专利名称：一种用于蛋白质n－端肽特异性识别与测序的方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质N-端肽段特异性识别与质谱测序的新方法和试剂盒。
背景技术：
众所周知，蛋白质的N端信息对蛋白质的结构确定及功能阐述都非常重要。一方面，蛋白质的N端序列标签具有很高的特异性。据统计，43％至83％的蛋白质具有独特的N端4残基标签[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白质的N端序列有助于确证蛋白质的N端加工[Chung，J.J.，Shikano，S.，Hanyu，Y.，Li，M.，Trends Cell Biol.2002，12，146-150.]。虽然蛋白质的N-端肽段包含重要的生物学信息，但是由于蛋白酶切过程中，大量非末端肽段的产生对于特异性识别和鉴定蛋白质的N-端肽段造成困难。Edman降解是一种常规的蛋白质的N-端鉴定方法，但是相对较高的测序费用以及非N-端肽信息的缺少，成为这种测序方法的不足。随着质谱技术的快速发展，虽然文献中有一些富集或鉴定蛋白质N端的方法[Yamaguchi，M.，Nakazawa，T.，Kuyama，H.，Obama，T.et al，Anal.Chem.2005，77，645-651]，但目前并没有一个简单易行的方法可从复杂的蛋白酶切肽段中特异性识别蛋白N-末端并对其进行有效测序。
发明内容
本发明提供了一种简单有效，既可特异性识别蛋白质N-端肽段，又可促进其质谱测序，从而提高蛋白质N-端肽段序列分析确定性和可靠性的方法。步骤包括(a)用一种或多种胍基化试剂对蛋白的侧链氨基进行修饰，封闭蛋白所有侧链氨基；(b)用一种或多种化学试剂对蛋白质N-端氨基进行修饰；(c)用一种或多种还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；(d)用一种或多种烷基化试剂封闭疏基防止其重新形成二硫键；(e)用一种或多种化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，以产生适于质谱分析的肽段；(f)用质谱分析技术特异性识别并分析蛋白质N端肽段，产生二级质谱图；(g)对质谱数据进行解析，以鉴定蛋白质并得到蛋白质的N端序列信息。
其特征在于所述步骤(b)的修饰方法为用稳定同位素标记的酸酐试剂，特异性对蛋白质N-端氨基进行修饰；再用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
上述稳定同位素标记的酸酐试剂优选乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐；更优选d0/d6-乙酸酐试剂。
上述含游离氨基的化学试剂优选三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
在本发明的实施例中，还提供了一种更优选的修饰方法，即用d0/d6-乙酸酐试剂对蛋白质N-端氨基进行修饰；再用三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸对蛋白质的修饰反应进行终止。
该方法在整体蛋白质水平上通过胍基化修饰封闭侧链氨基，然后通过同位素标记的酸酐试剂在整体蛋白水平上特异性修饰其N-末端氨基，酶切后，通过质谱技术实现蛋白质的N-末端的特异性识别及末端测序分析。特异性标记的蛋白N-末端在质谱中会出现特征性的一对同位素峰而区别于其他非末端酶解肽段，因而容易识别，同时胍基化修饰使赖氨酸转变为高精氨酸，可以显著增强肽段的质谱信号和检测灵敏度，促进肽段离子的裂解，简化其二级质谱图，从而有助于其序列分析。
利用本方法，特异性识别蛋白质的N-端肽段，显著提高了N端肽被质谱鉴定的确定性，二级质谱图的质量明显改善，可根据二级质谱图对蛋白质末端肽进行从头测序，提供一种非Edman蛋白N-末端测序方法。
本发明还涉及用于方便实施本方法的试剂盒。该试剂盒含有(a)用于特异性标记蛋白N-末端氨基的一种或多种同位素标记的酸酐试剂；(b)对蛋白质的修饰反应进行终止的一种或多种含游离氨基的化学试剂。
其中组分(a)优选同位素标记的乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐，更优选d0/d6-乙酸酐试剂；组分(b)优选三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种(a)一种或多种胍基化试剂，优选o-甲基异脲，对蛋白质侧链氨基进行修饰，使赖氨酸转变为高精氨酸；(b)一种或多种还原剂，优选二硫苏糖醇(DTT)；(c)一种或多种烷基化试剂，优选碘乙酰胺；(d)一种或多种蛋白质消化剂，优选胰蛋白酶；(e)一种或多种蛋白质变性剂或增溶剂；(f)方法的操作说明。
本发明的新方法和试剂盒适用于蛋白质N-末端肽段特异性识别和质谱测序，特别适用于生物学、医学和药物学领域中进行蛋白质的鉴定及末端分析。本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质研究。
图1胍基化乙酰化修饰的BSA酶解肽段。a为乙酸酐标记的胍基化修饰的BSA酶解肽段乙酰化标记肽段；b为乙酸酐和氘代乙酸酐等摩尔混合标记的胍基化修饰的BSA酶解肽段；c为氘代乙酸酐标记的胍基化修饰的BSA酶解肽段。
图2为图1的局部放大图。
图3特异性识别的N端肽的串联质谱图。
具体实施例方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
例牛血清白蛋白中N端肽段的特异性识别与测序1.1取500μg牛血清白蛋白，溶于500μl 0.1％SDS，1M o-甲基异脲的氢氧化钠溶液(pH12)37℃反应4小时，将样品等分为三份分别加入3μl 1M的d0-乙酸酐，1∶1混合d0/d6-乙酸酐，d6-乙酸酐，室温反应2小时后，加入100mM的Tris/HCl终止反应。10mM终浓度DTT 37℃反应1小时，25mM终浓度碘乙酰胺室温暗处反应2小时，复加终浓度为10mM DTT室温反应1小时，去除多余的碘乙酰胺。分别加入3ug胰蛋白酶，37℃酶切12小时后，pH值调至12，去酯化30分钟。
1.2质谱分析在装备了氮激光器(337nm)的4700Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。样品经适当稀释和基质溶液(5mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等体积混合，点0.6uL于靶上，自然挥干后进行质谱分析。先用肽标准物进行外部质量校准，质量测量的准确度通常为±0.1Da，在正离子反射模式下采集一级质谱图，可见N端肽段为成对峰，其它肽段为单峰。选择相应肽的[M+H+]+离子作为母离子进行串联质谱分析，可观察到质量很好的二级质谱图。
权利要求
1.一种用于蛋白质N端肽段的识别与测序的方法，该方法包括(a)用一种或多种胍基化试剂对蛋白的侧链氨基进行修饰，封闭蛋白所有侧链氨基；(b)用一种或多种化学试剂对蛋白质N-端氨基进行修饰；(c)用一种或多种还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；(d)用一种或多种烷基化试剂封闭疏基防止其重新形成二硫键；(e)用一种或多种化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，以产生适于质谱分析的肽段；(f)用质谱分析技术特异性识别并分析蛋白质N端肽段，产生二级质谱图；(g)对质谱数据进行解析，以鉴定蛋白质并得到蛋白质的N端序列信息。其特征在于所述步骤(b)的修饰方法为用稳定同位素标记的酸酐试剂，特异性对蛋白质N-端氨基进行修饰；再用一种或多种含游离氨基的化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于稳定同位素标记的酸酐试剂选自同位素标记的乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于稳定同位素标记的酸酐试剂选自d0/d6-乙酸酐。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于含游离氨基的化学试剂选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(b)的修饰方法为用d0/d6-乙酸酐试剂对蛋白质N-端氨基进行修饰；再用三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸对蛋白质的修饰反应进行终止。
6.一种用于蛋白质N端肽段识别与测序的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有(a)用于特异性标记蛋白N-末端氨基的一种或多种同位素标记的酸酐试剂；(b)对蛋白质的修饰反应进行终止的一种或多种含游离氨基的化学试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于(a)选自同位素标记的乙酸酐、丙酸酐或琥珀酸酐。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于(a)选自d0/d6-乙酸酐试剂。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于(b)选自三羟乙基氨基甲烷或赖氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质N－端肽段的特异性识别与质谱测序的新方法和试剂盒。本方法和试剂盒可用于特异性识别蛋白质的N端肽段、提高蛋白质N端肽段被鉴定的确定性和可靠性，适用于生物学、医学、药物学研究和应用领域中蛋白质的鉴定和N端分析。
文档编号G01N1/28GK101055266SQ20061007259
公开日2007年10月17日 申请日期2006年4月13日 优先权日2006年4月13日
发明者钱小红, 刘新, 周春喜, 应万涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所