专利名称：一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法
技术领域：
本发明涉及磷酸化肽的检测方法，具体地说是一种电喷雾质谱中多磷酸化位
点肽段的检测和鉴定方法。 背来技术
随着人类基因组计划的完成，人类的全基因草图已成为人们进一步揭示人体 奥秘的新起点。在基因序列测定技术、蛋白质分离技术、质谱技术以及生物信息
学曰益发展和完善的基础上，蛋白质的电泳和色谱分离、质谱鉴定以及DNA和 蛋白质序列数据库检索已经发展成为一种较为可靠的蛋白质分析方法。理论上， 人们已经具有了研究人体内所有蛋白质的可能。
蛋白质翻译后修饰是生物体内普遍存在的现象。它包括酶催化下分子个体与 蛋白质结合(乙酰化、糖基化和磷酸化)、蛋白质分子间的交联(半胱氨酸-半胱 氨酸之间的二硫键结合)以及对蛋白质的裁剪(信号肽的切除)。这些修饰不仅保 证了生物体内蛋白质的完整性，同时影响着蛋白质的活性及其相互作用。此外， 对细胞膜内外间的信号传导起着调控作用。在这些修饰中，蛋白磷酸化尤为重要。 在蛋白质特定氨基酸残基上的可逆嫌酸化修饰是细胞中的主要调控机制，对细胞 的整个生理过程(细胞的成长、分裂和分化)、信号传导、基因调控和代谢过程都 十分重要。
近几年，质谱已经成为分析和鉴定磷酸化蛋白和多肽以及确定麟酸化位点的 主要手段。目前主要釆用的方法是利用亲和技术(包括免疫亲和、固定化金属亲 和及金属氧化物亲和)对磷酸化蛋白或磷酸化肽进行富集和纯化，然后进入质谱 进行分析。在使用电喷雾质谱对磷酸化肽段进行分析时，由于磷酸根的存在，多 肽分子不容易结合质子形成正离子,严重地抑制了磷酸化肽在质谱中的响应信号， 即使通过富集和纯化，也仅能提高单磷酸肽和二磷酸化肽的检出率，而对于多磷 酸化位点的检测和鉴定仍然无能为力。尽管有报道使用衍生化方法替代磷酸化肽 段上的磷酸根以提高其在质谱中的响应，但这些方法都需要对样品进行复杂的化 学处理，并容易引入其它千扰。
多种可能的磷酸化位点的结果。因此，仅通过数据库检索可能无法准确地确定其 磷酸化位点。采用在电喷雾质谱检测多磷酸化肽仍然是目前蛋白质翻译后修饰研 究的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方 法。利用磷酸酶对磷酸化肽段进行处理。可以通过改变反应条件，控制磷酸化肽 的去磷酸化程度。将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行分 析和比较，可以测定磷酸化肽段，并确定其磷酸化位点。可作为一种电喷雾质谱
中初步判断磷酸化肽存在的方法;可以提高多磷酸化肽的质谱响应信号和检出率； 通过控制反应条件能够推测多磷酸化肽段的磷酸化位点，并可作为一种多级质谱 分析的验证方法；方法简单、操作方便、条件可控，容易实现在线分析。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为.-
检测和鉴定方法利用磷酸酶对磷酸化肽段进行处理，并通过控制磷酸化肽 段的去磷酸化程度。将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行 分析和比较，可以测定多磷酸化肽段，并确定其磷酸化位点。
所述控制磷酸化肽段的去磷酸化程度方式为，控制反应pH值在1-14;酶与 底物的用量之比在l:l至100，000: 1 (U: g);反应温度在10-50°C;分别于反应时 间为0、依次间隔5s -0.5h取样，进入电喷雾质谱中进行分析和比较、直至磷 酸化肽段完全去磷酸化，其取样次数应》4。
所述磷酸化肽段为具有两个或两个以上磷酸化位点的肽段；
所述样品可以是含有磷酸化肽段的混合物，也可以是通过亲和富集和纯化后 得到的磷酸化肽混合物，或者是单个具有多磷酸位点的肽段。
所述磷酸酶有以下特征
1 )是一种可以催化磷酸化蛋白或肽段去磷酸化反应的酶，巿购(上海生工生 物工程技术服务有限公司、SIGMA公司等)；
2) 可以是碱性磷酸酶，也可以是酸性磷酸酶；
3) 可以来源于细菌或动物组织；
4) 可以采用自由酶溶液形式,也可以采用将酶固定在载体上的固定化酶形式。 其中所述电喷雾质谱是指釆用电喷雾技术的质谱仪，即釆用在液体上施加高
电压，使液体进行雾化和离子化的电离方式的质谱。 本发明的有益效果是
1、 本方法能够提高多磷酸化肽段的质谱响应信号和检出率，可作为一种电喷 雾质谱中初步判断多磷酸化肽段存在的方法。当多磷酸化肽去磷酸后，其电离得 到改善，肽段的质谱响应信号得以提高。原本无法在电喷雾质谱进行检测的多磷 酸化肽段在经过该方法处理后，能够有效检测。利用去磷酸处理前后肽段信息的 差异即可初步判定是否存在磷酸化肽。
2、 本方法通过控制反应条件，能够推测多磷酸化肽段的磷酸化位点，并可作 为一种多级质谱分析的验证方法。通过控制反应条件，使多磷酸化肽去磷酸化不 完全，形成多个单磷酸化肽或二磷酸化肽。可以从生成的磷酸化肽的质谱检测信 息来推测多磷酸化肽的部分或全部位点信息。此外，由于氨基酸序列相同、磷酸 化位点不同的肽段具有不同的色谱保留值，通过与液相分离系统联用，可以进一 步得到磷酸化肽段出峰时间变化的信息，提供判断多磷酸化肽的位点信息的依据。
3、 方法简单、容易实现。本发明仅使用磷酸酶催化磷酸化肽的去磷酸化反应。 反应容易控制、操作简单。
4、 容易实现在线分析和自动化。利用酶固定技术可将磷酸酶固定于载体上, 实现在线分析。
图1为本发明的操作流程图。
图2为本发明实施例2对磷酸化肽段进行高效液相色谱/电喷雾质谱联用 (HPLC-ESI/MS)分离检测得到的总离子流图。其中A为卩-casein蛋白酶解产物 直接进行分离得到的谱图；B为富集后的磷酸化肽段的分离谱图；C为使用碱性 磷酸酶去磷酸化处理后的肽段的分离谱图。
图3为本发明实施例3中通过改变反应温度控制去磷酸化反应的样品经 HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。A样品为(3-casein蛋白酶解产物经 Ti02柱富集后的磷酸化肽段;B样品为富集的磷酸化肽在25t:部分去磷酸化肽段; C样品为富集的磷酸化肽在37°C完全去磷酸化肽段。
图4为本发明实施例4中通过改变磷酸酶的浓度控制去磷酸化反应的样品经 HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中A中碱性磷酸酶浓度为 125pU4iL;B中碱性磷酸酶浓度为417[lUVL;C中碱性磷酸酶浓度为1250(ilJ/[iL,
图5为本发明实施例5通过改变去磷酸化反应的时间控制辚酸化肽去磷酸化 程度的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中A反应时间为 80min; B反应时间为270min; C反应时间为420min。
具体实施例方式
实施例1
一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法的操作流程如图i所 示。包括a，磷酸化蛋白酶解将磷酸化蛋白用蛋白酶进行水解，使其成为含有 磷酸化肽段的多肽混合物。b,磷酸化肽的富集将a中得到的多肽混合物使用亲 和富集的方法(固定化亲和，金属氧化物亲和，免疫亲和)进行富集。c,磷酸化 肽的洗脱利用洗脱缓冲溶液将磷酸化肽洗脱(包括在线洗脱和离线洗脱)。d, 磷酸化肽的去磷酸化丫iJll磷酸酶(酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)催化磷酸化肽的 去磷酸化反应，通过控制反应条件(温度、酶浓度、反应时间、pH值)使磷酸根 去除。最后，分别使用质谱对c和d中得到的肽段进行检测。
实施例2
实验条件碱性磷酸酶溶液(lU/^iL,小牛肠提取物，购于上海生工生物工 程技术服务有限公司，使用时溶解于50mM碳酸氢铵水溶液)，Ti02捕集柱，反 相分离柱250)imx50mm, C18-3,填充PEEK柱，美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统，美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离条件:流速:5jiL/min， 流动相A(0.1。/。甲酸水溶液)，B(含0.1%甲酸的ACN溶液)，梯度 0.0min(5%B)-20.0min(65o/oB)-35.0 min (65。/oB),进样量2^L。 MS条件喷雾电 压2kV，加热毛细管温度180°C,正离子模式，扫描范围m/z=400-2000
样品卩-casein (牛奶提取物，购于sigma公司)的蛋白酶解产物。
请参阅图2，即利用本发明所提供的方法在对磷酸化肽段进行HPLC-ESI/MS 分离检测得到的总离子流图。其中A为50|ig/mL (3-casein蛋白酶解产物直接进行 分离得到的谱图；B为100pL 1mg/mL卩-casein蛋白酶解产物经Ti02柱富集，收 集的200^L磷酸化肽段洗脱组分，经IO倍稀释后进行分离得到的谱图(相当干 反应时间为O时取样)；C为100^Llmg/mL卩-casein蛋白酶解产物经Ti02柱富集 后的200iiL磷酸化肽段洗脱组分，经冷冻干燥后，加入1250pU4iL碱性磷酸酶进 行去磷酸化处理，25。C反应,从Os开始，每隔10min取样一次，连续取样4次， 其中30min取样进行分离得到的谱图。
经Ti02柱富集后，磷酸化肽(m/Fl032、 1279)得到了选择性富集，其相对
丰度得到大大提高；进而经碱性磷酸酶的去磷酸处理后，可以检测和发现难以电 离的多磷酸化肽(m/z=1402为多磷酸化肽段完全去磷酸化所对应的非磷酸化肽， m/z=1442为多磷酸化肽部分去磷酸化后的单磷酸化肽)，同时可以佐证单磷酸化 肽段的存在(磷酸化肽段m/z=1032去磷酸化后为m/z=992;磷酸化肽段m/z=1279 去磷酸化后为m/z=1239 )。 实施例3
实验条件碱性磷酸酶溶液，Ti02捕集柱，反相分离柱250Mmx50mm， C18-3拜填充PEEK柱，美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统，美国Finnigan
公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检测条件参阅实施例2。 样品(3-casein蛋白酶解产物。
图3为通过改变反应温度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离检 测得到的的总离子流图。A为lOO^iL lmg/mL (3-casein蛋白酶解产物经7102柱富 集，收集的200jiL磷酸化肽段洗脱组分，经IO倍稀释后的样品进行分离得到的 谱图(相当于反应时间为0时取样)；B为lOO^iL lmg/mL卩-casein蛋白酶解产物 经TiO2柱富集后的200nL磷酸化肽段洗脱组分，经冷冻干燥后，加入1250pU/iiL 碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，25。C反应，从0s开始，每隔10min取样一次，连 续取样4次，其中30min取样进行分离得到的谱C为样品B在37。C反应，从0s开始，每隔10min取样一次，连续取样4次， 其中30min取样进行分离得到的谱图。
37"C反应30min后，去磷酸化完全，可以检测到难以电离的多磷酸化肽段 (m/z^l402为多磷酸化肽段所对应的非磷酸化肽)；通过降低反应温度(25°C ),
控制去磷酸化反应的程度，可以检测到多磷酸化肽部分去磷酸化后得到的单磷酸 化肽(m/^1442)。 实施例4
实验条件碱性磷酸酶溶液，Ti02捕集柱，反相分离柱250pmx50mm, C18-3(im填充PEEK柱，美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统，美国Finnigan
公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检观條件参阅实施例2。
样品10(VLlmg/mL卩-casein蛋白酶解产物经Ti02柱富集后，收集的200pL
磷酸化肽段洗脱组分，经冷冻干燥后的固体粉末，分别加入100)iL—定浓度的碱 性磷酸酶，25。C反应，从0s开始，每隔10min取样一次，连续取样4次，以30min
取样的分离谱图作以比较。
图4为通过改变磷酸酶浓度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离 检测得到的总离子流图。其中A为加入125pU4iL碱性磷酸酶，进行30min取 样进行分离得到的谱图，B为加入417iiU4iL碱性磷酸酶，进行30min取样进行 分离得到的谱图，C为加入1250iiU4iL碱性磷酸酶，进行30min取样进行分离得 到的谱图。
通过改变磷酸酶的浓度，同样可以实现部分去磷酸化作用，而得到多轔酸化 肽部分去磷酸化后的单磷酸化肽(m/z=4442)的检测。 实施例5
实验条件125pU4iL碱性磷酸酶溶液，Ti02捕集柱，反相分离柱 250pmx50mm, C18-3,填充PEEK柱，美国Michrom公司Paradigm MG4液相 系统，美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检测条件参阅实施例 2。
样品100^1mg/mLp-casein蛋白酶解产物经Ti02柱富集后，收集的200jiL 磷酸化肽段洗脱组分，经冷冻干燥后的固1^^末，加入100mL 125pU/^iL碱性磷 酸酶溶液，25°C，分别进行0、 5、 15、 30、 45、 60、 120、 150、 180、 240、 270、 360、 420min取样，并进行质谱分析。结果显示，从5min开始，已经有去磷酸化 作用。
图5为通过改变反应的时间来控制去磷酸化程度的样品经HPLC-ESI/MS分 离检测得到的总离子流图。其中A反应时间为180min, B反应时间为270min， C反应时间为420min。
通过改变磷酸酶的反应时间，可以实现部分去磷酸化作用，多磷酸化肽经部 分去磷酸化后相应的单磷酸化肽(m/z=1442)得到检测，图中还可以看出单磷酸 化肽(m/z=1442)在两个位置出峰，且两峰峰面积均呈现由小到大的变化趋势。
权利要求
1. 一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法，其特征在于利用磷酸酶对磷酸化肽段进行处理，通过控制磷酸化肽段的去磷酸化程度，将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行分析和比较，从而可以测定多磷酸化肽段，并确定其磷酸化位点。
2、 按照权利要求1所述电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法， 其特征在于:所述控制磷酸化肽段的去磷酸化程度方式为，控制反应pH值在1-14; 酶与底物的用量之比在1:1至100,000: 1 (U: g);反应温度在10-50°C;分别于反 应时间为0、依次间隔5s -0.5h取样，进入电喷雾质谱中进行分析和比较、直 至磷酸化肽段完全去磷酸化；其取样次数应> 4。
3、 按照权利要求1所述电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法， 其特征在于所述磷酸化肽段具有两个或两个以上磷酸化位点；所述样品可以是含有磷酸化肽段的混合物，也可以是通过亲和富集和纯化后 得到的磷酸化肽混合物，或者是单个具有多磷酸位点的肽段。
全文摘要
本发明涉及磷酸化肽的检测方法，具体地说是一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法。利用磷酸酶对磷酸化肽进行处理，通过控制磷酸化肽的去磷酸化程度，将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行分析和比较。从而测定磷酸化肽段，并确定其磷酸化位点。本发明的优点为可作为一种电喷雾质谱中初步判断多磷酸化肽段存在的方法；可提高多磷酸化肽段的质谱响应信号和检出率；通过控制反应条件能够推测多磷酸化肽段的磷酸化位点，并可作为一种多级质谱分析的验证方法；方法简单、操作方便、条件可控，容易实现在线分析。
文档编号G01N30/00GK101206198SQ20061013498
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者丛永正, 张丽华, 张玉奎, 张维冰, 振 梁, 段继诚, 晖 王 申请人:中国科学院大连化学物理研究所