专利名称：口蹄疫病毒定型试纸条及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及对口蹄疫病毒的血清型进行快速准确诊断领域，具体说是一种口蹄疫病毒定型诊断试纸条，本发明包含有该试纸条的制备和使用方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth diease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性、热性、接触性传染病，其感染率之高，传播速度之快，对社会危害之大，均居众多疫病之最。国际兽疫局(OIE)将其列为A类烈性传染病之首。由于口蹄疫的暴发，已经影响到国际关系、国家声誉和世界各国的经济发展，因此有人称此病为“政治经济病”。口蹄疫病毒有O、A、C、Asia I、SATl、SAT2和SAT3 7个血清型，80多个亚型，血清型间无交叉型免疫反应，而各亚型之间仅有部分交叉免疫原性，而且口蹄疫病毒不断变异，新的变异株和来亚型的不断出现，给口蹄疫的预防和控制带来了极大的困难。在国际交流、外贸、进出口等方面各国都采取严加防范的措施，我国在进出境动植物检疫法也将口蹄疫病的检测放在第一位。
2005年5月国务院公布了我国Asia I型口蹄疫病毒疫情的流行状况，这使各级防疫机构对口蹄疫诊断与防控更加重视。根据口蹄疫暴发时传播迅速、来势凶猛、发病范围广等特点，简便快速的病原学诊断对疫情控制尤为重要。它可使一线防疫人员在疫情暴发时对现场做出正确的诊断，及时确定病原、切断传播途径、采取有效的防范措施保障我国养畜业的健康、稳定发展。
目前，在世界口蹄疫参考实验室口蹄疫病毒检测及定型的常规方法仍是ELISA、病毒分离、RT-PCR等方法。这些方法不仅需要一定的仪器设备和实验室设施，而且需要相关实验技能的技术人员操作。同时操作复杂，过程繁多，成本高，不利于基层、田间口蹄疫流行病学调查及疫情防控的开展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可确定口蹄疫病毒O、A、Asia I、C型四种血清型的口蹄疫病毒定型诊断试纸条。该试纸条操作快速简便，15min内即可显示结果，判定直观容易，结果敏感特异，费用低廉，运输保存方便，非常适用于基层人员在田间检测使用。
本发明的另一目的在于提供这种定型试纸条的制备方法。本发明的再一目的在于提供这种定型试纸条的使用方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现的一种口蹄疫定型试纸条，由O、A、Asia I、C四种血清型检测试纸条组成，其特征在于所述试纸条由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫部分组成，所述PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上部左端贴有吸收垫，硝酸纤维素膜上部右端设有金标垫，金标垫的上部右端设有样品垫。
所述的吸水纸和金标垫与硝酸纤维素膜的衔接处有交叠，金标垫与样品垫之间也有交叠。
所述的硝酸纤维素膜上左端喷有抗兔、豚鼠和鼠IgG抗体为质控带；硝酸纤维素膜上右端喷有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体为检测带；金标垫上喷有胶体金标记的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体。
所述的硝酸纤维素膜和金标垫上喷有的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体为兔或豚鼠口蹄疫病毒抗体或口蹄疫病毒单克隆抗体上述口蹄疫定型试纸条的制备方法为1、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；2、胶体金标记的O、A、C、Asia I型口蹄疫病毒抗体制备首先将a步制得的胶体金用0.1mol/L K2CO3调整PH值为8.0-8.5；然后用目测法确定胶体金与待标记抗体应标记的最佳量，得到最佳标记量为4-10mg/100mL，在胶体金溶液中按4-10mg/100mL加入口蹄疫病毒抗体，搅拌10～20min；在胶体金溶液中按0.5-1g/100ml加入牛血清白蛋白，继续搅拌10～20min，将上述胶体金经2000-4000r/min离心10-20分钟，去除沉淀物，得上清液；将上清液经10000～12000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于1/20-1/10初始胶体金体积的金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存；3、定型诊断试纸条组装3.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH7.2-7.6 0.02mol/L磷酸盐缓冲液分别将抗兔、豚鼠和鼠IgGG抗体和O、A、C、Asia I口蹄疫抗体调整至1-2mg/ml和1.4-2.2mg/ml工作浓度，分别按1.8-2ul/cm设置喷膜，将上述两种抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控带与检测带，37℃烘干或室温晾干后，置于封闭液中浸泡5-15min，取出后室温下晾干，保存备用；3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，按10-20μL/cm将胶体金标记的O、A、C、Asia I口蹄疫抗体分别喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用；3.3试纸条的组装在PVC背衬板由下至上分别将样品垫、胶体金垫，包括检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸收垫按顺序装配，剪切成条状，即制成不同型口蹄疫病毒诊断试纸条，口蹄疫O、A、C、Asia I型四种试纸条作为一个包装装入铝塑袋中即为口蹄疫定型诊断试纸条。
上述金胶缓冲液为含5-15％蔗糖、1％BSA、0.5-1‰PEG20000、0.5-1‰Tween-20的PH7.5 0.11mol/L的磷酸盐缓冲液。
上述封闭液为含2.5-5％犊牛血清，0.5-1‰Tween-20的PH7.4 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
本发明口蹄疫定型试纸条的使用方法为1、待检样品的处理无菌操作将待检水疱皮或乳鼠组织用PH7.2-7.50.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液洗2-3次，并用消毒滤纸吸去水份称重，加入玻璃砂研磨，按1∶3～1∶10w/v加入PH7.2-7.5 0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，制成悬液；室温浸毒2小时或4℃冰箱内浸毒一夜。振摇后以4000r/min离心10min，取上清液即为待检样品；待检水疱液可直接作为待检样品；2、样品检测待检样品、检测试纸或其它检测用材料等均在室温平衡，将检测试纸有标志线的一端插入待检样品中，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，5-15分钟内观察结果；3、结果判定3.1单支试纸条结果判定阳性质控带(6)与检测带(7)都出现清晰可见红色条带；阴性只有质控带(6)出现清晰可见红色条带；可疑质控带(6)出现一条颜色清晰可见的红色条带，而在检测带(7)出现一条浅色带；无效质控带(6)没有出现红色条带；3.2定型结果判定O型O型试纸条结果为阳性，Asia I、A、C型试纸条结果为阴性或可疑；Asia I型Asia I型试纸条结果为阳性，O、A、C型试纸条结果为阴性或可疑。
A型A型试纸条结果为阳性，O、Asia I、C型试纸条结果为阴性或可疑。
C型C型试纸条结果为阳性，O、Asia I、A型试纸条结果为阴性或可疑。
阴性O、Asia I、A、C型试纸条结果均为阴性。
可疑O、Asia I、A、C型试纸条结果均为可疑，或其中三种、两种试纸条结果为可疑。
当四种、三种和两种试纸条对同一待检抗原显色结果均为阳性时，可将待检样品用稀释液做对倍稀释，再进行检测，以c.2进行结果判定；上述稀释液为含0.5-1‰吐温-20的PH7.5 0.11Mol/L磷酸盐缓冲液。
本发明采用的胶体金免疫层析技术(A gold immunochromatographic assayGICA)是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。它是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的实验现象(显色)。而游离标记物则越过检测带，与结合标记物自动分离。这种分析技术具有操作简单快速、不需仪器设备；结果判定直观、灵敏准确；无放射性同位素与苯二胺等有害物质参与，不会污染环境，安全性好；可单份测定，所需试剂和样本量少，成本低廉；保存与运输简单方便等优点。
因此，对国家重点防控的传染病原口蹄疫来说，利用GICA发展新的快速简便诊断技术，一方面可作为常规实验室诊断方法的有益补充，另一方面将为口蹄疫定型诊断基层工作人员提供极大的方便。
评价实验实例1.敏感性实验取国家口蹄疫参考实验室已确诊为口蹄疫O、A、C、Asia I血清型的阳性样本50份用定型试纸条检测。符合率为92％。
2.特异性实验用定型试纸条检测国家口蹄疫参考实验室已确诊为口蹄疫阴性的水泡皮、水泡液及正常乳鼠组织样本共计20份。检测符合率为100％。
3.重复性实验分别取不同生产批次041122、050310、050815试纸条对上述阳性与阴性样品进行重复检测，三次检测的符合率为100％。
4.稳定性实验将试纸条分别放在不同条件下贮存37℃一周、4℃一年，每隔1天和1月取出对相同阳性与阴性样品进行测试。测试时均有表明实验成功的质控带出现，同时对阳性样品的检测，质控带与检测带显色程度与显色时间无显著性差异，说明其稳定性较好。
5.田间样品的检测应用试纸条对送检的样品和分离培养物进行检测，包括细胞毒、鼠毒、水泡皮、水泡液、O/P液等共计107份样品分别与反向间接血凝进行平行对比实验。金标试纸与反向间接血凝法检出的符合率为93.61％，无显著性差异。
本发明的优点在于1、操作简便，判定直观容易，不需任何仪器和设备。一般人员按照说明书即可完成操作，勿需专门培训。、2、测试方法快捷迅速，整个测试过程仅需15分钟即可完成。
3、制做成本低廉，所需试剂和样本量少。
4、运输保存方便。由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试纸条质量稳定，不受温度等外界因素影响，可在室温中运输保存。
5、安全无污染更环保。没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境，具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性。
6、结果灵敏准确、特异性好，结果受外界因素影响较少。
由上述优点可以预见，在农村、野外、基层，对FMDV疫情跟踪和流行病学调查工作中，该发明将具备更大的应用前景。
图1为本发明试纸条结构示意2为胶体金颗粒透射电镜示意3为试纸条阳性结果示意4为试纸条阴性结果示意5为试纸条可疑结果示意6为检测带显色的试纸条无效结果示意7为检测带不显色的试纸条无效结果示意图具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。
实施例1O型口蹄疫诊断试纸条的制备1、胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制备的胶体金中加入0.02％的NaN3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。工作中所制备的胶体金直径通过在透射电镜(TEM像)观察颗粒大小。测得平均粒径为30.06±0.7nm，结果如图2所示。
2、免疫胶体金的制备用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶胶至所需pH为8.2，按45μg/mL胶体金加入O型口蹄疫豚鼠IgG，磁力搅拌15min。在胶体金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，继续搅拌15min，将上述胶体金经.3000r/min离心15分钟去除沉淀物，得上清液；将上清液经10000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于8/100初始胶体金体积的含10％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的PH7.50.11mol/LPBS金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型诊断试纸条的制备方法3.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分别将纯化的O型FMDV兔IgG调整至浓度为2.2mg/mL，兔抗豚鼠IgG浓度为1.0mg/mL。分别按1.8ul/cm设置喷膜，将两种IgG喷涂于300mm×20mm的NC膜上，形成检测带与质控带，两线相距8mm，置于含2.5％犊牛血清1‰Tween-20的PH7.2 0.02mol/LPBS包被液中浸泡5min。取出后37℃烘干1h，保存备用。
3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，用喷膜机按15μL/cm，将胶体金标记的O型FMDV豚鼠IgG，喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。
3.3试纸条的组装在PVC背衬板分别将吸取样品用的样品吸收垫、固定有胶体金标记O型口蹄疫抗体的胶体金垫，包被检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水滤纸制成的吸收垫按由下至上按图示1装配，吸水纸和金标垫必须与硝酸纤维素膜膜有交叠0.1cm，而金标垫与样品垫也应用交叠0.1cm。配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即制成O型FMDV诊断试纸条。
实施例2A型口蹄疫诊断试纸条的制备1、胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制备的胶体金中加入0.02％的NaN3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。工作中所制备的胶体金直径通过在透射电镜(TEM像)观察颗粒大小。测得平均粒径为30.06±0.7nm，结果如图2所示。
2、免疫胶体金的制备用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶胶至所需pH为8.0，按40μg/mL胶体金加入A型口蹄疫兔IgG，磁力搅拌10min。在胶体金溶液中按0.5％加入牛血清白蛋白，继续搅拌10min，将上述胶体金经2000r/min离心10分钟去除沉淀物，得上清液；将上清液经10000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于1/20初始胶体金体积的含5％蔗糖、0.5％BSA、0.5‰PEG20000、0.5‰Tween-20的PH7.40.11mol/LPBS金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型诊断试纸条的制备方法3.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分别将纯化的A型FMDV豚鼠IgG调整至浓度为1.4mg/mL，羊抗兔IgG浓度为1.0mg/mL。分别按2ul/cm设置喷膜，将两种IgG喷涂于300mm×20mm的NC膜上，形成检测带与质控带，两线相距8mm，置于含2.59％犊牛血清0.5‰Tween-20的PH7.4 0.02mol/L PBS包被液中浸泡5min。取出后37℃烘干1h，保存备用。
3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，用喷膜机按10μL/cm，将胶体金标记的A型FMDV兔IgG，喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。
3.3试纸条的组装在PVC背衬板分别将吸取样品用的样品吸收垫、固定有胶体金标记A型口蹄疫抗体的胶体金垫，包被检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水滤纸制成的吸收垫按由下至上按图示1装配，吸水纸和金标垫必须与硝酸纤维素膜膜有交叠0.1cm，而金标垫与样品垫也应用交叠0.1cm。配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即制成A型FMDV诊断试纸条。
实施例3C型口蹄疫诊断试纸条的制备1、胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制备的胶体金中加入0.02％的NaN3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。工作中所制备的胶体金直径通过在透射电镜(TEM像)观察颗粒大小。测得平均粒径为30.06±0.7nm，结果如图2所示。
2、免疫胶体金的制备用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶胶至所需pH为8.5，按100μg/mL胶体金加入C型口蹄疫病毒单克隆抗体，磁力搅拌20min。在胶体金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，继续搅拌20min，将上述胶体金经4000r/min离心20分钟去除沉淀物，得上清液；将上清液经12000r/min高速离心1h得到沉淀物，.将沉淀悬浮于1/10初始胶体金体积的含15％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的PH7.6 0.11mol/L PBS金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型诊断试纸条的制备方法3.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分别将纯化的C型FMDV豚鼠IgG调整至浓度为2.2mg/mL，兔抗鼠IgG浓度为2.0mg/mL。分别按1.8ul/cm设置喷膜，将两种IgG喷涂于300mm×20mm的NC膜上，形成检测带与质控带，两线相距8mm，置于含5％犊牛血清1‰Tween-20的PH7.6 0.02mol/LPBS包被液中浸泡15min。取出后37℃烘干1h，保存备用。
3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，用喷膜机按10μL/cm，将胶体金标记的C型口蹄疫病毒单克隆抗体，喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。
3.3试纸条的组装在PVC背衬板分别将吸取样品用的样品吸收垫、固定有胶体金标记C型口蹄疫抗体的胶体金垫，包被检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水滤纸制成的吸收垫按由下至上按图示1装配，吸水纸和金标垫必须与硝酸纤维素膜膜有交叠0.1cm，而金标垫与样品垫也应用交叠0.1cm。配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即制成C型FMDV诊断试纸条。
实施例4Asia I型口蹄疫诊断试纸条的制备1、胶体金的制备用柠檬酸三钠还原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制备的胶体金中加入0.02％的NaN3，经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。工作中所制备的胶体金直径通过在透射电镜(TEM像)观察颗粒大小。测得平均粒径为30.06±0.7nm，结果如图2所示。
2、免疫胶体金的制备用0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶胶至所需pH为8.4，按60μg/mL胶体金加入Asia I型FMDV兔IgG，磁力搅拌20min。在胶体金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，继续搅拌20min，将上述胶体金经3000r/min离心15分钟去除沉淀物，得上清液；将上清液经11000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于8/100初始胶体金体积的含10％蔗糖、1％BSA、0.5‰PEG20000、0.5‰Tween-20的PH7.5 0.11mol/LPBS金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型诊断试纸条的制备方法3.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH7.5 0.02mol/LPBS分别将纯化的Asia I型口蹄疫病毒单克隆抗体调整至浓度为1.8mg/mL，羊抗兔IgG浓度为1.5mg/mL。分别按2ul/cm设置喷膜，将两种IgG喷涂于300mm×20mm的NC膜上，形成检测带与质控带，两线相距8mm，置于含5％犊牛血清1‰Tween-20的PH7.5 0.02mol/L PBS包被液中浸泡15min。取出后37℃烘干1h，保存备用。
3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，用喷膜机按15μL/cm，将胶体金标记的Asia I型FMDV兔IgG，喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。
3.3试纸条的组装在PVC背衬板分别将吸取样品用的样品吸收垫、固定有胶体金标记Asia I型口蹄疫抗体的胶体金垫，包被检测带、质控带的硝酸纤维素膜以及吸水滤纸制成的吸收垫按由下至上按图示1装配，吸水纸和金标垫必须与硝酸纤维素膜膜有交叠0.1cm，而金标垫与样品垫也应用交叠0.1cm。配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即制成Asia I型FMDV诊断试纸条。
实施例5口蹄疫病毒定型诊断实验方法1.待检样品的处理无菌操作将待检水疱皮(采取新鲜末破裂、没有异味的水泡皮)用PH7.5 0.05mol/L PBS缓冲液洗2次，并用消毒滤纸吸去水份称重，加入玻璃砂研磨，按1∶10(w/v)PH7.5 0.05mol/LPBS缓冲液制成悬液，4℃冰箱内浸毒一夜。振摇后以4000r/min离心10min，取上清液即为待检样品。可直接作为待检样品。
2.样品检测待检样品、检测试纸或其它检测用材料等均在室温平衡。沿铝袋切口部位撕开，取出试纸条。将检测试纸有标志线的一端插入待检样品中，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，5分钟内观察结果。
3.结果判定3.1单支试纸条结果判定阳性质控带(6)与检测带(7)都出现清晰可见红色条带。样品中的口蹄疫病毒含量越高，检测带红色带颜色越深。见图示3阴性只有质控带(6)出现清晰可见红色条带。见图示4可疑质控带(6)出现一条颜色清晰可见的红色线，而在检测带(7)出现一条颜色很浅，若隐若显的红色带。见图示5无效质控带(6)不出现红色条带。见图示6、图示73.2定型结果判定O型O型试纸条结果为阳性，Asia I、A、C型试纸条结果为阴性或可疑。
Asia I型AsiaI型试纸条结果为阳性，O、A、C型试纸条结果为阴性或可疑。
A型A型试纸条结果为阳性，Asia I、O、C型试纸条结果为阴性或可疑。
C型C型试纸条结果为阳性，Asia I、O、A型试纸条结果为阴性或可疑。
阴性O、Asia I、A、C型试纸条结果均为阴性。
可疑O、Asia I、A、C型试纸条结果均为可疑，或其中三种、两种试纸条结果为可疑。
注当四种、三种和两种试纸条对同一待检抗原显色结果均为阳性时，可将待检样品用含0.5‰Tween-20的PH7.4 0.11MPBS做对倍稀释，再进行检测，以同上方法进行结果判定。
实施例6口蹄疫病毒定型诊断实验方法1、待检样品的处理无菌操作将乳鼠组织用PH7.2的0.05mol/L磷酸盐缓冲液洗3次，并用消毒滤纸吸去水份称重，加入玻璃砂研磨，按1∶3w/v加入PH7.2 0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，制成悬液；室温浸毒2小时。振摇后以4000r/min离心10min，取上清液即为待检样品；待检水疱液可直接作为待检样品；2、样品检测待检样品、检测试纸或其它检测用材料等均在室温平衡，将检测试纸有标志线的一端插入待检样品中，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，15分钟内观察结果；3、结果判定3.1单支试纸条结果判定阳性质控带(6)与检测带(7)都出现清晰可见红色条带；阴性只有质控带(6)出现清晰可见红色条带；可疑质控带(6)出现一条颜色清晰可见的红色条带，而在检测带(7)出现一条浅色带；无效质控带(6)没有出现红色条带；3.2定型结果判定O型O型试纸条结果为阳性，Asia I、A、C型试纸条结果为阴性或可疑；Asia I型Asia I型试纸条结果为阳性，O、A、C型试纸条结果为阴性或可疑。
A型A型试纸条结果为阳性，O、Asia I、C型试纸条结果为阴性或可疑。
C型C型试纸条结果为阳性，O、Asia I、A型试纸条结果为阴性或可疑。
阴性O、Asia I、A、C型试纸条结果均为阴性。
可疑O、Asia I、A、C型试纸条结果均为可疑，或其中三种、两种试纸条结果为可疑。
当四种、三种和两种试纸条对同一待检抗原显色结果均为阳性时，可将待检样品用稀释液做对倍稀释，再进行检测，以c.2进行结果判定；上述稀释液为含1‰吐温-20的PH7.6 0.11Mol/L磷酸盐缓冲液。
权利要求
1一种口蹄疫定型试纸条，由O、A、Asia I、C四种血清型检测试纸条组成，其特征在于所述检测试纸条由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫5部分组成，所述PVC衬板(1)设在最底部，衬板(1)上部中段设有硝酸纤维素膜(2)，硝酸纤维素膜(2)上部左端贴有吸收垫(3)，硝酸纤维素膜(2)上部右端设有金标垫(4)，金标垫(4)的上部右端设有样品垫(5)。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫定型试纸条，其特征在于所述的吸水纸(3)和金标垫(4)与硝酸纤维素膜(2)的衔接处有交叠，金标垫(4)与样品垫(5)之间也有交叠。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫定型试纸条，其特征在于所述的硝酸纤维素膜(2)上左端喷有抗兔、豚鼠和鼠IgG抗体作为质控带(6)；硝酸纤维素膜(2)上右端喷有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体作为检测带(7)；金标垫(4)上喷有胶体金标记的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体。
4.根据权利要求3所述的口蹄疫定型试纸条，其特征在于所述的金标垫(4)上喷有的胶体金标记口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体为兔或豚鼠口蹄疫病毒抗体或口蹄疫病毒单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的口蹄疫定型试纸条，其特征在于所述的检测带(7)喷有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗体为兔或豚鼠口蹄疫病毒抗体或口蹄疫病毒单克隆抗体。
6.一种制备如权利要求1所述口蹄疫定型试纸条的方法，其特征在于由以下步骤制备而成a、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；b、胶体金标记的O、A、C、Asia I型口蹄疫病毒抗体制备首先将a步制得的胶体金用0.1mol/L K2CO3调整PH值为8.0-8.5；然后用目测法确定胶体金与待标记抗体应标记的最佳量，得到最佳标记量为4-10mg/100mL，在胶体金溶液中按4-10mg/100mL加入口蹄疫病毒抗体，搅拌10～20min；在胶体金溶液中按0.5-1g/100ml加入牛血清白蛋白，继续搅拌10～20min，将上述胶体金经2000-4000r/min离心10-20分钟，去除沉淀物，得上清液；将上清液经10000～12000r/min高速离心1h得到沉淀物，将沉淀悬浮于1/20-1/10初始胶体金体积的金胶缓冲液中，悬浮溶解，置4℃保存；c、定型诊断试纸条组装c.1制备含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜用pH 7.2-7.6 0.02mol/L磷酸盐缓冲液分别将抗兔、豚鼠和鼠IgG抗体和O、A、C、Asia I口蹄疫抗体调整至1-2mg/ml和1.4-2.2mg/ml工作浓度，分别按1.8-2ul/cm设置喷膜，将上述两种抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控带与检测带，37℃烘干或室温晾干后，置于封闭液中浸泡5-15min，取出后室温下晾干，保存备用；c.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，按10-20μL/cm将胶体金标记的O、A、C、Asia I口蹄疫抗体分别喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用；c.3试纸条的组装在PVC背衬板(1)由下至上分别将样品垫(5)、胶体金垫(4)，包括检测带(7)、质控带(6)的硝酸纤维素膜(2)以及吸收垫(3)按顺序装配，剪切成条状，即制成不同型口蹄疫病毒诊断试纸条，口蹄疫O、A、C、Asia I型四种试纸条作为一个包装装入铝塑袋中即为口蹄疫定型诊断试纸条。
7.根据权利要求6所述的口蹄疫定型试纸条的制备方法，其特征在于所述的金胶缓冲液为含5-15％蔗糖、0.5-1％BSA、0.5-1‰PEG20000、0.5-1‰Tween-20的PH7.4-7.6 0.11mol/L的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6所述的口蹄疫定型试纸条的制备方法，其特征在于所述的封闭液为含2.5-5％犊牛血清，0.5-1‰Tween-20的PH7.4-7.6 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
9.一种使用如权利要求1所述的口蹄疫定型试纸条的方法，其特征在于按以下步骤使用a、待检样品的处理无菌操作将待检水疱皮或乳鼠组织用PH7.2-7.50.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液洗2-3次，并用消毒滤纸吸去水份称重，加入玻璃砂研磨，按1∶3～1∶10w/v加入PH7.2-7.5 0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，制成悬液；室温浸毒2小时或4℃冰箱内浸毒一夜.振摇后以4000r/min离心10min，取上清液即为待检样品；待检水疱液可直接作为待检样品；b、样品检测待检样品、检测试纸及其它检测用材料均在室温平衡，将检测试纸有标志线的一端插入待检样品中，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，5-15分钟内观察结果；c、结果判定c.1单支试纸条结果判定阳性质控带(6)与检测带(7)都出现清晰可见红色条带；阴性只有质控带(6)出现清晰可见红色条带；可疑质控带(6)出现一条颜色清晰可见的红色条带，而在检测带(7)出现一条浅色带；无效质控带(6)没有出现红色条带；c.2定型结果判定O型O型试纸条结果为阳性，Asia I、A、C型试纸条结果为阴性或可疑；Asia I型Asia I型试纸条结果为阳性，O、A、C型试纸条结果为阴性或可疑。A型A型试纸条结果为阳性，O、Asia I、C型试纸条结果为阴性或可疑。C型C型试纸条结果为阳性，O、Asia I、A型试纸条结果为阴性或可疑。阴性O、Asia I、A、C型试纸条结果均为阴性。可疑O、Asia I、A、C型试纸条结果均为可疑，或其中三种、两种试纸条结果为可疑。当四种、三种和两种试纸条对同一待检抗原显色结果均为阳性时，可将待检样品用稀释液做对倍稀释，再进行检测，以c.2进行结果判定。
10.根据权利要求9所述的口蹄疫定型试纸条的使用方法，其特征在于所述稀释液为含0.5-1‰吐温-20的PH7.4-7. 60.11Mol/L磷酸盐缓冲液。
全文摘要
一种口蹄疫病毒定型试纸条及其制备和使用方法，由O、A、Asia I、C四种血清型检测试纸条组成，试纸条由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫部分组成，所述PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上部左端贴有吸收垫，硝酸纤维素膜上部右端设有金标垫，金标垫的上部右端设有样品垫。本发明还提供这种定型试纸条的制备和使用方法。本发明可确定口蹄疫病毒O、A、Asia I、C型四种血清型，该试纸条操作快速简便，15min内即可显示结果，判定直观容易，结果敏感特异，费用低廉，运输保存方便，非常适用于基层人员在田间检测使用。
文档编号G01N33/544GK1877331SQ20061004314
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月7日 优先权日2006年7月7日
发明者蒋韬, 梁仲, 刘湘涛, 刘在新, 陈涓, 马军武 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所