专利名称：一种检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种检测人血清中组织激肽释放 酶的试剂盒及其制备方法。
技术背景进入二十一世纪以来，得益于医药行业的突破和医疗手段的进步，人民 的生活水平、健康状况、生存寿命都极大的提高了。上一个世纪抗生素的 发现及各种疫苗的出现，使许多致命的疾病如肺结核、天花等得到控制， 但同时新的致命疾病及难以治愈的疾病也不断出现。其中，较为突出的就 是各种缺血性疾病，如缺血性脑中风、缺血性心肌病等，而且这些疾病的 发病率还正不断上升。由于这类缺血性疾病的发病是一个渐进的过程，一 旦诊断延误，发病受损的组织难以逆转，如中风引起的半身不遂及失语等， 给患者及家属带来极大痛苦。尽早诊断是控制其发生、发展的有效手段。 目前诊断此类疾病国内外多釆用脑血管造影等手段，其价格昂贵，且必须 在有条件的医疗机构才能进行，县级以下普通门诊一般都不具备其设施， 不利于大多数普通人群的普遍筛查。组织激肽释放酶水平与缺血性脑中风 有很大相关性，血清中组织激肽释放酶水平与颈动脉梗阻分级成明显正相 关关系，也与脑缺血治疗指征成正相关性等。因此，可利用人组织激肽释放酶作为标记物，以ELISA方法测量外周血中组织激肽释放酶的水平，可 以对多种疾病的诊断和愈后提供帮助。还有，随着生命科学技术的飞速发 展，近年来人们正在利用基因工程的手段，进行表达人组织激肽释放酶的 科学研究，也迫切需要一种随时检测表达量的简便方法。而本试剂盒检测 成本低、操作简单、灵敏度高、特异性及稳定性好，可普遍用于临床检测 及基础医学研究。 发明内容本发明的目的，在于提供一种成本低、操作简单、灵敏度高、特异性 及稳定性好的检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒及其制备方法。为实现上述目的，本发明的所采用的技术方案为试剂盒包括包被人组织激肽释放酶抗血清的酶联反应板、检测人组 织激肽释放酶抗血清的酶抗体、标准人组织激肽释放酶抗血清的酶样品、 亲和素-过氧化物酶、底物缓冲液和终止液。所述检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体为连接生物素的人组织激 肽释放酶抗血清，抗体浓度为0.5—2ug/ul;标准样品为从人尿中提取的组 织激肽释放酶0. 05 — 24 ng/ml;亲和素-过氧化物酶为Pero-avidin用PBS 稀释成0. 5 — 2ul/lug浓度;底物缓冲液为缓冲液A: Na2HP04. 12H 0 23—25g、柠檬酸.H20 9一10g, 30%H2O2 900 — 1100uL,双蒸水900—1100ml调 pH至4.8 —5. 2;缓冲液B:酵30—50ml， TMBO. 09 —0. llg,双蒸水90— ll.OmL;终止液为0. 5-2M &304溶液；浓洗涤液为10-15倍的PBS,内含 体积O. 1%吐温20;稀释液为重量体积浓度1-5%牛血清白蛋白的PBS。 试剂盒的制备方法 一 l)抗原合成收集尿液超滤浓缩，贮存于-20度，反复冻融3—5次， 经纱布和Nitex膜过滤，离心，沉淀经35-80%硫酸铵盐析，离心收集沉淀， 用20mMTris-Hcl重溶解后透析，透析液经过DE-52纤维素层析柱，以 0. 1-0. 5M氯化钠-磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集具有Tos-Arg-0me酯酶活性 的流出峰，以0. 2M氯化钠-磷酸盐缓冲液对流出峰进行透析，透析液经过 以抑酶肽为配体的琼脂糖凝胶亲和柱，以透析缓冲液洗脱直至流出液中无 蛋白，再以乙酸钠缓冲液洗脱组织激肽释放酶，亲和洗脱的具有 Tos-Arg-0me酯酶活性的流出峰再经过Sephacryl S-200进一步纯化，得到 组织激肽释放酶抗原；2 )包被抗原将组织激肽释放酶抗原和兔血清进行偶联得到包被抗原；3) 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体将100亳克纯化的组织激肽释放酶和等量氟氏完全佐剂研钵中研磨乳化；而后将研磨的乳液多点注 射到每只雌性新西兰白兔背部；20-30天对白兔加强免疫50毫克乳液；末 次免疫后1-2月由耳缘静脉收集血样于坡璃试管中以1500g/分钟离心15分 钟，血清储存于-20度；将15-20毫升抗血清样品通过蛋白A-sepharose凝 胶柱，以0. 5M磷酸缓冲液洗脱至基线，以0. 1 M甘氨酸缓冲液洗脱免疫球 蛋白，洗脱条件为34滴/分钟，100滴/试管，洗脱液以0. 5MTris碱中加， 收集280mn吸光度大于0. 15的样品；4) 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体标记生物素将2mg/ml纯化 的步骤3中的产物于4T对0. lmol/L碳酸氢钠1000ml透析24小时，加入 1(^1新鲜.配制的生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯，室温反应1小时后于4。C下 对1000ml磷酸盐缓冲液透析24小时，透析后加入等体积的灭菌甘油，分 装，贮存于-2(TC备用；而后将辣根过氧化物酶的亲和素与标记有生物素的 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体偶联；5) 酶反应板制备用缓冲溶液将人组织激肽释放酶抗血清的酶稀释成 0. 5 — 3jig/m1,微孔板每孔加入100fil， 4。C过夜包被，用洗涤机洗板三次， 每孔250uL,然后称取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至100 ml,无 菌过滤，加入各孔中，每孔加入200pl，放入湿盒中37。C反应l小时，弃 去液体，以洗涤液洗板三次，每孔加洗涤液300|il; 4-16匸冷风干燥2小时， 放入有千燥剂的包装袋中抽真空封口，保存于4r。本发明具有如下优点本发明用从人尿中提取的人组织激肽释放酶、由组织激肽释放酶免疫 动物制备的特异性免疫球蛋白、制成了组织激肽释放酶检测试剂盒。其检
测成本低，特别有益于不完全性脑阻塞患者的早期发现，亦适用于不完全性心肌梗塞等缺血性疾病的早期发现。诊断特异性达90%，灵敏采用标准 阳性对照检测灵敏度达到0. 05pIU/ml。稳定；经稳定性实验，本发明于4 X:保存，至24个月时经检测，偏差±20%。试剂配套，使用方便，价格便 宜，易于临床检验。利用本发明试剂盒，可为生物工程中细胞表达组织激 肽释放酶的量进行跟踪检测。以便于细胞培养过程中培养基的改良，添加 剂的增减，培养条件的选择时，可获得一个重要的检测指标"
图1为本发明标准物的浓度与OD值的标准曲线，其中HUK浓度 0. lng/ml ~ 3. 255ng/ml， r=0. 9948。
具体实施方式
实施例1检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒包括包被人组织激肽释放酶 抗血清的酶联反应板、检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体、标准人组 织激肽释放酶抗血清的酶样品、亲和素-过氧化物酶、底物缓冲液、终止液。所述检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体为连接生物素的人组织激 肽释放酶抗血清lug/ul;标准样品为从人尿中提取的组织激肽释放酶0. 20—3. 25ng/ml;亲和素-过氧化物酶Pero-avidin用PBS稀释成lug/lul;底物缓冲液为0. 1M柠檬酸Ph5. 0+0. 03%过氧化氢(缓冲液A: Na2HP0"12H20 23 —25g、梓檬酸.H20 9一10g, 30%H2O2 900—-1100uL，双蒸 水900—1100ml调pH至4. 8 — 5. 2;)和0. 1%TMB+40%DMF (缓冲液B: ,30 一50ml, TMBO. 09—0. llg,双蒸水90—110mL;),按9: l比例配制。终止液为2. 45%紐2304溶液；浓洗涤液为IO倍的PBS,内含O. 1%吐温20;稀释液为重量体积浓度"/。牛血清白蛋白的PBS;检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒的制备方法步骤为l)抗原合成收集12升尿液超滤浓缩至300亳升，贮存于-20度， 反复冻融5次，经三层纱布和Nitex膜过滤，5000g离心30分钟，沉淀经 35-80%硫酸铵盐析，离心收集沉淀，重溶解后透析，透析液经过DE-52纤 维素层析柱，以0. 1-0. 5M氯化钠？ -0.謹磷酸盐缓冲液(pH 6. 5 )进行洗 脱，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰，以0. 2M氯化钠？ -0. 1M磷 酸盐缓冲液(pH 6.5)对流出峰进行透析，透析液经过以抑酶肽为配体的 琼脂糖凝胶亲和柱，以透析缓冲液洗脱直至流出液中无蛋白，再以0. ] M 乙酸钠缓冲液(pH3. 5 )洗脱组织激肽释放酶，亲和洗脱的具有Tos-Arg-Ome 酯酶活性的流出峰再经过Sephacryl S-200进一步纯化，得到组织激肽释 放酶抗原；将组织激肽释放酶抗原由聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度， 经过上述过程由原尿到纯化的蛋白，组织激肽释放酶被纯化了 2114倍。建
立人组织激肽释放酶参考品的质量标准如下分子量经过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳鉴定分子量为39, 500尔顿。活性以合成底物Tos-Arg-Met测 定组织激肽释放酶活性为74. OEU/mg蛋白，以天然底物牛低分子量激肽原 测定组织激肽释放酶活性为22ng激肽/ nig蛋白。纯度经过SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳检测纯度大于99%。蛋白浓度测定利用280nm消光系数E (280 )测定，组织激肽释放酶E( 280 )4.5,即利用lcm比色杯测定280nm 处lmg/ml HUK溶液的吸光度为1.5。利用上述方法测定人组织激肽释放酶 参考品的浓度。为利用亲和色谱方法从人尿液中提取纯化得到，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度大干99%，利用280rnn消光系数E ( 280 )测 定蛋白浓度，稀释后(3. 25ng/^U)无菌过滤后分装。2 )包被抗原将组织激肽释放酶抗原和兔血清进行偶联得到包被抗原；3) 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体将100亳克纯化的组织激 肽释放酶和等量氟氏完全佐剂研钵中研磨乳化；而后将研磨的乳液多点注 射到每只雌性新西兰白兔背部；20-30天对白兔加强免疫50毫克乳液；末 次免疫后1-2月由耳缘静脉收集血样于玻璃试管中以1500g/分钟离心15分 钟，血清储存于-2Q度；将15-20亳升抗血清样品通过蛋白A-s印harose凝 胶柱，以0. 5M磷酸缓冲液(pH8. 0)洗脱至基线，以O. 1M甘氨酸缓冲液(pH3. 0)洗脱免疫球蛋白，洗脱条件为34滴/分钟，100滴/试管，洗脱液 以0.5MTris碱 (pH9.0)中和,收集280nm吸光度大于0. 15的样品；测 定抗体溶液浓度为3.6mg/ml，利用SDS-PAGE检测纯化抗体的纯度大于 99%。利用被比稀释测定效价大于1: 100000。4) 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体标记生物素将2mg/ml纯化 的步骤3中的产物于4。C在0. lraol/L碳酸氢钠(pH9. 5 ) 1000ml透析24小 时，加入10)il新鲜配制的生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯(BNHS, 10mg/lml DMSO),室温反应1小时后于化下对1000ml磷酸盐缓冲液透析24小时， 透析后加入等体积的灭菌甘油，分装，贮存于-2(TC备用；而后将辣根过氧 化物酶的亲和素与标记有生物素的检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体 偶联；采用方阵滴定法测定抗体工作浓度为2ug/mL5) 酶反应板制备用缓冲溶液将人组织激肽释放酶抗血清的酶稀释成 l网/ml,微孔板每孔加入lOOpl, 4。C过夜包被，用洗涤机洗板三次，每孔 250uL,然后称取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至l()O ml,无菌过 滤，加入各孔中，每孔加入200p1,放入湿盒中37。C反应l小时，弃去液 体，以洗涤液洗板三次，每孔加洗涤液300pl。 16。C冷风干燥2小时，放入 有干燥剂的包装袋中抽真空封口，保存于4"C。试剂盒使用方法1) 配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水10倍稀释。2) 编号将样品对应微孔按序编号，每板应设空白对照l孔、阴性对 照3孔、标准血清5孔。
4)预洗用洗涤液将酶标板洗涤3遍。5 )加样分别在相应孔中加入阴性对照(3孔)、标准血清(5孔)及 待检血清各lQGu 1。6) 温育用封板膜封板后置3rc土rc温育u0士2分钟。7) 洗涤小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用洗涤液洗 涤3遍。8) 加抗体每孔加入生物素化抗体100ul，空白孔除外。9) 温育用封板膜封板后置37。C土rC温育60土2分钟。10) 洗涤小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用洗涤液 洗涤3遍。11) 加酶每孔加入酶标记物lOOul,空白孔除外。12) 温育用封板膜封板后置37。C土rC温育30±2分钟。13) 洗涤小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用洗涤液 充分洗涤5遍，最后一次尽量扣千。14) 显色每孔加入底物a、 B液各90和10jj1,轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置37°c ± rc避光温育10分钟。15) 测定每孔加终止液lOOpl,轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为 450nm (建议使用双波长检测)，测定各OD值。结果判定以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)(参 见图l),在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查 出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程 式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度。经检测产品性能指标为 灵敏度0. 05juIU/ml,标准曲线R>0. 98,精密性CV《10% ( n=10 )， 正常值0. 3~10jiIU/ml,测定范围0. 1 ~ 30 p IU/ml。实施例2与实施例1不同之处在于釆用人组织激肽释放酶免疫动物制备的抗体(HUK-IgG)包被酶联反应 板，从人尿中提取纯化的人组织激肽释放酶为抗原(HUK),生物素标记的 组织激肽释放酶抗体加入保护剂，亲和素加入保护剂，以1%牛血清白蛋白 的PBS为稀释液，以柠檬酸、过氧化氢、四甲基苯(TMB)配制的显色物，利 用了双抗夹心ELISA法原理组装了试剂盒，同时准备了详细使用说明书。 稀释液的制备用PBSPh7. 2+l%BSA+0. 05°/ 吐温+0. 05%ProCl ion-300。 酶联反应板的制备取美国南卡医学院提供的人组织激肽释放酶免疫 动物制备的抗体(HUK-IgG),加入到PBS(Ph7. 2)缓冲液中，配制成lug/ml 溶液。在96孔板中每孔加入lOOul,置于4。C中16h 。取出包被板，在洗 板机上用含0. 1%吐温-20的PBS缓冲液，250ul/孔，冲洗3次，拍干。1%BSA 的溶液，200ul/孔封闭，37i:中lh。取出封闭板，在洗板机上用含0.1。/。吐 温-M的PBS缓冲液，2S0ul/孔，冲洗3次，拍千。17。C中风干2h,真空干
燥封闭，储存于4匸中备用。标准品(HUK)的制备取美国南卡医学院提供的人组织激肽释放酶 (HUK),用稀释液加入1. 25%2M EDTA，稀释至3. 25ng/ml，分装，储存于4"C中备用。生物素标记组织激肽释放抗体(Biotin-HUK IgG)的制备取5. 5mg/ml 抗体(HUK-IgG) lml,加入1. 5mlPBS混匀，注入透析袋，在0. 1M NaHC03 Ph9. 5 1000ml溶液中，4。C条件下透析24小时。将透析后的IgG 2. 5ml取 出放入ep管中，加入新鲜配制的0. 1M Bio Tinamidocaprpate25u1, 23°C 水洛1小时。将液体全部取出重新注入透析袋，在PBS中4。C条件下透析 24小时。将将透析后的Bio-IgG液体全部取出，加入等体积的无菌甘油， 混匀，分装，-2(TC保存备用。取Biotin-HUKIgG,用稀释液含O. 1%苯酚，稀 释至lug/ml,分装，储存于4。C中备用。亲和素-过氧化物酶(Pero-avidin)的制备取Pero-avidin用PBS 稀释成lul/lug浓度分装，储存于-2(TC中备用。取lul/lugPero-avidin， 用稀释液含O. 1%苯酴，稀释至lug/ml，分装，储存于4i:中备用。显色系统以0. 1M柠檬酸Ph5. 0+0. 03°/。过氧化氢和0. 1%TMB+40%DMF, 按9: 1比例配制。
权利要求
1. 一种检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒，其特征在于包括，包被人组织激肽释放酶抗血清的酶联反应板、检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体、标准人组织激肽释放酶抗血清的酶样品、亲和素-过氧化物酶、底物缓冲液和终止液。
2. 按照权利要求1所述的检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒，其 特征在于所述检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体为连接生物素的人 组织激肽释放酶抗血清，抗体浓度为Q. 5 — 2ug/ul;标准样品为从人尿中提取的组织激肽释放酶0. 05 — 24 ng/ml 亲和素-过氧化物酶为Pero-avidin用PBS稀释成0. 5 — 2ui/lug浓度； 底物缓冲液为缓冲液A: Na2HP04. 12H20 23 — 25g、柠檬酸.H20 9 — 10g,30%H2O2 900—1100uL，双蒸水900—1100ml调pH至4. 8 — 5. 2;缓冲液B:腳30—50ml， TMBO-09—0. llg,双蒸水90—110mL; 终止液为0. 5-2M H2S0r溶液；浓洗涤液为10-15倍的PBS,内含体积O. 1%吐温20;稀释液为重量体积浓度1-5%牛血清白蛋白的PBS。
3. —种权利要求1所述的检测人血清中组织激肽释放酶试剂盒的制备 方法，其特征在于 _l)抗原合成收集尿液超滤浓缩，贮存于-20度，反复冻融3—5次， 经纱布和Nitex膜过滤，离心，沉淀经35-80%硫酸铵盐析，离心收集沉淀， 用20mMTris-Hcl重溶解后透析，透析液经过DE-52纤维素层析柱，以 0. 1-0. 5M氯化钠-磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性 的流出峰，以0.2M氯化钠-磷酸盐缓冲液对流出峰进行透析，透析液经过 以抑酶肽为配体的琼脂糖凝胶亲和柱，以透析缓冲液洗脱直至流出液中无 蛋白，再以乙酸钠缓冲液洗脱组织激肽释放酶，亲和洗脱的具有 Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰再经过Sephacryl S-20G进一步纯化，得到 组织激肽释放酶抗原；2) 包被抗原将组织激肽释放酶抗原和兔血清进行偶联得到包被抗原；3) 检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体将100亳克纯化的组织激 肽释放酶和等量氟氏完全佐剂研钵中研磨乳化；而后将研磨的乳液多点注 射到每只雌性新西兰白兔背部；20-30天对白兔加强免疫50亳克乳液；末 次免疫后1-2月由耳缘静脉收集血样于玻璃试管中以1500g/分钟离心15分 钟，血清储存于-20度；将15-M亳升抗血清样品通过蛋白A-s印harose凝 胶柱，以0.，磷酸缓冲液洗脱至基线，以0. 1 M甘氨酸缓冲液洗脱免疫球 蛋白，洗脱条件为3"商/分钟，100滴/试管，洗脱液以0. 5MTris碱中和， 收集280nm吸光度大于0. 15的样品；
4.检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体标记生物素将2mg/ml纯化 的步骤3中的产物于4"C对0. lraol/L碳酸氢钠1000ml透析24小时，加入 lOjil新鲜配制的生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯，室温反应1小时后于4'C下 对1000ml磷酸盐缓冲液透析24小时，透析后加入等体积的灭菌甘油，分 装，贮存于-2(TC备用；而后将辣根过氧化物酶的亲和素与标记有生物素的检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体偶联；5)酶反应板制备用缓冲溶液将人组织激肽释放酶抗血清的酶稀释成 0. 5 — 3ng/ml，微孔板每孔加入lOOpl, 4。C过夜包被，用洗涤机洗板三次， 每孔250uL，然后称取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至100 ml，无 菌过滤，加入各孔中，每孔加入20(Hi1,放入湿盒中37。C反应1小时，弃 去液体，以洗涤液洗板三次，每孔加洗涤液30(Hxl; 4-16。C冷风干燥2小时， 放入有干燥剂的包装袋中抽真空封口，保存于4'C。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种检测人血清中组织激肽释放酶的试剂盒及其制备方法，包括，包被人组织激肽释放酶抗血清的酶联反应板、检测人组织激肽释放酶抗血清的酶抗体、标准人组织激肽释放酶抗血清的酶样品、亲和素-过氧化物酶、底物缓冲液和终止液。本试剂盒可用于缺血性疾病的早期诊断，检测方法简便快速、成本低廉、灵敏度及特异性高。本发明也提供了制备方法。
文档编号G01N33/573GK101210926SQ200610135109
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者津 张, 张丽华, 张晓丹, 张玉奎, 张维冰, 徐茂兰, 青 杨, 立 赵 申请人:中国科学院大连化学物理研究所