分散复合体及其制造方法

专利名称：分散复合体及其制造方法
技术领域：
本发明涉及在振动分光法中利用表面增强效果的所有的分析方法。特别是涉及需要进行蛋白质在水溶液中的功能分析等生物成分的分析的生命科学领域、及需要进行环境中的有害物质等的分析的地球·环境领域里的分析方法。
背景技术：
弄清蛋白质·核酸等生物功能性物质的生理功能是非常重要的课题，但是在实现生物反应器、生物传感器、DNA芯片、及不久将来的生物元件等的过程中，更不可缺少的是其物理化学性质的控制和设计。因此，人们期望生物功能性物质的物理化学性质的测定方法或用于测定的分析用试剂得到发展。
生物功能性物质在生物体中具有活性，且该生物体是以水为介质的。因此其物理化学性质的解析也有必要在水溶液中实施。作为在水中考察生物功能性物质的结构和与基质分子间的相互作用的分析方法，有振动分光法之一的拉曼分光法。
然而，由于通常由拉曼分光法得到的信号强度非常低，灵敏度差，因此需要试样的浓度达数％以上。为此，当采用生物功能性物质时，必须进行试样的浓缩操作，从而会带来成本问题及在操作中发生试样的损失或变性等危险的问题。
另一方面，已知在拉曼分光法中，当试样与金属微粒相互作用时，具有信号强度放大的表面增强效果(“Surface Enhanced RamanScattering”，ed.by R.K.Chang and T.E.Furtak，(Plenum Publishing，N.Y.，1982))。该增强灵敏度通常被认为是1万倍至100万倍。
以凝聚状态使用上述的金属微粒时，表面增强效果非常明显。利用表面增强效果的测定法作为生物工程学的研究手段也是较为重要的(K.Kneipp，H.Kneipp，I.Itzkan，R.R.Dasari，and M.S.Feld，BiomedicalApp“cations of Lasers，77(7)，915-924(1999)；Surface-enhancedRaman scatteringA new tool for biomedical spectroscopy)。
在最近的利用贵重金属微粒的凝聚的实验中，确认出可检测出一分子的高达100兆倍的表面增强效果(K.Kneipp，H.Kneipp，R.Manoharan，E.Hanlon，I.Itzkan，R.R.Dasari，and M.S.Feld，Appl ied Spectroscopy，52(12)，1493-1497(1998)；Extremely large enhancement factorsin surface-enhanced Raman scattering for molecules on colloidalgold clusters)。这种金属微粒被称为表面增强效果的基质。镓或镓砷等半导体同样也可以成为基质。
作为将金属微粒用作表面增强效果的基质时的状态，至今已有报告的是金属微粒胶体、将金属微粒以岛状沉积在表面上的薄膜、用溶胶凝胶法将金属微粒分散在其内部的玻璃基质、将金属微粒分散在其内部的聚合物基质等。另外，本发明人也在特开平11-61209号公报中公开了在分散有溶胀性层状硅酸盐等板状微粒的分散液中，通过由还原反应生成贵重金属微粒，从而得到稳定的贵重金属微粒分散体的技术。
在这些基质中，实用上最方便的是水溶液中的纳米金属微粒的胶体。其理由是具有1)可用液相法合成微粒，操作简便；2)可适用于连续流动分析体系；3)可以控制微粒的尺寸和形状；4)可以简单地确定表面积；5) 可以为了理论上的分析而改变形态等优点。(M.Kerker，D.S.Wang，H.Chew.O.Siiman，and L.A.Bumm，“SurfaceEnhanced Raman Scattering”，ed.by R.K.Chang andT.E.Furtak，(Plenum Publishing，N.Y.，1982)，pp.109-128；EnhancedRaman scattering by molecules adsorbed at the surface of colloidalparticles)。
无论如何，若要将金属微粒用作表面增强效果的基质，需要稳定地保持分散状态。以往作为控制分散状态的方法，基于金属微粒是疏液性微粒，提出了1)在液相中添加稳定剂；2)沉积于固相上(包括涂布)；3)含于上述的玻璃、聚合物等基质内；4)如上述的特开平11-61209号公报上所述，使溶胀性层状硅酸盐与金属微粒共存的方法等。
在这些控制方法中，作为用于液相中的稳定剂，已知的有十二烷基硫酸钠等表面活性剂、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶、聚乙二醇、N-乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、γ-球蛋白、明胶等保护胶体。另外，在特开平09-070527“胶体凝聚的防止方法”中，公开了三羟甲基胺基甲烷等缓冲剂的稳定化作用。
另外，作为沉积于固相上的方法，常用的是把微粒沉积于玻璃板上时在到达一定程度之后停止凝聚的方法。根据该方法，可以将由液相法合成的纳米微粒沉积于玻璃上，并产生尺寸及形态不同的凝聚。
但是，如在水溶液中的纳米贵重金属微粒的胶体，在以液体为分散介质的疏液性微粒的分散相中，即使使用了稳定剂，在保持微粒的功能性的状态下使之以凝聚状态滞留于溶液中而不沉淀，也是极其困难的。其结果，依赖于疏液性微粒的凝聚状态的表面增强效果的基质的制法，缺乏再现性及稳定性，而且其性能也不够充分。
此外，以往的稳定剂是通过附着在微粒表面，抑制微粒之间的靠近而防止其凝聚的，因此失去了作为金属微粒的重要功能的表面活性。即使将金属微粒沉积于固相上，凝聚尺寸分布的分散及偏差也较大，缺乏制法的再现性，而且不太稳定，因此用硫醇等的有机单分子层涂布之后，也只维持了数日左右的稳定性。在含于基质中时，会产生由基质引起的金属微粒表面活性的丧失、基质中的物质移动速度的下降，因此无法得到表面增强效果优异的基质。另外，在特开平11-61209号公报中所记载的技术中，因为在分散有板状微粒的分散液中生成金属微粒，所以金属微粒的生成需要很长的时间，除了增加成本之外，因将容易分解的乙酰二羧酸用作还原剂，操作不太方便。
即，在高度维持疏液性微粒的表面活性的前提下，可以以良好的再现性制造，长时间稳定且响应迅速的表面增强效果的基质至今没有出现。
发明目的因此，本发明的目的在于提供一种将如凝聚那样成群而存在的疏液性微粒作为分散相含有，并可将所得分散复合体作为实用的表面增强效果的基质使用的分析方法。
为了达到上述的目的，本发明的分析方法具有如下特征。即，在成群存在的疏液性微粒的分散相中，通过使分散性高于疏液性微粒的微粒(以下称为“分散性微粒”)以足以包覆疏液性微粒群周围的浓度共存于其中，获得分散复合体。由此获得的分散复合体可以被用作表面增强效果的基质。之后，使分散复合体和含测定对象物质的液体相接触，并利用由测定对象物质靠近于疏液性微粒群而获得的表面增强效果，用光学计测方法测定测定对象物质的浓度或性质。
根据本发明，由于利用分散性微粒维持疏液性微粒的集团状态，因此可以抑制过度凝聚或发生沉淀的现象。其结果，可以长时间维持作为表面增强效果的基质的性能，可以简便地实施利用表面增强效果的分析。
在本发明中，分散复合体通常由包括下述(a)-(d)的工序的方法制造。
(a)将疏液性微粒分散于液相中的工序。
(b)添加凝聚剂等开始凝聚，获得疏液性微粒群的工序。
(c)(b)工序之后，添加分散性微粒使其达到足以包覆疏液性微粒群的周围的浓度的工序。
(d)将所获得的疏液性微粒群作为分散复合体回收的工序。
作为疏液性微粒，没有特殊的限定，可以使用粒径接近原子尺寸的1-100nm的以选自金、银、铜、铂、镍、铟、钯中的至少1种以上金属为主成分的金属微粒或镓、镓砷等半导体微粒。但是也并不限于这些，可以表达不同于主体的功能的微粒皆可使用。
对于这些疏液性微粒没有特殊的限定，用液相法合成之后可以直接提供于(b)工序中。另外，也可以将由其它方法获得的微粒添加到溶液中之后进行搅拌等而使之分散于液相中。
对于开始凝聚而得到疏液性微粒群的方法没有特殊的限定，可以选择提高粒子浓度；加入像氯化钠或硫酸铝等那样可带来盐析现象的电解质，提高离子强度；用聚合物进行交联；提高温度；降低分散介质的极性等方法。
溶液中的微粒分散相的稳定性可用DLVO理论进行说明。下面以金微粒为例，进行根据DLVO理论的解释，但其它疏液性微粒同样也可以解释。在经过化学还原之后的金微粒中，附着有还原剂阴离子或配位化合物的金属阴离子，因此带负电荷(M.A.Hayat Ed.“Colloidal Gold”vol.1 andvol.2，Academic Press Inc.1984)。该静电排斥势和依赖于范德瓦尔斯力等的引力势的相对大小达到适当的平衡时，在总势能的曲线中表面为最大。如果微粒的动能不比该最大值大，则微粒无法超过该最大值而互相靠近，从而不会出现凝聚，因此体系较稳定。另一方面，如果由于抗衡离子的吸附等或离子强度的增加，使静电排斥势发生变化，则总势能曲线中的最大值会减小，粒子会克服能量障碍会凝聚在一起。而另一方面，由可交联多个微粒的聚合物的存在，会发生交联凝聚。
分散性高于疏液性微粒的微粒是指，在开始凝聚的状态下，由上述的DLVO理论的总势能曲线中所表现的最大值位置所示的粒子间距离远远大于功能性微粒的最大值位置所示的粒子间距离的微粒。或者，分散性高于疏液性微粒的微粒是指，具有在疏液性微粒的总势能曲线的最大值逐渐消失的状态下，在表示足够的粒子间距离的位置表现足够大的最大值的总势能曲线的微粒。总势能曲线形状主要取决于Hamaker常数和Stern电位值，因此在其定义中并不是特别限定疏液性微粒的种类。
作为这种分散性微粒的具体例，可举出绿土(smectite)等溶胀性层状硅酸盐。
作为分散性微粒的例子而特别举出溶胀性层状硅酸盐的理由是，其表面上带有负电荷，在疏液性微粒发生凝聚而沉积的状态下，也可以继续充分地分散。进而，在苛刻的条件下进行沉积也可以保持一定程度的缓和的凝聚状态，用搅拌等的剪切力可以很容易地进行再分散。另外，因粒径较小，用少量的重量浓度也可以以充分的数量存在于分散液中，包覆疏液性微粒的周围。此外，由于其形状为平板状，因此粒子间的相互作用容易发生，可以提高分散介质的表观粘度，降低粒子的扩散速度，从而防止疏液性微粒的凝聚。
层状硅酸盐不论是合成物还是天然物皆可使用，优选合成物。精制天然物之后所得到的溶胀性粘土矿物也可适用。合成物不同于天然物，化学上均匀，杂质少，不含凝聚性的离子，溶胀性高，而且层间不含有铁等有色金属，透明度高，因此更能适用于光学计测方法。
这种溶胀性层状硅酸盐已有市售品。
本发明中的分散相的分散介质，可以是水、乙醇、烃等液体或气体等，无特殊的限定，但优选使用水。此时，本发明的分散复合体为以水为分散介质的溶胶被予以回收。另外，本发明的分散复合体可以用干燥等方法作为凝胶回收。
对本发明中的分散性微粒的浓度没有特殊的限定，只要是足以包覆需要控制的疏液性微粒周围的浓度即可。在此，包覆周围这一概念是指，单位空间内所存在的分散性高的微粒的数目远远多于疏液性微粒的数目，并作为其结果而足以抑制所需控制的疏液性微粒的凝聚或沉淀即可。例如，当1000cc中的疏液性微粒的数目浓度约为10的12次方个时，分散性微粒的个数只要能达到10的15次方，就可以认为其比较充分。作为具体例，实施分析所需的疏液性微粒的优选浓度为0.01nM-4M，包覆该浓度范围的疏液性微粒所需的分散性微粒的浓度为，当采用溶胀性层状硅酸盐时通常在0.1g/L以上。另一方面，由溶胀性层状硅酸盐组成的分散性微粒的可调整的最高浓度通常为250g/L，浓缩时为300g/L。但并不限于此，随疏液性微粒的种类和浓度、开始凝聚的方法、及分散必微粒自身的性质有所不同。
根据本发明可以控制疏液性微粒的分散状态。至今尚无像本发明这样对集团状态的疏液性微粒进行控制以使之稳定的例子。另外，也没有像本发明可稳定化1个月以上的例子。根据本发明可以获得分散状态得到控制的疏液性微粒的分散复合体。在该分散复合体中，以利于表达功能的状态存在疏液性微粒的集团，可利用于光学元件、传感器、催化剂等中。
作为本发明中的测定对象物质，可以举出水溶液中的氨基酸、碱、蛋白质、核酸。另外，可举出环境中的芳香族氯化合物等。但并不限于这些。
作为本发明中的光学计测方法，可以使用拉曼分光法、红外分光法等振动分光法。已知的利用表面增强效果的光学计测方法有RAS(Reflectionabsorption spectroscopy)、SEWS(Surface electromagnetic wavespectroscopy)、SEIRA(Surface-enhanced infrared spectroscopy)、SERS(Surface-enhanced Raman spectroscopy)、SERRS(Surface-enhancedresonance Raman spectroscopy)、SEHRS(Surface-enhanced hyper Ramanscattering)等。
在本发明的分析方法中，作为疏液性微粒优选使用已确认可以在用于振动分光法的波长范围内显示表面增强效果的金、银、铜、铂、镍、铟、钯等金属微粒，或者镓、镓砷等半导体微粒。在本发明的分析方法中，作为分散性微粒，可以优选使用透光性良好的合成绿土。
在本发明的分散复合体中，金属微粒不会吸附在流动体系的管壁或容器壁上，至少在数个月的时间内可以发挥作为表面增强效果的基质的作用，因此可以实施在流动体系中的分析。当分散复合体为溶胶时，可作为表面增强效果的基质流入于流动体系内，并使之与含有测定对象物质的试样溶液相接触，用光学计测方法进行测定。作为这种流动体系的例子，已知的有毛细管电泳、各种色谱。
另外，当分散复合体为凝胶时，可如传感器，与含有测定对象物质的试样溶液相接触而使用。优选的是，将该分散复合体作为一次性传感器使用。当然该传感器也可以构成流动体系的一部分。
在本发明的分散复合体中，可使合成绿土具有修饰选自配位化合物、抗体、抗原、酶、酶基质、核酸、核酸补体中的一种以上物质，并由此识别或定向测定对象物质的功能。此时，由于离疏液性微粒表面相距一定距离时表面增强效果的灵敏度将会明显下降，因此只有所识别的物质或定向的一部分官能团贡献于表面增强效果，从而可以利用于选择性物质的测定方法。


图1是含有金微粒群及合成绿土的溶胶的吸收光谱。
图2是同一溶胶在20天之后的吸收光谱。
图3是含有金微粒群及蒙脱石(montmorillonite)的溶胶的吸收光谱。
图4是含有合成绿土及金微粒群的干燥凝胶的吸收光谱。
图5是含有吡啶及金微粒群的溶胶的拉曼光谱。
图6是含有吡啶及金微粒群的溶胶的拉曼信号强度的经时变化。
图7是含有分散复合体和吡啶的水溶液的校正曲线。
具体实施例方式
-分散复合体溶胶的调制例-利用向0.6mM的氯金酸水溶液120cc中添加柠檬酸钠至达1.6mM的化学还原法，在水溶液中合成了金微粒。用小角X射线散射法测定了金微粒的平均粒径，结果约为40nm。测定了所得到的含金微粒水溶液的吸光度，之后分到4个容器内，并在各个容器中作为凝聚剂添加氯化钠至达50mM/L，并开始凝聚。
此时，在第1容器内，金微粒的溶液的色调从当初的红色逐渐变成红紫色、蓝紫色、红褐色、褐色、黑色，最后产生沉淀。在第2-第4容器中，在经过各个所定时间之后，添加了合成绿土(Laporte社制)料浆。此时色调的变化被停止，得到了根据合成绿土的点火时期而显示不同色调的分散复合体。从添加氯化钠至添加合成绿土所经过的时间的顺序为第2容器(以下称为凝聚状态A)＜第3容器(以下称为凝聚状态B)＜第4容器(以下称为凝聚状态C)。图1表示的是添加氯化钠之前(＝凝聚前)、凝聚状态A、凝聚状态B及凝聚状态C的吸收光谱。还有，作为对比，测定了只有合成绿土时的吸光度。
在粒径相同时，金胶体的色调取决于粒子的凝聚状态(N.G.Khlebtsov，V.A.Bogatyrev，L.A.Dykman，and A.G.Melnikov，J.Colloid Interface Sci.，180(2)，436-445(1996)；Spectral Extinctionof Colloidal Gold and Its Biospecific Conjugates.)，因此由图1中所示的结果可知，根据本发明可以制造可控制金微粒的集团状态的分散复合体。
-分散复合体溶胶的稳定性评价1-图2中分别示出了上述调制例中的第1容器内溶液的吸收光谱、及凝聚状态A-C的分散复合体经过20天之后的吸收光谱。由图2可知，在含有合成绿土的分散复合体中，可以保持金微粒集团得到控制的状态，使之长期处于稳定状态。
-分散复合体溶胶的稳定性评价2-
用蒙脱石(クニミネ工业株式会社制)代替合成绿土之外，与上述调制例的凝聚状态A相同地调制了分散复合体。在室温放置数分钟之后也没有观察到色调的变化，但数日之后颜色逐渐变淡。但是没有产生沉淀。刚调制之后的1分钟后及20天后的吸收光谱示于图3中。由图3可知，在含有蒙脱石的分散复合体中也可以保持金微粒集团得到控制的状态，以使之处于稳定化。
-分散复合体凝胶的调制例和稳定性评价-准备通过紫外线照射使表面亲水化的聚苯乙烯制板，将由上述溶胶调制例所调制的凝聚状态A-C的分散复合体滴至该板上，并经干燥使之凝胶化。为了进行比较，在板上同样滴加了不含有合成绿土的含金微粒溶液，在含有合成绿土的凝胶中，金微粒在保持红褐色至褐色的色调的条件下均匀扩散在板上。其状态至少可以稳定保持6个月。另一方面，源于不含有合成绿土的溶液的金微粒作为黑色的沉淀物不均匀地扩散在板上。为了便于确认，图4中示出了从板上所获得的固体分散复合体的吸收光谱。由图4可知，因合成绿土的存在，可以保持金微粒集团得到控制的状态，从而使之稳定化。
-实施例1-在调制上述溶胶调制例的分散复合体(凝聚状态B)之后，取其570μl，与0.05M的吡啶水溶液30μl充分混合，作成第1混合液。另外，取570μl的纯水，与0.05M的吡啶水溶液30μl充分混合，作成第2混合液。对于这2种混合液，采用具有拉曼模件的傅立叶变换红外分光装置NicoletMagna650，在激发波长1064nm下测定了拉曼光谱。
其结果，在第1混合液中，强烈地表现出了2.5mM的吡啶的环呼吸振动(约1010cm-1)。另一方面，在第2混合液中(通常的拉曼分光)，完全没有观察到该浓度的吡啶。因此，可以看出上述分散复合体可以用作用市售的拉曼分光器可简便地进行利用表面增强效果的分析的表面增强效果的基质。
另外，在绿土等硅酸化合物中通常如485cm-1Si-O-Si rocking/bending of hydrated silicate809cm-1SiO2silicate chain mode976cm-1Si-O stretch of bulk chain等拉曼峰，但在第1混合液中这些没有出现。因此，确认不存在硅酸化合物的干扰。这一点明显不同于例如以往所作出的在溶胶凝胶玻璃的拉曼光谱中出现源于硅酸化合物的拉曼峰，而成为背景的报告( F.Akbarian，B.S.Dunn，and J.I.Zink，J.RamanSpectrosc.，27(10)，775-783(19 96)Porous sol-gel silicatescontaining gold particles as matrixes for surface-enhanced Ramanspectroscopy)。
-实施例2-在调制上述溶胶调制例的分散复合体(凝聚状态B)之后，经过一日后取其570μl，与0.05M的吡啶水溶液30μl充分混合，作成第3混合液。同样，在调制不含有合成绿土的金微粒凝聚液并过一天之后，取其570μl，与0.05M的吡啶水溶液30μl充分混合，作成第4混合液。对于这2种混合液，采用具有拉曼模件的傅立叶变换红外分光装置Nicolet Magna 650，在激发波长1064nm下测定了拉曼光谱，并将其结果示于图5中。
由图5可知，在含有合成绿土的第3溶液中，强烈地表现出了2.5mM的低浓度吡啶的环呼吸振动(约1010cm-1)。另一方面，在不含有合成绿土的第4溶液中，基本上没有观察到这些。由此可知，可以看出上述分散复合体经过一天之后也可以用作用市售的拉曼分光仪可简便地进行利用表面增强效果的分析的表面增强效果的基质。
-实施例3-在室温保存上述溶胶调制例的分散复合体(凝聚状态B)，经过所定天数之后，用实施例1的方法测定了吡啶的拉曼光谱，并将环呼吸振动的信号强度的变化相对于分散复合体的保存期间进行标绘(图中的●印)，从而得到了图6。作为对比，使用了实施例2的第4混合液(图中的×印)。由图6可知，上述分散复合体在将近2个月的长时间内可以作为表面增强效果的基质发挥作用。
-实施例4-采用与实施例1相同的方法，并改变吡啶水溶液的浓度，分析了以本发明的分散复合体作为表面增强效果的基质的吡啶水溶液。由分析结果作出校正曲线之后将其结果示于图7中。由图7可知，本发明的分散复合体可以使用对应于浓度测定的表面增强效果的基质发挥作用。
如上所述，本发明的物质分析方法可利用于微量物质或低浓度物质的分析。
权利要求
1.一种分散复合体，其中具有含凝聚剂的液相；在所述液相中成群存在的疏液性微粒；和分散性高于所述疏液性微粒且以足以包覆该疏液性微粒群周围的浓度与所述疏液性微粒共存于所述液相中的分散性微粒。
2.根据权利要求1所述的分散复合体，其中所述凝聚剂为生理活性物质、电子传递物质、光功能性物质。
3.根据权利要求1所述的分散复合体，其中所述疏液性微粒以选自金、银、铜、铂、镍、铟、钯中的至少1种金属为主成分。
4.根据权利要求1所述的分散复合体，其中所述分散性高于疏液性微粒的微粒选自溶胀性层状硅酸盐。
5.根据权利要求4所述的分散复合体，其中，所述溶胀性层状硅酸盐为合成绿土。
6.一种分散复合体的制造方法，其中包括向分散有疏液性微粒的液相中添加凝聚剂，得到疏液性微粒群的步骤；和使分散性高于所述疏液性微粒的分散性微粒，以足以包覆该疏液性微粒群周围的浓度共存的步骤。
7.根据权利要求6所述的分散复合体的制造方法，其中作为所述凝聚剂使用生理活性物质、电子传递物质、光功能性物质。
8.根据权利要求6所述的分散复合体的制造方法，其中所述疏液性微粒以选自金、银、铜、铂、镍、铟、钯中的至少1种金属为主成分。
9.根据权利要求6所述的分散复合体的制造方法，其中所述分散性高于疏液性微粒的微粒选自溶胀性层状硅酸盐。
10.根据权利要求9所述的分散复合体的制造方法，其中，所述溶胀性层状硅酸盐为合成绿土。
全文摘要
一种分散复合体，其中具有含凝聚剂的液相；在所述液相中成群存在的疏液性微粒；和分散性高于所述疏液性微粒且以足以包覆该疏液性微粒群周围的浓度与所述疏液性微粒共存于所述液相中的分散性微粒。本发明的分散复合体可应用于微量物质或低浓度物质的分析。
文档编号G01N1/38GK1982868SQ20061011488
公开日2007年6月20日 申请日期2001年3月9日 优先权日2001年3月9日
发明者福冈隆夫, 中村圭太郎, 森康维 申请人:福冈隆夫