情况(荧光染色法)，左侧峰为未转染的CHO细胞，右侧峰为转染后的CHO-C细胞；附图4:直接法染色结果(免疫组化法)40x，上图为阴性对照CHO细胞，下图为本发明公开的CHO-C细胞。具体实施例方式以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。IgGi/k亚型的同型对照抗体重组抗CD52人源化单抗按中国发明专利申请号02155174.x中公开的内容制备得到，利用通用的基因工程方法得到的重组抗CD52人源化单抗也在本发明所述的重组抗CD52人源化单抗之列。FITC-anti-CD52Mab:市售异硫氰酸荧光素FITC(Ameresco公司)与按上述发明公开内容制备得到的的抗CD52单抗，通过透析法标记获得。PBSS为含1%NBS的PBS除非特别说明，原料均为市售流式细胞仪美国BectonDickinson公司FACScan实施例1:CHO-C细胞的构建1.人CD52cDNA的获取和表达载体构建我们设计了引物序列有义弓!物5'-C|AAGCTT|CACCATGAAGCGCTTCCTCTTCCTC-3'(SEQ工DNO.1)反义弓l物5'-C|GAATTC|TCAACTGAAGCAGAAGAGGTG—3'(SEQIDNO.2)该对引物在互补区两侧分别加入了酶切位点用于装入表达载体采用常规的RT-PCR法从人外周血RNA提取物中获得人CD52cDNA的基因序列即抽取正常人外周血10ml，Ficoll(北京鼎国生物技术公司)密度梯度离心法分离单个核细胞，以Trizol试剂盒(GIBCO公司)抽提总RNA，RT-PCR试剂盒(INVITROGEN公司)进行逆转录PCR，获得约200bp的特异性片段。以胶回收试剂盒回收该片段，连入T载体(T4DNA连接酶16"C连接过夜)，转化TGI感受态菌，涂LB板(AMP+、IPTG+X-gal)，37度孵育12小时。挑白色克隆2个，LB培养液(AMP+)中37。C培养8小时。抽提质粒，测序结果显示，与报道中公开的人CD52的cDNA序列和编码氨基酸序列(CD52(CAMPATH-1)，G.//AL￡，JBiolRegulHomeostAgents2001;15:386-91)完全一致。将该片段切下回收，T4DNA连接酶连入pcDNA3.l表达载体并进行鉴定。以^'/7dlI和5boyI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示酶切片段大小正确，该片段正确装入了表达载体。PCR产物和表达载体的酶切片段电泳图详见附图12.人CD52转染CH0细胞及筛选采用脂质体法转染CH0细胞，加入lmg/ml的G418作为筛选剂，每3-4天更换含有筛选剂的培养基一次。2周后，大部分细胞死亡、脱落。用克隆环挑选中等大小的活细胞集落至24孔板中，共筛选24个集落。细胞在24孔板中继续培养扩增，待细胞长至80%满时，消化传代细胞的同时，取一半细胞进行免疫荧光染色。染色方法一抗加入rhCD52mAb(终浓度l|_ig/ml)，二抗加入1:100稀释的FITC标记羊抗人IgG抗体。对照细胞为未转染的CH0细胞。结果从24个克隆中挑选出一个荧光染色最强的细胞克隆。待将该细胞继续扩增的同时，使其适应无血清培养基并成为悬浮生长。将该细胞命名为CH0-C细胞。此细胞适用无血清悬浮培养，ExCell325PF(JRH)培养液传代培养于100mL摇瓶中，37°C，5°/QC02，饱和湿度条件下培养。实施例2:生物活性测定实验1.取一支分装的参比品(Campath-1，Genzyme公司产品)，用PBSS稀释至200(^g/inl，每次稀释倍数不超过10倍，加入等体积20|ag/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)。2.依待测样品(即rhCD52mAb按中国发明专利申请号02155174.X中公开的内容制备得到)的蛋白定量，用PBSS稀释至200(^g/ml，每次稀释倍数不超过10倍，加入等体积20|ig/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)。3.分别在离心管中用10|ig/ml的FITC-anti-CD52MAb(PBSS稀释)连续2倍比稀释工作参比品或样品的稀释液。4.取对数生长期的CHO-C细胞，计数，每次测活(1个样品及工作参比品)取约107个细胞，离心弃上清，加入PBSS调整细胞密度至lxl07ml，然后将细胞悬液分至流式专用管中，0.lml/管。5.500g离心5分钟弃上清。6.将待测样品及参比品的序列稀释液加入步骤5的流式管中，O.lml/管，每一浓度设2复管，另外设3组对照，①只加50pg/ml的FITC-anti-CD52MAb为空白对照，②加入50吗/mlFITC-anti-CD52MAb及50(ig/ml同型抗体的细胞悬液为阴性对照，(D只加入PBSS的细胞悬液类似于阳性对照，每组对照设2复管。冰浴避光45分钟。7.PBSS洗涤细胞两次，500g离心5分钟，重悬于300(ilPBSS中。8.上机检测。结果见表1-表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>依上述结果绘制rhanti-CD52MAb与参比品竞争结合试验拟合曲线，见附图2按
发明内容中的结果分析进行计算，得到rhCD52mAb与参比品的IC50值分别为8.1804(ig/ml及8.09525|_ig/ml，故待检测样品的相对生物活性为8.09525/8.1804*1000/。二98.96%。实验例实验例lCHO-C细胞的鉴定实验荧光染色法参照《现代免疫学实验技术》CH0-K1细胞(ATCCCCL-61)与本发明的CHO-细胞进行比较，标记后，可以使CHO-C细胞染色荧光强度的峰明显右移，即FITC-rhCD52mAb可以使CHO-C染色，即说明CHO-C细胞表面表达CD52，未转染的CH0-K1细胞表面则无表达。结果详见附图3实验例2CHO-C细胞的鉴定实验免疫组化法参照《现代免疫学实验技术》将CHO-C细胞涂片，以未转染CD52的CHO细胞为对照，进行直接法染色，结果显示，转染CD52的CHO-C细胞，可被抗CD52抗体染色，抗原位于细胞膜表面。结果详见附图4实验例3CHO-C细胞的稳定性实验CHO-C细胞在体外连续传代培养，3个月(隔天传代，共计传45代)后进行CHO-C细胞的鉴定实验荧光染色法、CHO-C细胞的鉴定实验免疫组化法以及RT-PCR测定细胞中CD52m脂A的含量，与构建之初比较，没有显著差异。序列表SEQUENCELISTINGSEQ.IDNO.l<110>上海国健生物技术研究院<120>—种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法<130>CD52(CAMPATH-1),G.HALE，JBiolRegulHomeostAgents2001;15:386-91<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400〉1caagcttcaccatgaagcgcttcctcttcctc32SEQ.IDNO.2<210>2<211>28<212>DNA<213〉人工序列<400>2cgaattctcaactgaagcagaagaggtg28权利要求1.一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法，此方法包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用CD52阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的CD52阳性细胞为CHO-C细胞。2.权利要求1所述的CHO-C细胞，通过人CD52cDNA的获取、表达载体构建、转染CH0细胞及筛选获得；其中人CD52cDNA的获取和表达载体构建过程包括引物序列的设计、人CD52特异片段的获得及将该片段装入表达载体。3.权利要求2所述的CHO-C细胞，其有义引物序列如SEQIDNO.1所示，反义引物序列如SEQIDN0.2所示。4.权利要求2所述的CHO-C细胞的表达载体，可以为pcDNA3.1、pcDNA4、pCEP4、pREP4之一。5.权利要求4所述的CH0-C细胞的表达载体，为pcDNA3.1。6.权利要求1所述的检测方法，包括1.用PBSS分别稀释参比品和待测样品到一定浓度；2.用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人源化抗CD52单抗继续稀释参比品和待测样品的稀释液；3.将对数生长期的CHO-C细胞，细胞悬液分至流式专用管中；4.将2得到的序列稀释液加入3中，并设相应对照组；上机检测，计算结果。全文摘要本发明公开了一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法，此方法包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用CD52阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的CD52阳性细胞为CHO-C细胞。本发明使用的CHO-C细胞具有灵敏度高、稳定性好的优点。文档编号G01N33/577GK101201358SQ200610147289公开日2008年6月18日申请日期2006年12月14日优先权日2006年12月14日发明者盛侯,庚寇,李博华,皓王,郭亚军申请人:上海国健生物技术研究院