专利名称：腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定 腺苷脱氨酵活性的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关 系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，
脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是 腺苷(白色结晶粉末)+水(H20 )腺苷脱氨酶肌苷(Inosine ) + 氨离子(NH/)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因 此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大 小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用 专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时，本发明还将给出用以实现该 方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光 分析仪或半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测 定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明腺苷脱氨酶活性测定方法原理如下
腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子
氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
这种方法应用腺苷脱氨酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(EC 1.4丄1)酶促反应连 续监测法。腺苷脱氨酶解腺苷反应产生氨离子，再通过(偶)联合丙 氨酸脱氢酶(EC 1.4丄1)的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸 收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测 定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光 度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合 考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨 酶诊断试剂盒较为理想
缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
氨酸脱氢酶 10000 U/L
丙酮酸 12mmol/L 腺苷 6 mmol/L
本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂，更有利于消除内外源氨 离子污染-
试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷。 腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不 限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂，不但有利于消除内外 源氨离子污染，还有利于试剂的稳定 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、腺苷。 腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定腺苷脱氨酶活性的方法， 其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙氨酸脱氢酶 8000 U/L
腺苷 8 mmol/L
丙酮酸 12 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻千燥，制成干粉试剂; 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起 始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺 苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反 应)，延迟时间大约1.5分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一 4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生
化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷
脱氨酶的活性大小。
实施例二
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
丙酮酸
磨mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 1幽0U/L 12 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 腺苷
50 mmol/L
8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷 脱氨酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约1.5分钟左右，检测时间2分钟左右，理 论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺 苷脱氨酶的活性大小。 实施例三
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括
试剂1 缓冲液 稳定剂 还原型辅酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
缓冲液 稳定剂
丙氨酸脱氢酶
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L
,0 U/L 12 mmol/L
试剂3
缓冲液 稳定剂 腺苷
100mmol/L 50 mmol/L 8 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定腺苷脱氨酶活性时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C， 反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副 波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比
例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1.5分
钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值一2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺 苷脱氨酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析
仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物
质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种腺苷脱氨酶活性测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972320002C1.gif" wi="132" he="26" top= "38" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小测定结果。还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
2. —种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括-缓冲液 40——500 mmol/L稳定剂 1——50mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L丙氨酸脱氢酶 200——500000 U/L腺苷 0.2——9mmol/L丙酮酸 2——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(EC 1.4丄1)组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(EC 1.4丄1)组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 丙酮酸、丙氨酸脱氢酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷组 成。还原型辅酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶(EC1.4丄1)组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、 组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶组成； 试剂3，由缓冲液、稳定剂、腺苷组成。还原型辅酶、腺苷、丙酮 酸、丙氨酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1^000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、腺苷、丙酮酸、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N21/78GK101169373SQ20061009723
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司