检测基因甲基化的利记博彩app

专利名称：检测基因甲基化的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及探询甲基化基因的用途，例如用于细胞增殖性疾病(如癌症)的诊断和预后分析。相关的基因包括谷胱甘肽S-转移酶(GSTP1)基因或其部分。
背景技术：
在高等真核生物中，只在位于CpG二核苷酸的鸟苷5’的胞嘧啶上发生DNA甲基化。这种修饰对于基因表达具有重要的调控作用，特别是当涉及到位于基因启动子区的CpG丰富区域(CpG岛)。在永生化和转化细胞中，正常未甲基化CpG岛经常发生异常甲基化而且这种异常甲基化与某些肿瘤抑制基因或改善某些人类癌症相关的基因的转录失活有关。
谷胱甘肽S-转移酶(GST)催化细胞内解毒反应，它通过催化谷胱甘肽与具有化学活性的亲电子基结合使亲电子致癌物失活(C.B.Pickett，等，Annu.Rev.Blocbern.，58743，1989；B.Coles，等，CRC Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，2547，1990；T.H.Rushmore，等，J.Biol.Chem.26811475，1993)。人GST由不同的基因座中某些不同的基因编码，分为α、μ、π和θ四个家族(B.Mannervik，等，Biochem.J.，282305，1992)。许多人类癌症如前列腺癌和肝癌表现为GSTP1表达水平相对于它们的源组织减少。
在前列腺癌的情况下，具体地说，设计可区别良性前列腺增生和前列腺癌的甲基化特异性PCR(“MSP”)的引物和探针是很复杂的。如果研究者设定检测为100％特异性，所公开的最好的引物/探针组一般最高达到75％的灵敏度；而如果研究者设定检测为100％灵敏度，则其特异性不足60％。用新的引物和探针组合可以得到更稳定可靠的测定法。本发明就实现了这一需求。

发明内容
在本方明的一个方面中，用于检测受试者的前列腺组织或其它样本中的细胞增殖性疾病的方法，包括使扩增和检测某些基因的超甲基化区域中使用的试剂接触细胞成分。
在本发明的另一方面中，至少一种所述的超甲基化基因是可联合一种或多种其它基因而测定的GSTP1。
在本发明的另一方面中，怀疑含甲基化靶序列的核酸样本可从生物样本中获得，用引导部分靶序列的试剂来处理样本，扩增核酸靶，并且与已知正常样本比较扩增样本的甲基化程度。在本发明的另一方面中，对不太可能甲基化的序列进行了扩增和检测，以与扩增的甲基化序列进行比较。
在另一方面中，本发明提供了用于检测细胞增殖性疾病的方法。这种方法通过扩增基因来完成，其中所述基因的甲基化状态是细胞增殖性疾病的指示物。检测方法可以包括用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂接触含有核酸的样品或生物流体、用区别修饰的甲基化和未甲基化核酸的寡核苷酸引物或引导序列来扩增样品的核酸、以及根据扩增期间有无扩增产物来检测甲基化核酸。
本发明的方法包括确定样本甲基化比率。甲基化比率是指在疾病状态下超甲基化的标志物(或标志物的区域)的甲基化水平相对于同样条件下未超甲基化的标志物的甲基化水平的比值(或者相对于同样条件下未超甲基化的相同标志物的区域)。当通过在疾病状态下超甲基化标志物的甲基化与另一个未超甲基化标志物的甲基化的比较来确定甲基化比率时，第二个标志物称为参照标志物。
在本发明的另一方面中，通过定量实时PCR来确定甲基化比率。
在本发明的另一方面中，提供了用于诊断和/或预后分析的报道分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测甲基化核酸的试剂盒。试剂盒包括一个或多个容器；第一个容器装有修饰未甲基化胞嘧啶的试剂，第二个容器装有引导扩增含CpG的核酸的试剂，其中该试剂可区分修饰的甲基化和未甲基化核酸。
在本发明的另一方面中，用本发明的方法或试剂盒检测的核酸序列包括启动子或其部分。
在本发明的另一方面中，用于检测某些基因的甲基化部分的方法和试剂盒包括鉴定另外核酸存在的步骤和/或组分。将目的甲基化基因受到处理(例如扩增)影响的程度与其它核酸进行比较，来确定标志物的甲基化程度。


图1是利用现有技术的探针和引物进行MSPCR分析的结果图。
图2是根据本发明用水解探针和引物进行MSPCR分析的结果图。
具体实施例方式
某些基因的超甲基化与前列腺癌发生相关。在本说明书中将含有所述基因或所述基因的部分的核酸序列称为标志物。标志物包括含以下所述的基因或基因的部分的核酸GSTP1(Seq.ID.No.54)、RARB2(Seq.ID.No.57)、RASSF1A(Seq.ID.No.64)、TIMP3(Seq.ID.No.58)、APC(启动子＝Seq.ID.No.59，基因＝Seq.ID.No.60)、β-肌动蛋白(Seq.ID.No.55和56)、PTGS2(启动子＝Seq.ID.No.61，基因＝Seq.ID.No.62)和14-3-3σ(Seq.ID.No.63)。
检测所述超甲基化的鉴定法包括例如MSP和限制性内切酶分析的技术。启动子区是检测所述的超甲基化分析特别值得注意的靶。GSTP1的启动子区的序列分析表明，接近72％的核苷酸是CG，并且约10％的核苷酸是CpG二核苷酸。
本发明提供了在受试者的组织或其它生物样本中确定标志物的某些区域的甲基化状态的方法，其中扩增和检测与增殖性疾病相关的DNA。由于特殊区域(如启动子)的超甲基化常导致标志物编码的蛋白质水平减少(即转录水平降低)，因此期望鉴定所述的区域是否发生超甲基化。在GSTP1基因情况中，这是最常见的。超甲基化区域是那些与正常组织比较，患病组织样本中甲基化达到了统计学上显著更高程度的区域。
针对本发明的目的，使用特异于某些标志物区域的核酸探针或报道分子来检测生物流体或组织中标志物基因甲基化区域的存在。通过例如PCR的技术，基于标志物序列的某些部分的寡核苷酸引物特别适用于扩增DNA。可以使用含可检测量的相关多核苷酸的任何样品。本发明优选的样品为泌尿生殖源组织，特别是前列腺组织。样本优选包括上皮细胞。
本发明一些引物/探针或报道分子试剂被用来检测标志物基因表达控制序列的甲基化。这些是调控核酸序列转录、有时也调控翻译的核酸序列。因而，表达控制序列可包括如下序列启动子、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、可使mRNA准确翻译的维持正确基因读框的序列及终止密码子。
GSTP1启动子是有用的标志物的典型表达控制序列。它是能指导基因转录产生谷胱甘肽S-转移酶蛋白的多核苷酸序列。启动子区位于结构基因上游或5′位。它包括足以使得启动子依赖型基因表达对于细胞类型特异性、组织特异性都是可控制的、或者对于外部信号或试剂是诱导的一些元件；所述的元件可位于多核苷酸序列的5′区或3′区。
本发明的一种方法包括用结合核酸的试剂接触含标志物的靶细胞。靶细胞的成分为核酸，例如DNA或RNA。试剂包括探针和引物(如PCR或MSP引物)或被设计成用于扩增和检测靶序列的其它分子。例如，试剂可包括结合或键合它们自身报道分子片段的引导序列，如称为Scorpion试剂或Scorpion报道分子的试剂，参见Whitcombe等人的美国专利6,326,145和6,270,967(此处全部引用作为参考)所述。虽然它们描述不同，但用于本说明书中的“引物”和“引导序列”术语是指引导核酸序列扩增的分子或其部分。
一种检测甲基化模式的敏感方法包括联合使用甲基化敏感酶与聚合酶链反应(PCR)。在DNA经过酶消化后，只有甲基化抑制DNA裂解，那么位于限制性酶切位点两侧的引物才能进行PCR扩增。根据来源于GSTP1转录起始位点的M24485(Genbank)基因组位点数，本发明设计的PCR引物的典型靶区域包括位于约-71和+59bp的区域两侧的引物。
本发明的方法也包括用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂来接触含核酸的样品；利用CpG特异性寡核苷酸引物来扩增样品中含CpG的核酸；并且检测甲基化的核酸。优选的修饰是将未甲基化的胞嘧啶转化成可区分甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶的另一种核苷酸。优选地，修饰未甲基化的胞嘧啶使之转变为尿嘧啶的试剂是亚硫酸氢钠，然而也可用修饰未甲基化胞嘧啶、而不能修饰甲基化胞嘧啶的其它试剂。亚硫酸氢钠(NaHSO3)修饰是最优选的，并易与胞嘧啶的5，6-双键发生反应，但不易与甲基化的胞嘧啶发生反应。胞嘧啶与亚硫酸氢根离子发生反应生成磺化胞嘧啶反应中间体，易脱氨基形成磺化尿嘧啶。磺酸酯基团在碱性条件下去除最终形成尿嘧啶。在PCR过程中，Taq聚合酶将尿嘧啶识别为胸腺嘧啶，得到的产物仅仅在起始模板中5-甲基胞嘧啶存在的位置上含有胞嘧啶。相似地，Scorpion报道分子，试剂及其它检测系统也是用这种方式处理来区别未修饰和修饰的样本。
修饰(如用亚硫酸氢盐)后，本发明中用于扩增样品中含CpG核酸的引物，可特异性区别未处理的DNA、甲基化和未甲基化DNA。在甲基化特异性PCR(MSPCR)中，未甲基化DNA的引物和引导序列优选在3′CG碱基对中有T碱基，以此来区别在甲基化DNA中残留的C，并且用互补序列设计得到反义引物。由于在有义引物中缺少C而反义引物中没有G，所以未甲基化DNA的MSP引物或引导序列通常包括相对较少的C或G(C修饰成U(尿嘧啶)，U在扩增产物中变成了T(胸腺嘧啶))。
本发明的引物是具有足够长度和适当序列的寡核苷酸，这种序列在多态性基因座的大量核酸上为聚合反应提供特异性起始。当接触本发明的探针或报道分子时，本发明的引物所扩增的序列显示了甲基化状态和诊断信息。与现有的技术相比，它们更灵敏、更特异。
本发明的引物最优选地是能起始引物延伸产物的合成的、八个或更多的脱氧核糖核酸或核糖核酸，其中它们基本上与多态性基因座链互补。有利于合成的环境条件包括存在核苷三磷酸、适于聚合的试剂(如DNA聚合酶)、合适的温度和pH。为了达到最大扩增效率，引物的引导片段或引导序列优选单链，也可以是双链。如果是双链，在用于制备延伸产物之前首先将其处理以分开链。在诱导聚合的试剂下，引物必须要有足够的长度来引导延伸产物的合成。引物的确切长度取决于如温度、缓冲液和核苷酸组成等因素。优选地根据众所周知的设计方针或规则，寡核苷酸引物最优选地包括约12-20个核苷酸，尽管它们可能包括更多或更少的核苷酸。
本发明的引物设计成基本与待扩增的基因组的基因座的每条链互补，并且还包括如上所述的合适的G或C。这就意味着在适于聚合的试剂情况下，引物必须能足够地与它们各自的链互补以便杂交。也就是说，引物必须与要杂交的序列5′和3′两侧序列足够互补，才能使基因组的基因座得到扩增。
本发明的引物应用于扩增方法。即，相对于所包括的反应步骤数，产生较多数量的靶基因座的反应(优选酶促链式反应)。在最优选的实施方案中，反应产生了指数级更大量的靶基因座。此类反应包括PCR反应。一般地，一条引物与基因座的负(-)链互补，另一条引物与基因座的正(+)链互补。引物与变性核酸进行退火，随后由酶(如DNA聚合酶I的大片段(Klenow))和核苷酸进行延伸，最终形成含有靶基因座序列的新合成的“+”和“-”链。链式反应产物是不连续的核酸双链体，其末端对应于所用特异性引物的末端。
可以使用适当的方式制备本发明的引物，如常规的磷酸二酯和磷酸三酯方法(包括自动方法)。在一种所述的自动化的实施方案中，以二乙基亚磷酰胺作为起始材料，根据Beaucage等人(Tetrahedron Letters，221859-1862，1981)所述进行合成。在美国专利No.4,458,066中描述了在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法。
纯化的及未纯化的任何核酸样品都能用作起始核酸，前提是含有(或疑似含有)包含靶基因座(如CpG)的特异核酸序列。因此，例如，本方法可以使用DNA或RNA(包括信使RNA)。DNA或RNA可以是单链或双链。如果RNA作为模板，应当使用最适于将模板反转录成DNA的酶和/或条件。另外，也可以用两条链分别作为DNA和RNA的DNA-RNA杂交链。也可以使用核酸的混合物，或者可以利用以前使用相似的或不同的引物进行扩增反应所产生的核酸。所扩增的特异核酸序列(即靶基因座)可以是大分子的片段，或者最初也可作为不连续的分子存在以便特异序列构成完整的核酸。
用于检测甲基化CpG的含有核酸的样品可以来自任何来源，如组织(特别是前列腺组织和淋巴组织)、血液、淋巴、尿液和精液，并通过例如Maniatis等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，pp 280，281，1982)所述的多种技术进行提取。
如果提取的样本不纯，在扩增前可以用一定量的试剂处理，该试剂有效开放样本的细胞、流体、组织或动物细胞膜，并且暴露和/或分离核酸链。暴露和分离核酸链的裂解和核酸变性步骤可更易于扩增。
当样本的靶核酸序列含有两条链时，在其作为模板前，必须将核酸链解开。既可作为单独步骤也可与引物延伸产物的合成一起进行解链。使用各种适宜的变性条件，包括物理、化学或酶促方法，来实施解链。一种解链的物理方法包括加热核酸直至使其变性。典型的热变性温度包括温度范围大约80-105℃最多10分钟。通过来自称为解旋酶的一类酶或者具有解旋酶活性的RecA酶，并且在核糖ATP(已知可变性DNA)存在的条件下诱导解链。Kuhn Hoffmann-Berling(CSH-Quantitative Biology，4363，1978)描述了使用解旋酶、适于核酸解链的反应条件。C.Radding(Ann.Rev.Genetics，16405-437，1982)综述了使用RecA的技术。这些技术的改进现在是众所周知的。
不管核酸最初是双链还是单链，当核酸的互补链分开时，分开的链都适于作为用于另外核酸链合成的模板。在允许引物杂交到模板上的条件下进行合成。通常合成在缓冲水溶液中进行，优选在pH7-9，最优选pH约8。优选将摩尔过量(对于基因组核酸，引物∶模板一般为约108∶1)的两个寡核苷酸引物加入含有已解开的模板链的缓冲液中。如果本发明方法用于诊断应用，可能不知道互补链的量，因此无法总是确切地测定相对于互补链的引物量。然而，实际来看，当要扩增的序列存在于复杂的长链核酸混合物中时，所加的引物量通常在摩尔量上要比互补链(模板)过量。优选摩尔量大大过量，以提高本方法的效率。
将足量的脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP以足够量单独加入或与引物一起加入到合成混合物中，并将所得的溶液加热到约90-100℃最多10分钟，优选1到4分钟。在该加热阶段后，溶液冷却到室温，以适于引物杂交。将适当的可实现引物延伸反应的试剂(“用于聚合的试剂”)加入到冷却的混合物中，并在本领域公知的条件下进行反应。如果用于聚合的试剂是热稳定的，也可将该试剂与其他试剂一起加入。该合成(或扩增)反应可以在室温直到用于聚合的试剂不再发生作用的温度下进行。
用于聚合的试剂可以是能实现引物延伸产物合成的任何化合物或系统，优选酶。满足此目的的适宜的酶包括，例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其它可用的DNA聚合酶、聚合酶突变蛋白(mutein)、反转录酶和其它酶，包括热稳定酶(例如，在升到足以导致变性的温度时可进行引物延伸的酶)。优选的试剂是Taq聚合酶。合适的酶会便于以适宜的方式组合核苷酸以形成与每一基因座的核酸链互补的引物延伸产物。通常，合成在每一引物的3′末端开始，并沿着模板链向5′方向进行，直到合成终止，这产生不同长度的分子。然而，使用上面描述的相同方法，用于聚合的试剂也可以是由5′末端起始合成，并朝另一方向进行。
最优选地，扩增方法是PCR。只要通过使用本发明引物的PCR所扩增的甲基化和非甲基化基因座也能相似地通过其它方法扩增，也可使用另外的扩增方法。
通过特异于如Mullis等人的美国专利4,683,195(此处全部引用作为参考)所述的产物的探针或报道分子，扩增产物优选鉴定为甲基化或非甲基化。用于检测多核苷酸的探针和报道分子领域中的进展对于本领域技术人员是众所周知的。任选地，核酸的甲基化模式能够通过其他的技术得以证实，如限制酶消化以及Southern印迹分析。能够用于检测5′CpG甲基化的甲基化敏感型限制性内切酶的实例包括SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、BstUI和BssHII。
本发明最优选的方法包括确定甲基化比率。这可以通过确定获得的标志物扩增得到的甲基化种类的量与扩增的参照标志物或扩增的非甲基化标志物区的量之间的比率而得到。以上最好使用实时定量PCR。当比率高于确定的或预先确定的截止值(cutoff)或阀值，就认为是超甲基化，并显示具有增殖性疾病，如癌症(在GSTP1情况下为前列腺癌)。根据已知方法确定截止值，这些方法至少用于两套样本具有已知疾病状况的样本和具有已知正常状况的样本。本发明的参照标志物也用作内部对照。参照标志物优选是在样本的细胞中组成表达的基因，如β肌动蛋白。
本发明方法和试剂盒可以包括适于多路技术(multiplexing)的步骤和试剂。也就是说，每次能够鉴定多于一种标志物。
由于与标志物相关的基因的转录水平降低经常是表达控制序列(例如启动子序列)的多核苷酸序列和/或特殊元件超甲基化的结果，因此制备了与这些序列匹配的引物。因此，通过在标志物的表达控制区或启动子区中检测特定区域的甲基化，本发明提供了检测或诊断细胞增殖性疾病的方法。用于检测这些区域甲基化的探针适用于所述的诊断或预后方法。下面显示用于检测标志物的优选分子。括号中表示的是标志物基因的简称与所用检测系统的类型。反义仅指的是引物的方向，这样指定是相关于其与相关引物对的另一成员的引物序列。至于基因组DNA，不必是反义的。
SEQ ID NO.1(GSTP1 SCORPION)CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGTSEQ ID NO.2(GSTP1 SCORPION 反义引物)AAAATCCCGCGAACTCCCGCCSEQ ID NO.3(GSTP1 SCORPION)CCCGAACGTCGACCGCTTTCGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGTSEQ ID NO.4(GSTP1 SCORPION 反义引物)AAAATCCCGCGAACTCCCGCCSEQ ID NO.5(GSTP1 SCORPION)CGGCGGGAGTTCGCGGGCGCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGCSEQ ID NO.6(GSTP1 SCORPION 反义引物)CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCSEQ ID NO.7(GSTP1 SCORPION)CGGGAGTTCGCGGGTCCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGCSEQ ID NO.8(GSTP1 SCORPION 反义引物)CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCSEQ ID NO.9(GSTP1 SCORPION)GTGGTTGATGTTTGGGGTATCAACCAC-BHQ-HEG_AATCCCACAAACTCCCACCAACCSEQ ID NO.10(GSTP1 SCORPION 反义引物)GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGTSEQ ID NO.11(GSTP1 SCORPION)ACCCCAGTGGTTGATGTTTGGGGT-BHQ-HEG-AATCCCACAAACTCCCACCAACCSEQ ID NO.12(GSTP1 SCORPION 反义引物)GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGTSEQ ID NO.13(GSTP1 SCORPION)CCCCACAGGTTGGTGGGAGTTTGTGGGG-BHQ-HEG-CCCAATACTAAATCACAACACCAACCACSEQ ID NO.14(GSTP1 SCORPION 反义引物)TGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGASEQ ID NO.15(GSTP1 SCORPION)
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGTSEQ ID NO.16(GSTP1 SCORPION 反义引物)AAAATCCCGCGAACTCCCGCCSEQ ID NO.17(GSTP1 SCORPION)CGCACGCCGAACGTCGACCGCAAACGTGCG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGTSEQ ID NO.18(GSTP1 SCORPION 反义引物)AAAATCCCGCGAACTCCCGCCSEQ ID NO.19(GSTP1 SCORPION)CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCG BHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTGSEQ ID NO.20(GSTP1 SCORPION反义引物)GCCCCAATACTAAATCACGACGSEQ ID NO.21(GSTP1 SCORPION)CCGACGCACAAAAAAACACCCTAAAATCCGTCGG-BHQ-HEG-GGTTAGTTGTGTGGTGATTTTSEQ ID NO.22(GSTP1 SCORPION反义引物)CACAACACCAACCACTCTTCSEQ ID NO.23(GSTP1 TAQMAN引物)CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGCSEQ ID NO.24(GSTP1 TAQMAN引物)ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTASEQ ID NO.25(GSTP1 TAQMAN探针)TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGASEQ ID NO.26(RARB2 SCORPION)GCCGCCGTCGAGAACGCGAGCGGGCGGC-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAACSEQ ID NO.27(RARB2 SCORPION 反义引物)GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGTSEQ ID NO.28(RARB2 SCORPION)CGGCAGGATTGGGATGTCGAGCTGCCG-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAACSEQ ID NO.29(RARB2 SCORPION 反义引物)GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGTSEQ ID NO.30(RASSF1A SCORPION)GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACGSEQ ID NO.31(RASSF1A SCORPION 反义引物)GCGTTGAAGTCGGGGTTCSEQ ID NO.32(TIMP3 SCORPION)GCGGCGAGTTCGGGTTGTAGCGCCGC-BHQ-HEG-CGCCTCTCCAAAATTACCGTACSEQ ID NO.33(TIMP3 SCORPION 反义引物)GCGTCGGAGGTTAAGGTTGTTSEQ ID NO.34(APC SCORPION)GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCASEQ ID NO.35(APC SCORPION 反义引物)GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAGSEQ ID NO.36(ACTIN SCTORPION)
GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACGSEQ ID NO.37(ACTIN SCORPION 反义引物)CGACCCGCACTCCGCAATSEQ ID NO.38(ACTIN SCORPION)CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGG-BHQ-HEG-GGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTGSEQ ID NO.39(ACTIN SCORPION 反义引物)AACACACAATAACAAACACAAATTCACSEQ ID NO.40(ACTIN SCORPION)CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTGTGGTTSEQ ID NO.41(ACTIN SCORPION 反义引物)CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACCSEQ ID NO.42(ACTIN SCORPION)CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGTTTTTSEQ ID NO.43(ACTIN SCORPION 反义引物)ACATACAACAATCAATAACATAAAACCACSEQ ID NO.44(PTGS2/COX2 SCORPION)CACGCCGCCGTATCTAGGCGTG-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGASEQ ID NO.45(PTGS2/COX2 反义引物)GCAAAAAATCCCCTCTCCCGCSEQ ID NO.46(PTGS2/COX2 SCORPION)GCCGCGCACAAATTTCCGCGGC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCGSEQ ID NO.47(PTGS2/COX2 反义引物)CCCGAATTCCACCGCCSEQ ID NO.48(PTGS2/COX2 SCORPION)GGCGGAACGCACAAATTTCCGCC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCGSEQ ID NO.49(PTGS2/COX2 反义引物)CCCGAATTCCACCGCCSEQ ID NO.50(PTGS2/COX2 SCORPION)TGCCGCCGCCGTATCTAATGGCGGCA-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGASEQ ID NO.51(PTGS2/COX2 反义引物)GCAAAAAATCCCCTCTCCCGCSEQ ID NO.52(14-3-3 SCORPION)CGGCCTTCGCTCTTCGCAAAAGGCCG-BHQ-HEG-GGTAGTTTTTATGAAAGGCGTCGTGSEQ ID NO.53(14-3-3 反义引物)CTAACCGCCCACCACGTTBHQ＝Black Hole 猝灭剂(BioSearch Technologies，San Fransisco，CA)HEG＝六甘醇本发明的试剂盒可用多种成分构造，前提是它们都至少含有本发明的一种引物或探针或检测分子(如Scorpion报道分子)。在一个实施方案中，试剂盒包括用于扩增和检测超甲基化标志物片段的试剂。任选地，本试剂盒包括从样本中提取核酸的样本制备试剂和/或物品(例如试管)。
在优选的试剂盒中，包含一管MSP所必需的试剂，如对应的PCR引物组、热稳定DNA聚合酶(如Taq聚合酶)以及适当的检测试剂(如水解探针或分子信标)。在任选的优选试剂盒中，检测试剂为Scorpion报道分子或试剂。检测试剂也可以用单独的染料引物或对双链DNA特异的荧光染料，如溴化乙锭。优选引物的量产生高浓度。试剂盒中的额外材料包括适宜的反应管或小瓶，屏障成分，一般是蜡珠，任选地包含镁；必需的缓冲液和试剂，如dNTPs；对照核酸和/或任何额外的缓冲液、化合物、辅因子、离子组分、蛋白质和酶、聚合物以及在MSP反应中所用到的其它成分。或者，试剂盒包括核酸提取试剂和材料。
实施例实施例1比较例根据文献中的引物和探针设计了水解探针分析法，并针对用于检测具有临床局限性疾病的患者的前列腺癌的定量分析。本分析法包含用于区别肿瘤性和非肿瘤性前列腺组织的核心CpG启动子区。
以下是本设计所测验的引物和双标记水解探针序列正向引物GSTP1；(-192)MU17 AGTTGCGCGGCGATTTC(Seq.IDNo.65)反向引物GSTP1；(-74)ML22 GCCCCAATACTAAATCACGACG(Seq.ID No.20)探针(5′FAM/3′TAMRA)GSTP1；(-152)MP23CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG(Seq.ID.No.66)在12个良性前列腺增生(BPH)的样本、12个临床局限性前列腺癌(肿瘤)样本以及2个正常样本中分析GSTP1甲基化水平。数据结果用检测到的GSTP1的总拷贝数表示，见图1所示。将截止值定为良性样本展示的最高拷贝数时，对于检测前列腺癌，分析法显示了75％的灵敏性。在良性前列腺增生症和临床局限性前列腺癌的前列腺组织中，GSTP1甲基化分布水平是，这表明这种鉴定法需要用另外标志物补充才能是中等的临床相关的。
实施例2(根据本发明的水解探针鉴定法)为了进一步提高GSTP1分析法的灵敏性和特异性，设计了MSP引物和探针，并对实施例1中的相同样本进行检测。该设计定位在CpG岛的更下游处，包含部分核心启动子区和外显子1。本实施例测试所用的引物和双标记水解探针序列如下正向引物(-71)MU29 CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC(Seq.ID No.23)反向引物(+59)ML25 ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA(Seq.IDNo.24)探针(5’FAM/3’TAMRA)GSTP1；(-23)MP26TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA(Seq.ID No.25)数据结果用检测到的GSTP1的总拷贝数表示，见图2所示。当截止值定为良性样本展示的最高拷贝数时，对于检测前列腺癌，该分析法显示了100％的敏感性和100％的特异性。
GSTP1的1.5kb CpG岛范围为从启动子到外显子3，并具有广泛的甲基化。两个转录结合位点AP1和SP1刚好位于外显子1上游，由于SP1中CpG的含量很高，AP1和SP1是本实施例中所用探针和引物设计的焦点。此区经证明是分析设计的一个很好的区域，这是因为转录因子和结合在AP1和SP1位点的甲基-CpG结合蛋白质之间会进行竞争，以诱导染色质凝缩和基因沉默。
实施例3Scorpion MSP设计用于以下标志物和参照标志物的Scorpion试剂Seq.ID No.19，20(GSTP1)Seq.ID No.38，39(肌动蛋白)Seq.ID No.28，29(RARB2)Seq.ID No.30，31(RASSF1A)Seq.ID No.32，33(TIMP3)Seq.ID No.34，35(APC)
Seq.ID No.50，51(PTGS2)Seq.ID No.52，53(14-3-3σ)使用Oligo6引物设计软件(Molecular Biology Insights，Cascade，CO，美国)和Visual OMP(DNA Software，Inc.，120West Washington Street AnnArbor，MI，美国)对设计物测试其二级结构和不适当的二聚体形成。使用DNAmfold程序(http://bioinfo.math.rpi.edu/～mfold/dna/forml.cgi)和Visual OMP(DNA Software，Inc.，120West Washington Street Ann Arbor，MI，美国)对Scorpion折叠和扩增子探测进行了模拟。使用标准的亚磷胺化学法(Scandinavian Gene Synthesis AB，Koping，瑞典)和Biosearch Technologies(Novato，CA，美国)，在自动DNA合成仪上合成Scorpion和引物。
实施例3 Scorpion试剂测试实施例2中所述的试剂在多种人类DNA样本上进行测试。这些样本包括商用的甲基化(鸟嘌呤前面的所有胞嘧啶都在第5位甲基化)和非甲基化的人类基因组DNA(Chemicon，Temecula，CA，美国)，它们分别作为正和负模板。来自人乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系HCT116的基因组DNA也分别用作GSTP1甲基化的阳性对照和阴性对照(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，美国)。
使用商用的亚硫酸氢钠转换试剂盒(Zymo Research，Orange，CA，美国)修饰基因组DNA。这种处理将非甲基化DNA中的所有胞嘧啶都转换为尿嘧啶，然而在甲基化DNA中只有不位于鸟嘌呤前方的胞嘧啶才转换为尿嘧啶。所有位于鸟嘌呤前的胞嘧啶(在CpG二核甘酸中)仍是胞嘧啶。
在25μl反应体系中扩增亚硫酸氢钠修饰的基因组DNA(100-150ng)，反应体系包括以下组分67mM Tris pH8.8，16.6mM(NH4)2SO4，6.7mM MgCl2，10mM β-巯基乙醇；dATP、dCTP、dGTP、dTTP各1.25mM，1U Hot start TaqDNA聚合酶，250nM Scorpion探针，250nM反向或正向引物(取决于scorpion设计)，625nM钝态参照染料，ROX(仅仅用于ABI7900)。
然后在ABI 7900HT序列检测系统和/或Cepheid SmartCyclerPCR仪中使用定量实时PCR方法测试样本。
PCR条件如下ABI 7900运行条件
95℃5分钟；然后40循环的95℃30秒、59℃30秒和72℃30秒；最后在72℃延伸5分钟。每次循环在59℃时收集光数据。
Cepheid smart cycler运行条件95℃60秒；然后40循环的95℃30秒、59℃30秒，最后在72℃延伸5分钟。每次循环在59℃时收集光数据。
Scorpion试剂显示的PCR效率为当用GSTP1试剂时为91.2％；当用肌动蛋白试剂时为95.2％。Ct平均值为GSTP1 28β肌动蛋白30APC 29TIMP3 30RASSF1A 29RARB2 29PTGS2 3314-3-3S 32实施例4分子信标比较得到的分子信标用于检测沿实施例1中所述基因部分的GSTP1超甲基化。这些信标用于对包含实施例2中所述的样本的PCR反应。在每种情况中，分别对β肌动蛋白进行共扩增以获得甲基化比率。在检测甲基化GSTP1 DNA和非甲基化的β肌动蛋白DNA时，GSTP1和β肌动蛋白Scorpion探针-引物组合显示了更好的性能。用于所设计的Scorpion组的Ct阀值多于1.5Ct，比分子信标探针更好(分子信标的Ct平均值为28.82，Scorpion报道分子的Ct值为27.30)。结果如下通用甲基化DNA，ng 500 250 100 50 10 5Scorpion(GSTP1/β肌动蛋白拷贝数比) 272 310 285 296 339 288分子信标(GSTP1/β肌动蛋白拷贝数比) 759 735 758 767 797 814实施例5 甲基化比截止值如实施例2所述，对已知具有临床病症的患者的前列腺组织样本进行PCR。计算出的甲基化比率如下。使用下述程序分析数据。在应用算法前，必须遵照以下先决条件。
对于β肌动蛋白对于两份复制样品，CT值＜40(通过实时PCR仪来测定)对于“甲基化”的GSTP1结果对于两份复制样品，CT值＜40(通过实时PCR仪来测定)上述的两个标准曲线的斜率大于-4(PCR效率＞80％)R20.99，在标准曲线上4个相关的数据点阳性分析对照须产生一个阳性结果常规包括的无模板的对照(标准曲线)须为阴性若满足先决条件，就可根据标准曲线计算出每个基因(GSTP1和肌动蛋白基因)的拷贝数。进而可使用公式(GSTP1拷贝数/β-肌动蛋白拷贝数)×1000，计算出每个样本的比率(包括阳性对照)。通过使用能产生高特异性和高灵敏度的比率来确定截止值。对于142个经福尔马林固定石蜡包埋前列腺的组织，对GSTP1将截止设为10，提供了87％的灵敏度和100％的特异性。使用下列标准，所产生的比率用来确定某一给定样本的甲基化状态。

本领域技术人员清楚，可调整截止值，优选地设定灵敏性和特异值以适应应用它们的目的(例如，筛选、治疗监控、不明确诊断的反射测试)。
实施例6 组合标期物(预后的)根据实施例1所述准备以下组合的Scorpion试剂GSTP1标志物和RARβ2、GSTP1和APC，以及GSTP1和PTGS2。通过重复运行50个已知状况(即正常、良性增生、前列腺癌)的前列腺组织样本，根据实施例2，组合使用标志物作为多路PCR。以下是预期的结果

序列表<110>VENER，TatianaMEHROTRA，JyotiVARDE，ShobhaMAZUMDER，AbhijitBADEN，JonBACKUS，John<120>检测基因甲基化<130>VDX5027USNP<140>60/717790<141>2005-09-15<160>66<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<220>
<221>修饰碱基<222>(23)..(23)<223>-BHQ(Black Hole猝灭剂)-HEG(六甘醇)-<400>1ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46
<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>2aaaatcccgc gaactcccgc c 21<210>3<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>3cccgaacgtc gaccgctttc gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>4aaaatcccgc gaactcccgc c 21<210>5<211>44
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>5cggcgggagt tcgcgggcgc cgactaaatc acgacgccga ccgc 44<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>6cggttagttg cgcggcgatt tc 22<210>7<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(19)..(19)<223>-BHQ-HEG-<220>
<221>修饰碱基
<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>7cgggagttcg cgggtcccga ctaaatcacg acgccgaccg c41<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>8cggttagttg cgcggcgatt tc 22<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>9gtggttgatg tttggggtat caaccacaat cccacaaact cccaccaacc 50<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物
<400>10gtggtgattt tggggatttt agggtgt27<210>11<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(24)..(24)<223>-BHQ-HEG-<400>11accccagtgg ttgatgtttg gggtaatccc acaaactccc accaacc 47<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<400>12gtggtgattt tggggatttt agggtgt27<210>13<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion
<220>
<221>修饰碱基<222>(28)..(28)<223>-BHQ-HEG-<400>13ccccacaggt tggtgggagt ttgtggggcc caatactaaa tcacaacacc aaccac56<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>14tggttagttg tgtggtgatt ttgggga27<210>15<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>15ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>GSTP1 Scorpioa反义引物<400>16aaaatcccgc gaactcccgc c 21<210>17<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(30)..(30)<223>-BHQ-HEG-<400>17cgcacgccga acgtcgaccg caaacgtgcg cgatttcggg gattttaggg cgt 53<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>18aaaatcccgc gaactcccgc c 21<210>19<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion
<220>
<221>修饰碱基<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>19cgcacggcga actcccgccg acgtgcgtgt agcggtcgtc ggggttg 47<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>20gccccaatac taaatcacga cg 22<210>21<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(34)..(34)<223>-BHQ-HEG-<400>21ccgacgcaca aaaaaacacc ctaaaatccg tcggggttag ttgtgtggtg atttt 55<210>22<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Scorpion反义引物<400>22cacaacacca accactcttc20<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Taqman引物<400>23cgtgatttag tattggggcg gagcggggc 29<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Taqman引物<400>24atccccgaaa aacgaaccgc gcgta 25<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSTP1 Taqman探针<400>25tcggaggtcg cgaggttttc gttgga 26
<210>26<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RARB2 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(28)..(28)<223>-BHQ-HEG-<400>26gccgccgtcg agaacgcgag cgggcggcta ccccgacgat acccaaac 48<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RARB2 Scorpion反义引物<400>27gggattagaa ttttttatgc gagttgt27<210>28<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RARB2 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-
<400>28cggcaggatt gggatgtcga gctgccgtac cccgacgata cccaaac 47<210>29<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RARB2 Scorpion反义引物<400>29gggattagaa ttttttatgc gagttgt27<210>30<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RASSFIA Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>30gccgcggttt cgttcggttc gcggccccgt acttcgctaa ctttaaacg49<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RASSFIA Scorpion反义引物<400>31
gcgttgaagt cggggttc 18<210>32<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TIMP3 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-<400>32gcggcgagtt cgggttgtag cgccgccgcc tctccaaaat taccgtac 48<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TIMP3 Scorpion反义引物<400>33gcgtcggagg ttaaggttgt t 21<210>34<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>APC Scorpion<220>
<221>修饰碱基
<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>34gccggcgggt tttcgacggg ccggccgaac caaaacgctc ccca 44<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>APC Scorpion反义引物<400>35gtcggttacg tgcgtttata tttag 25<210>36<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>36gcgcccaacc gcacaagggc gcgggtatat tttcgagggg tacg 44<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion反义引物
<400>37cgacccgcac tccgcaat18<210>38<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>38ccgcgcatca ccaccccaca cgcgcgggga gtatataggt tggggaagtt tg52<210>39<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion反义引物<400>39aacacacaat aacaaacaca aattcac27<210>40<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion
<220>
<221>修饰碱基<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>40cccggctaaa cccaccatcc agccgggggg agggtagttt agttgtggtt 50<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion反义引物<400>41caaaacaaaa aaactaaatc tacacaacc 29<210>42<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>肌动蛋白Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-<400>42ccgcggaaca ttcaactcaa ccgcggggag gaggaaggta ggttttt47<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>肌动蛋白Scorpion反义引物<400>43acatacaaca atcaataaca taaaaccac29<210>44<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>44cacgccgccg tatctaggcg tggtttgttt cgacgtgatt ttttcga47<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2反义引物<400>45gcaaaaaatc ccctctcccg c21<210>46<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2 Scorpion
<220>
<221>修饰碱基<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>46gccgcgcaca aatttccgcggcgaattggt tttcggaagc gttcg 45<210>47<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2反义引物<400>47cccgaattcc accgcc 16<210>48<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>48ggcggaacgc acaaatttcc gccgaattgg ttttcggaag cgttcg 46<210>49<211>16<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2反义引物<400>49cccgaattcc accgcc 16<210>50<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-<400>50tgccgccgcc gtatctaatg gcggcagttt gtttcgacgt gattttttcg a 51<210>51<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PTGS2/COX2反义引物<400>51gcaaaaaatc ccctctcccg c21<210>52<211>51<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>14-3-3 Scorpion<220>
<221>修饰碱基<222>(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-<400>52cggccttcgc tcttcgcaaa aggccgggta gtttttatga aaggcgtcgt g 51<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>14-3-3反义引物<400>53ctaaccgccc accacgtt 18<210>54<211>4260<212>DNA<213>智人<220>
<221>misc_feature<223>>gi|341173|gb|M24485.1|HUMGSTP1G智人(克隆pHGST-pi)谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTP1)基因，完整cds<400>54aacaagagat caatatctag aataaatgga gatctgcaaa tcaacagaaa gtaggcagca 60aagccaaaga aaatagccta aggcacagcc actaaaagga acgtgatcat gtcctttgca 120gggacatggg tggagctgga agccgttagc ctcagcaaac tcacacagga acagaaaacc 180agcgagaccg catggtctca cttataagtg ggagctgaac aatgagaaca catggtcaca 240
tggcggcgat caacacacac tggtgcctgt tgagcggggt gctggggagg gagagtacca300ggaagaatag ctaagggata ctgggcttaa tacctgggtg atgggatgat ctgtacagca360aaccatcatg gcgcacacac ctatgtaaca aacctgcaca tcctgcacat gtaccccaga420acttcaaata aaagttggac ggccaggcgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt480gggaagccga ggcgtgcaga tcacctaagg tcaggagttc gagaccagcc cggccaacat540ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaatcagcca gatgtggcac gcacctataa600ttccacctac tcgggaggct gaagcagaat tgcttgaacc cgagaggcgg aggttgcagt660gagccgccga gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcca cagcgtgaga ctacgtcata720aaataaaata aaataacaca aaataaaata aaataaaata aaataaaata aaataataaa780ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaagcaat ttcctttcct ctaagcggcc840tccacccctc tcccctgccc tgtgaagcgg gtgtgcaagc tccgggatcg cagcggtctt900agggaatttc cccccgcgat gtcccggcgc gccagttcgc tgcgcacact tcgctgcggt960cctcttcctg ctgtctgttt actccctagg ccccgctggg gacctgggaa agagggaaag1020gcttccccgg ccagctgcgc ggcgactccg gggactccag ggcgcccctc tgcggccgac1080gcccggggtg cagcggccgc cggggctggg gccggcggga gtccgcggga ccctccagaa1140gagcggccgg cgccgtgact cagcactggg gcggagcggg gcgggaccac ccttataagg1200ctcggaggcc gcgaggcctt cgctggagtt tcgccgccgc agtcttcgcc accagtgagt1260acgcgcggcc cgctccccgg ggatggggct cagagctccc agcatggggc caacccgcag1320catcaggccc gggctcccgg cagggctcct cgcccacctc gagacccggg acgggggcct1380aggggaccca ggacgtcccc agtgccgtta gcggctttca gggggcccgg agcgcctcgg1440ggagggatgg gaccccgggg gcggggaggg ggggcaggct gcgctcaccg cgccttggca1500tcctcccccg ggctccagca aacttttctt tgttcgctgc agtgccgccc tacaccgtgg1560
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<221>misc_feature<223>B-肌动蛋白>gi|28337|emb|Y00474.1|HSACTBPR 人类β-肌动蛋白基因5′-侧翼区，CpG岛1656至1955<400>55gagctctgtc tcttggccag ctgaatggag gcccagcggc aacacaggtc ctgcctgggg60atcaggtctg ctctgcaccc caccttgctg cctggagccg cccacctgac aacctctcat120ccctgctctg tagatccggt cccatcccca ctgcccaccc caccccccca gcactccacc180cagttcaacg ttccacgaac ccccagaacc agccctcatc aacaggcagc aagaagggcc240ccccgcccat cgccccacaa cgccagccgg gtgaactgta gcgttggcag gtcctgaggc300agctgaaaga tacaaggcca gggacaggac agtcccatcc ccaggaggca gggagtatac360aggctgggga agtttgccct tgcgtggggt ggtgatggag gaggctcagc aagtcttctg420gactgtgaac ctgtgtctgc cactgtgtgc tgggtggtgg tcatctttcc caccaggctg480tggcctctgc aaccttcaag ggaggagcag gtcccattgg ctgagcacag ccttgtacgt540gaactgaaca agcagcctcc ttcctggcca caggttccat gtccttatat ggactcatct600ttgcctattg cgacacacac tcaatgaaca cctactacgc gctgcaaaga gccccgcagg660cctgaggtgc ccccacctca ccactcttcc tatttttgtg taaaaatcca gcttcttgtc720accacctcca aggaggggga ggaggaggaa ggcaggttcc tctaggctga gccgaatgcc780
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<221>misc_feature<223>RARB2>gi|14916495|ref|NM_016152.2|智人视黄酸受体，β(RARB)，转录变体2，mRNA<400>57gtgacagaag tagtaggaag tgagctgttc agaggcagga gggtctattc tttgccaaag60
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<221>misc_feature<223>TIMP3>gi|21536431|ref|NM_000362.3|智人组织金属蛋白酶3抑制剂(Sorsby fundus营养不良，假炎性)(TIMP3)，mRNA<400>58tctgtcgact tgccccagag ctgatccttg tctttgtcca cttctcagcg aggatggcac60ttcagggagc ccttccctta ctatcgcaga gagagcaggc cctccccagt catgtccaac120ccagaactct gttttgtttt cttcatagcc ctagcatcac agaaaatcac cctgtgcatt180catggatgtc cacgggggca agggctttgt gttgcttaac ccagcatcct gaaccgtgtt240tgttgaatga atacagaacc ccgtttgctc tgggagagca cagaaaacag tcttctatca300tatatcatag ccagctgcaa acagcagatg gcttcccata tcccagagag taagaaccag360agagagagag aaagagagag agtttgggtc tttctcctct gtgcctgctc tctccagaga420aactggaggg gtagcagtta gcattccccc gctggttcca ccaagcacag tcaaggtctc480taggacatgg ccacccctca cctgtggaag cggtcctgct ggggtgggtg ggtgttagtt540ggttctggtt tgggtcagag acacccagtg gcccaggtgg gcgtggggcc agggcgcaga600cgagaagggg cacgagggct ccgctccgag gacccagcgg caagcaccgg tcccgggcgc660gccccagccc acccactcgc gtgcccacgg cggcattatt ccctataagg atctgaacga720
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<221>misc_feature<223>RASSF1A>gi|25777678|ref|NM_007182.4|智人Ras相关(RalGDS/AF-6)结构域家族1(RASSF1)，转录变体A，mRNA<400>64tctcctcagc tccttcccgc cgcccagtct ggatcctggg ggaggcgctg aagtcggggc60ccgccctgtg gccccgcccg gcccgcgctt gctagcgccc aaagccagcg aagcacgggc120ccaaccgggc catgtcgggg gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg180ggcgcgctgg gaagggccgc acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg240gcaccgcgtg caaccccaca cggcagctgg tccctggccg tggccaccgc ttccagcccg300cggggcccgc cacgcacacg tggtgcgacc tctgtggcga cttcatctgg ggcgtcgtgc360gcaaaggcct gcagtgcgcg cattgcaagt tcacctgcca ctaccgctgc cgcgcgctcg420tctgcctgga ctgttgcggg ccccgggacc tgggctggga acccgcggtg gagcgggaca480cgaacgtgga cgagcctgtg gagtgggaga cacctgacct ttctcaagct gagattgagc540agaagatcaa ggagtacaat gcccagatca acagcaacct cttcatgagc ttgaacaagg600acggttctta cacaggcttc atcaaggttc agctgaagct ggtgcgccct gtctctgtgc660cctccagcaa gaagccaccc tccttgcagg atgcccggcg gggcccagga cggggcacaa720gtgtcaggcg ccgcacttcc ttttacctgc ccaaggatgc tgtcaagcac ctgcatgtgc780
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<223>探针(5′FAM/3′TAMRA)GSTP1<400>66cggtcgacgt tcggggtgta gcg2权利要求
1.一种诊断增殖性疾病的存在或预测其过程的方法，包括使用选自Seq.ID.NO.1-35和44-53的试剂，测定生物样本中标志物的甲基化状态。
2.根据权利要求1中所述的方法，还包括测量参照标志物的存在。
3.根据权利要求2中所述的方法，其中参照标志物选自β肌动蛋白。
4.权利要求中所述的方法，其中使用标志物组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中标志物组合包括GSTP1的标志物以及APC、TIMP、RASSF1A、RARB2、PTGS2或14-3-3的标志物。
6.根据权利要求4中所述的方法，其中标志物的试剂包括Seq.ID.No.1-35和44-53中的一个成员。
7.权利要求1中所述的方法，其中样本是前列腺组织。
8.权利要求1中所述的方法，其中样本是尿液、血清、血浆或循环细胞。
9.一种包含选自Seq.ID No.1-43的一个成员的组合物。
10.一种组合物，包含多于一种权利要求10的组合物的混合物。
11.一种用于实施根据权利要求1中所述的测试的试剂盒，包括核酸扩增和检测试剂。
12.权利要求11中所述的试剂盒，其中扩增和检测试剂选自Seq.ID No.1-43。
13.权利要求12中所述的试剂盒，其中扩增和检测试剂选自Seq.ID No.1-25，并且含有选自Seq.ID No.36-43的试剂。
14.权利要求11中所述的试剂盒，还包括说明书。
15.权利要求11中所述的试剂盒，其中试剂检测选自GSTP1和APC、TIMP、RASSF1a、RARB2、PTGS2或14-3-3的基因的超甲基化。
16.权利要求11中所述的试剂盒，还包括用于扩增和检测组成型表达的基因存在的试剂。
17.权利要求11中所述的试剂盒，还包括用于扩增和检测组成型表达的基因存在的试剂。
18.权利要求1中所述的方法，还包括确定甲基化比率和测定甲基化比率是否超过截止值。
19.权利要求1中所述的方法，用于治疗监测。
20.权利要求1中所述的方法，用于筛选。
21.权利要求1中所述的方法，用于分辨由不同于权利要求1的方法所获得的不明确的或不确定的癌症分析结果。
全文摘要
本发明涉及检测基因甲基化。本发明提供了一种诊断增殖性疾病的存在或预测其过程的方法，包括使用选自Seq.ID.NO.1－35和44－53的试剂，测定生物样本中标志物的甲基化状态。本发明还提供了一种用于实施上述方法的试剂盒，其中包括核酸扩增和检测试剂。
文档编号G01N33/50GK1966724SQ200610143178
公开日2007年5月23日 申请日期2006年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者T·维纳, J·梅罗特拉, S·瓦德, A·马祖德, J·巴登, J·巴库斯 申请人:维里德克斯有限责任公司