专利名称：快速诊断家畜日本血吸虫病试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速诊断家畜日本血吸虫病免疫层析试纸条及其制备方法与对家畜(动物)体内抗日本血吸虫抗体的检测。
背景技术：
血吸虫病是一种严重危害人、畜健康的寄生虫病，其易感动物包括人、牛、羊等家畜及野生动物，涉及40多种哺乳动物。家畜感染血吸虫不仅给畜牧业生产造成重大损失，更为重要的是，患病家畜还是人体血吸虫病最主要的传染源，因此做好家畜血吸虫病的查治是控制和消灭血吸虫病的关键。目前家畜日本血吸虫病的诊断方法主要是粪检等病原学检测及IHA、ELISA、Dot-ELISA等免疫学检测方法，这些方法或费时费力、或需要仪器设备，不适合在现场广泛推广使用。在快速诊断人体血吸虫病方面，已有相关专利和文献报道，但这些技术大都以胶体标记抗人抗体或SPA为基础建立的，不能应用与家畜特别是牛血吸虫病的快速诊断。长期研究和实践证明，在应用已有免疫学诊断技术的基础上，发展一种新颖、快速、简便、适合于基层的能诊断多种动物血吸虫病的免疫学诊断方法，以适用于现场大规模筛查家畜日本血吸虫病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种操作简便、快速诊断家畜日本血吸虫病试纸条。
本发明提供了一种快速诊断家畜日本血吸虫病试纸条。
本发明的目的是这样实现的以胶体金标记日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)作为探针制备成金标垫，分别将SEA抗原及抗SEA抗体包被NC膜作为检测线及控制线研制出试纸条，通过免疫层析的方法检测样品中的抗SEA抗体。具体如下本发明所用材料如下日本血吸虫(中国大陆株)由本实验室通过钉螺和新西兰大白兔维持生活史循环。氯化金、柠檬酸三钠、碳酸钾、精密pH试纸为上海国药集团产品；BSA，Amresco公司分装产品；206佐剂为法国德比克公司Montanide ISA产品；高速低温台式离心机，Sigma公司生产；低温冻干机，FTC公司产品；ZX1000喷膜机、XYZ3200喷点机，Biodot产品；硝酸纤维素(NC)膜(型号AE98FAST)，德国Schleicher& Schuell公司产品；玻璃纤维纸、吸水纸、双面胶塑料底板基因公司产品。
日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的制备为利用盖玻片法子新西兰大白兔腹部感染2000～2500条日本血吸虫尾蚴，感染后40-50天取兔肝，收集纯化虫卵，液氮/水浴条件下反复冻融数次，加适量磷酸盐缓冲液(PBS)，经研磨、超声粉碎、低温离心，取上清，经去离子水透析去盐后按CBB-SDS法测定浓度，分装于-20℃保存备用。
抗SEA抗体的制备将SEA抗原溶液与206佐剂比混合，以每次1mg剂量腿部肌肉注射免疫新西兰白兔，免疫3次后，取血，用琼脂双向扩散法检测到抗体滴度，当滴度达到1∶32以上时，剖杀兔子，收集并分离血清。用硫酸铵盐析法纯化抗体，PBS反复透析至无SO42-，CBB-SDS法测定浓度后分装，-20℃保存备用。
胶体金探针的制备为采用柠檬酸钠还原法制备15-40nm的胶体金，冷却后用0.1-0.5M的碳酸钾调节胶体金pH至值7.0～8.0；并取1mL用Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]-HCl缓冲液稀释至60-100ug/mL的SEA在磁力搅拌下逐滴加入调好pH值的10mL胶体金溶液中，搅拌5-20min后加入稳定剂，继续搅拌5-20min，10000-15000rpm，4℃离心5-30min，弃上清，用稳定剂重悬沉淀，同上法重复洗离3次后重悬至2mL，加10％的NaN3(终浓度为0.2％)后于4℃保存。
金标垫制备的最佳条件为用均浆剂预处理玻璃纤维，干燥；将SEA-胶体金探针加于XYZ3200喷点机中以5-20uL/cm2喷于玻璃纤维上，低温冻干，于铝箔袋中密封，4℃～20℃保存备用。
硝酸纤维素反应膜的最佳制备条件为用Tris-HCl缓冲液将SEA、抗SEA抗体稀释至所需浓度，分别加于ZX1000喷膜机中以1uL/cm喷膜包被，20-40℃干燥5min，封闭液封闭30min后用Tris-HCl缓冲液漂洗3次，37烘干约30min，密封后于4℃～20℃保存备用。
检测试纸条的组装为将吸水纸、包被好的NC膜、金标垫、另一吸水玻璃纤维等按土图1-3所示从上到下依次固定在双面胶塑料底板上，用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4℃-20℃保存。
本发明家畜日本血吸虫病诊断试纸条，其检测程序为取20uL待测血清加在吸水玻璃纤维上(样品端)，立即插入装有缓冲液(pH7.4的0.01M Tris-HCl)的塑料酶标小杯中(注意不要将金标垫插入缓冲液中)，约10～15min后观察结果。
本发明其检测样本的判定标准为质控线和检测线均出现红色的为阳性，仅在质控线出现红色的为阴性，两条线均无红色的为试纸条失效(图4)。
本发明的效果是操作简便快速、不需要特殊仪器设备，不需专业培训即可操作，能较好满足广大基层疫区的需要，如疫病监测、化疗靶畜群的筛选等，具有广阔的市场前景和大范围推广应用的价值。
本发明具有下列优点(1)特异性强，敏感性高，安全性好，适用范围广泛。本发明试纸条以胶体金为标记物制备而成，没有联苯二铵等有害物质及放射性元素的参与，其安全性好；SEA为可溶性蛋白抗原，具有良好的抗原性，以胶体金标记SEA抗原，利用双抗原夹心的原理，能检测多种动物(包括人)抗血吸虫抗体，因此具有很高的特异性和敏感性，其应用范围十分广泛。
(2)操作简便快速。使用本发明试纸条诊断家畜日本血吸虫病时，无需另配其它试剂，样品无需特殊处理，按检测程序在10～15min内即可判诊断结果。
(3)结果判定形象、准确、可靠。本发明试纸条以显色有无为检测判断结果，即检测线出现红色的即为阳性，无色的即为阴性，结果判断形象，背景清晰，准确可靠，无人为操作误差。
(4)成本低，投资少。本发明试纸条可批量生产，单人单份检测，成本低廉，投资少，见效快。
图1是日本血吸虫病诊断试纸条侧面示意图，图中1为PVC底板，2为样品吸垫，3为金标垫，4为检测线(T线)，5为控制线(C线)，6为NC膜，7为吸收垫。样品吸收垫为玻璃纤维纸，吸收垫为吸水纸。
图2为试纸条功能区，包括样品端，结果显示区和标签端；图中1为PVC底板，2为金标垫，3为样品吸收垫，4为吸收垫，5为控制线(C线)，6为检测线(T线)，7为NC膜。
图3是试纸条检测结果判断，图中1为阳性结果，2为阴性结果，3为试纸条失效；图4是试纸条绵羊、水牛、小白鼠、新西兰白兔血清的检测结果，图中1、2为检测绵羊阳性及阴性血清结果，3、4为检测水牛阳性及阴性血清结果，5、6为检测小白鼠阳性及阴性血清结果，7、8为检测新西兰白兔阳性及阴性血清结果。
具体实施例一根据本发明的技术方案，具体制备如下(1)日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的制备用盖玻片法于新西兰大白兔腹部感染2000～2500条日本血吸虫尾蚴，于42天杀兔，取肝脏除去胆管、血管及结缔组织，用4℃预冷的1％NaCl溶液洗净血污，剪碎加600mL的PBS，匀浆器匀浆粉碎后，分别过40目、80目、120目、160目、200目分离筛，取筛下物再用260目尼龙筛集卵，沉渣用PBS稀释后，3500rpm5min反复离心，弃去上清和上层肝泥，直至沉淀呈金黄色，显微镜下观察至背景干净为止，再以12000rpm离心30秒，吸去上层水溶液，下层虫卵于液氮/自来水条件下反复冻融数次，加适量PBS，研磨，冰浴条件下超声处理6次，每次30see，间隔2min，4□40 000g离心1hr，取上清液，用去离子水透析2天，每天换3次水。透析去盐后的上清液即为纯净的SEA抗原，按CBB-SDS法测定其浓度，分装于-20℃保存备用。
(2)抗SEA抗体的制备用SEA抗原与206佐剂按重量比1∶1混合，以每次1mg抗原剂量，腿部肌肉注射免疫新西兰白兔，三免后耳静脉采血，双向琼脂扩散法测定抗体滴度，当抗体滴度达到1∶32以上时剖杀兔子采血，收集并分离血清，用硫酸铵盐析法纯化，在4□PBS中透析至无NH4+或是无SO42-为止，CBB-SDS法测定浓度后分装，-20℃保存备用。
(3)缓冲液、封闭液、稳定剂、均浆剂的配制0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 17.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，定容至1000ml，调pH至7.4)；0.01MTris-HCl缓冲液(1.414gTris溶于1000mL去离子水中，用HCl调pH至7.4)；封闭液(3g脱脂奶粉溶于100mL0.01M的Tris-HCl中)；稳定剂(1gBSA中血清白蛋白溶于100mLTris-HCl中)；均浆剂(3g蔗糖溶于100mLTris-HCl中)。
(4)胶体金探针的制备采用柠檬酸钠还原法制备40nm的胶体金。
取500uL1％的柠檬酸三钠加入煮沸的0.005％氯金酸中，待溶液煮至酒红色后继续煮5min制备得到40nm的胶体金，冷却后用0.2M的碳酸钾调节胶体金pH至7.0～7.5；在磁力搅拌下于调好pH值的10mL胶体金溶液中逐滴加入1mL用pH7.4的0.01MTris-HCl稀释至80ug/mL的SEA，搅拌10min后加入稳定剂1mL，继续搅拌10min，12000rpm，4℃离心20min，弃上清，稳定剂重悬沉淀，同上法离心，反复洗离3次后加稳定剂重悬至2mL，加10％的NaN3(终浓度为0.2％)后于4℃保存。
(5)金标垫制备将玻璃纤维用均浆剂浸泡片刻，37℃干燥30min；将SEA-胶体金探针加于XYZ3200喷点机中以10uL/cm2喷于玻璃纤维上，低温冻干，装入铝箔袋中密封，4℃～20℃保存备用。
(6)NC膜的包被选用孔径为5um，爬速为120～160sec/4cm的NC膜。用pH7.4的0.01M Tris-HCl溶液将SEA稀释至1.5mg/mL、抗SEA抗体稀释至3.2mg/mL，分别加于ZX1000喷膜机中以1uL/cm喷膜，37℃干燥5min，用含3％脱脂奶粉的封闭液封闭30min，并用0.01MTris-HCl洗脱液飘洗3次，37℃烘干30min，密封后装入含干燥剂的铝箔袋中密封，4～20℃保存备用。
(7)试纸条的组装将吸水纸、包被好的NC膜、金标垫、另一吸水玻璃纤维从上到下依次固定在双面胶塑料底板上，用裁剪刀或切条机切成25×50mm的试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封于4～20℃保存。
(8)试纸条检测操作程序取20uL待测血清加在试纸条样品端，立即将样品端插入装有缓冲液(0.01MTris-HCl缓冲液)的塑料酶标小杯中(注意不要将金标垫插入缓冲液中)，约10～15min后观察结果。
(9)结果判定标准在将纸条插入塑料酶标小杯中约10～15min后观察，若在质控线和检测线均出现红色的为阳性，检测线出现的红色较深的为强阳性，红色较浅的为弱阳性，仅在质控线出现红色的而检测线无红色的为阴性，两条线均无红色的为试纸条失效，需重新检测。
具体实施例二(1)用本发明制备的试纸条分别对绵羊、水牛、新西兰白兔、小白鼠的阳性和阴性血清各5份进行检测，结果阳性血清均在C线和T线均出现红色条带，阴性血清只在C线出现红色带(见图4)，表明利用双抗原夹心法制备的试纸条能检测多种动物日本血吸虫病。
(2)试纸条检测的敏感性和特异性实验用本发明试纸条分别检测107份人工攻击感染的阳性绵羊血清、80份健健康绵羊血清，结果其敏感性和特异性分别为91.6％及87.5％。
(3)交叉反应试验用本发明试纸条检测24份肝片吸虫病羊血清及18份锥虫病牛血清，结果与肝片吸虫的交叉反应率为12.5％、与锥虫无交叉反应。
(4)用试纸条检测现场感染水牛血清用试纸条检测20份粪检确诊的疫区放牧水牛阳性血清及15份阴性血清，结果其阳性血清的符合率为100％，检测15份阴性血清中有两例为阳性。
(5)重复性试验用不同批次制作的试纸条重复检测5次绵羊阴、阳性血清各5份，结果阳性、阴性符合率均为100％。
3.6检测效果与带虫量的关系用本发明试纸条分别检测带虫量为2、12、21、32、47、51、63、97、209、765条/头的水牛血清各一份进行检测，结果带虫量为2、12、21、32条/头的水牛血清显示为阴性，带虫量为47和51条的血清显示为弱阳性，带虫量为63以上的显示为强阳性。
权利要求
1.一种诊断家畜日本血吸虫病试纸条，其特征在于该试纸条是由抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原抗体和日本血吸虫可溶性虫卵抗原包被硝酸纤维膜作为质量控制线和检测线，用胶体金标记日本血吸虫可溶性虫卵抗原，利用双抗原夹心法制成。
2.一种如权利要求1所述诊断家畜日本血吸虫病试纸条的制备方法，该方法包括下列步骤(1)40nm胶体金溶液的制备采用柠檬酸钠还原法制备40nm的胶体金。(2)胶体金标记日本血吸虫可溶性虫卵抗原的缓冲液体系及标记过程待胶体金冷却后，用0.1-0.5M的碳酸钾调节pH至值7.0-～8.0；并取1mL用Tris-HCl缓冲液稀释至60-100ug/mL的日本血吸虫可溶性虫卵抗原在磁力搅拌下逐滴加入调好pH值的10mL胶体金溶液中，搅拌5-20min后加入稳定剂，继续搅拌5-20min，12000rpm，4℃离心5-30min，弃上清，用稳定剂重悬沉淀，同上法重复洗离3次后重悬至2mL，加10％的NaN3，终浓度为0.2％，后于4℃保存；(3)金标垫的制备将玻璃纤维用均浆剂浸泡片刻，20-40℃干燥30min；将日本血吸虫或溶性虫卵抗原-胶体金探针以5-20uL/cm2喷于玻璃纤维上，低温冻干；(4)NC膜的包被用pH7.0-7.5的0.01-0.1M Tris-HCl溶液稀释日本血吸虫或可性虫卵抗原、抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原抗体，分别以1uL/cm喷膜，20-40℃干燥，用含1-5％脱脂奶粉的封闭液封闭30min，用0.01-0.1M Tris-HCl洗脱液漂洗，20-40℃烘干30min，密封后装入含干燥剂的铝箔袋中密封，4～20℃保存备用；(5)试纸条的组装将吸水纸、包被好的硝酸纤维膜、金标垫、与吸水玻璃纤维从上到下依次固定在双面胶塑料底板上，用裁剪刀或切条机切成试纸条。
3.一种如权利要求1所述诊断家畜日本血吸虫病试纸条用于诊断家畜日本血吸虫病的检测方法，其特征在于该方法为，将待测血清加在试纸条样品端，立即将样品端插入装有缓冲液的塑料酶标小杯中，不要将金标垫插入缓冲液中，10～15min后观察结果质控线和检测线均出现红色的为阳性，仅在质控线出现红色的为阴性，两条线均无红色的为试纸条失效。
全文摘要
本发明公开了一种快速诊断家畜日本血吸虫病的试纸条。本发明的试纸条由抗SEA抗体和SEA包被硝酸纤维膜作为质量控制线和检测线，用胶体金标记SEA抗原，利用双抗原夹心法制成。本发明特异性强、灵敏度高，操作简便快速。制备成本低、适宜于规模型生产。
文档编号G01N33/532GK101038289SQ200610024699
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者林矫矫, 彭运潮, 柴春彦, 刘金明, 李 浩, 刘春艳, 傅志强, 石耀军, 陆珂, 胡述光 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 湖南生物机电职业技术学校, 农业部动物寄生虫学重点开放实验室