专利名称：5'-核苷酸酶诊断试剂盒及5'-核苷酸酶活性浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测 定5'-核苷酸酶活性浓度的测定方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆， 也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁 性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉 芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5'-核苷酸酶活性无 生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸 酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5'-核苷酸酶的活性对于疾病 的诊断具有重要意义。
5'-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强 酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底 物测试法，方法为5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过 离子交换层析柱分析结果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷 酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含 量得以计算出5'-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪， 因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度 不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶
(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5'-核苷酸
酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5'-核
苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或
半、全自动生化分析仪上进行5'-核苷酸酶活性浓度的测定，而且测
定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5'-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下 腺苷单磷酸+水5'-核苷酸酶腺苷+单磷酸盐
腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子
氨离子+ a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+ a-酮戊二酸+
过氧化氢
这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)将 腺苷酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3 或EC 1.4丄4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)作为循环酶谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷 氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及OC-酮戊二酸，使氨不断地被 重复循环利用。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3 或EC 1.4丄4)作为显色酶，使还原型辅酶(在340nm处有吸收 峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测 定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的速度，通过测量340nm处 吸光度下降的速度，可以测算出5'-核苷酸酶活性浓度。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5'-核苷酸 酶诊断试剂盒较为理想
缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
腺苷脱氨酶 2000 U/L
谷氨酸脱氢酶 50000 U/L
谷氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16mmol/L
本发明的5'-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、腺苷脱氨酶、谷氨酸 脱氢酶、谷氨酸氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶。
a-酮戊二酸、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶。 a-酮戊二酸、腺苷脱氨酵、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂 1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定5'-核苷酸酶活性浓度 的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一 种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 腺苷脱氨酶
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸
0.25 mmol/L 2000 U/L 50000 U/L 10000U/L 16 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起 始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样 品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方 法为速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生 化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核苷酸酶活性浓度的大小。 实施例二
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
谷氨酸脱氢酶
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 40000 U/L 15000 U/L 12 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 腺苷脱氨酶
50 mmol/L
4000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品 与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核 苷酸酶活性的浓度大小。 实施例三
本实施例的5'-核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
a-酮戊二酸
50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 谷氨酸脱氢
50 mmol/L 60000 U/L
谷氨酸氧化酶 20000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
腺苷脱氨酶 4000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定5'-核苷酸酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温 度37。C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm， 测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为 4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟 时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5'-核 苷酸酶活性浓度的大小。
总之，实验证明，釆用本发明的测定方法完全可以通过一般生化 分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外 源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下腺苷单磷酸+水 5’-核苷酸酶 腺苷+单磷酸盐腺苷+水 腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 +辅酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+ 过氧化氢将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5’-核苷酸酶活性浓度大小测定结果。腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作为作用酶，功能为将腺苷酶解产生氨。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出5’-核苷酸酶活性浓度。还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
2. —种5'-核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括-缓冲液 40——500 mmol/L稳定剂还原型辅酶腺苷脱氨酶1-50 mmol/L0.1-0.35 mmol/L2000^~50000 U/L2000-500000 U/L2000——500000 U/L2 20 mmol/L谷氨酸氧化酶 a-酮戊二酸其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定齐U、还原型辅酶、ot-酮戊二酸、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、ot-酮戊二酸、腺苷脱氨酶 (Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC L4丄3或EC 1.4丄4)、谷氨酸氧化酶 (Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成双剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶组成。 a-酮戊二酸、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成多剂试剂；试剂 1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸组成；试剂2，由 缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶组成；试剂3，由 缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶组成。ot-酮戊二酸、腺苷脱氨酶、谷 氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可 以不限。
6. 根据权利要求2所述5'-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于还 包括稳定剂14000 mmol/L或0.in/。-100Q/。体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少-一种。
全文摘要
本发明涉及一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒可以是干粉状态，在使用前溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、α-酮戊二酸、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、还原型辅酶及稳定剂，这些成分可以配成单剂试剂盒、双剂试剂盒及三剂试剂盒；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出5’-核苷酸酶活性的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
文档编号G01N21/78GK101097201SQ200610085588
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司