专利名称：噬菌体免疫pcr检测病原的方法
技术领域：
本发明涉及生物恐怖的检测，特别涉及病原的检测，更具体涉及一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法。
背景技术：
致病性病原微生物(包括致病菌、病毒)引发的各种传染性疾病大范围的流行传播，将严重危害中国的国家安全和人口健康。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。常规病原微生物的检测方法包括微生物分离培养鉴定、免疫学方法和基于病原核酸的分子检测方法等。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场、快速检测；免疫学方法因为基于抗体对病原的特异性识别作用而使该方法具有较好的特异性，但尚需在灵敏度和实用型等方面进行优化、改善；基于病原核酸的检测方法需要复杂的核酸抽提过程，PCR过程的信号扩增作用赋予该方法较高的检测灵敏度，但容易出现假阳性。本发明提出一种新的病原检测策略，称为噬菌体介导的免疫PCR。
免疫PCR(Immuno-PCR，IPCR)最早由Sano等提出，是一种非常有发展潜力的超灵敏免疫检测方法。其基本原理是在检测单克隆抗体上共价交联上DNA，使后者可以作为PCR扩增的模板进行信号放大，综合利用了抗原、抗体的特异性识别作用和PCR强大的信号扩增能力，使检测结果兼具较高的特异性和灵敏度。要发展针对各种病原的免疫PCR检测方法，首先需要获得可观的特异性识别病原的单克隆抗体。虽然杂交瘤细胞生产单克隆抗体技术已经相对成熟，但其生产过程耗时、耗力，要求熟练的技术人员操作，费用昂贵。同时，传统的免疫PCR过程需要复杂的抗体和DNA共价交联过程，化学交联剂的加入有时会不可避免地造成部分抗体特异性识别能力的丧失，影响检测结果。因此开展操作简单价格低廉的免疫PCR方法对于高灵敏的病原的检测和诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，该方法利用噬菌体介导的免疫PCR可以达到对病原进行简单、灵敏、准确的检测，且成本低廉，适用于病原感染的实验室诊断和血清流行病学调查。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案利用夹心ELISA的原理把病原抗原的单克隆抗体包被于酶标板上，经过封阻后，加入病人血清或是病原分离培养液，然后加入特异识别病原的噬菌体，经洗涤后，加入蒸馏水经热裂解使结合到酶标板上的噬菌体基因组DNA释放出来，然后把裂解液转移到PCR管中作为模板，设计特异性引物进行PCR扩增，然后经琼脂糖电泳根据特异性扩增带的有无来确定样品中是否有病原。再利用实时定量PCR仪，以结合到酶标板上的噬菌体的基因组DNA为模板进行实时定量PCR，在测定样品的同时，测定10倍稀释的不同浓度的病原抗原标准溶液，反应结束后用不同浓度测定的Ct值与对应的浓度做标准曲线，再把测定样品的Ct值代入标准曲线即可算出样品中的病原抗原量，达到对样品中的病原进行定量检测的目的。该方法能够广泛应用到对一些烈性病毒、微生物及有毒抗原的快速微量检测。同时由于操作快速简单，在对现在日益增多的新生传染性疾病的病原，如埃博拉病毒、禽流感病毒、SARS冠状病毒等等建立起快速检测提供了一个新的技术平台。
本发明与现有技术相比，具有下列优点1)首次把噬菌体作为免疫PCR的载体进行病毒检测，避免了传统的免疫PCR需要复杂的抗体和DNA共价交联过程，这种方法简单、灵敏而且噬菌体的获得非常简单，成本低廉，适合大规模推广应用。
2)特异性和灵敏度高，该方法结和免疫学检测的高特异性和PCR扩增的高灵敏性于一身。
3)可以定量检测，利用实时定量PCR根据标准曲线可以对样品进行定量分析，适用于病原感染的实验室珍断和血液流行病学调查。
图1为一种噬菌体免疫PCR和ELISA检测汉坦病毒核蛋白的灵敏度比较。
(a)噬菌体免疫PCR试验。结合到微孔板上的噬菌体通过热裂解释放基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。泳道1-7分别代表106到1pg/ml的汉坦病毒核蛋白对应的扩增产物，泳道8为无核蛋白的阴性对照。M泳道为DNA分子量标准(2000，1000，750，500，250和100bp)。
(b)噬菌体免疫PCR和ELISA的灵敏度比较。噬菌体PCR的扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后通过计算机辅助的影像分析系统定量。ELISA的颜色反应通过辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体二抗和TMB底物产生。
图2为噬菌体免疫PCR检测汉坦病毒核蛋白的实时定量PCR结果。
(a)实时定量PCR检测汉坦病毒核蛋白的定量曲线。曲线A-F代表10倍稀释的核蛋白(106pg/ml到10pg/m1)，G代表没有目的抗原的阴性对照。可以看出，加入的检测抗原的量越大，对应的Ct值越小，且在一定的范围内呈线性相关。
(b)实时定量PCR检测汉坦病毒核蛋白的标准曲线。在2000ng/ml到2ng/ml的范围内，四倍稀释目标病毒抗原，以产生的Ct值与对应的抗原浓度做图制作标准曲线，R2＝0.96，表明线性关系比较好。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明进一步阐述“噬菌体免疫PCR检测汉坦病毒”的具体实施方式
主要有三部分组成特异性噬菌体的制备，特异性噬菌体的捕获和PCR扩增检测，其步骤如下A、本发明所用的特异性识别病原的重组噬菌体(识别汉坦病毒核蛋白的噬菌体L13F3)的制备从噬菌体抗体库中筛选特异性识别病原的重组噬菌体[识别汉坦病毒核蛋白的重组噬菌体(展示有识别汉坦病毒核蛋白的单链抗体)，或是从分泌识别病原的单克隆抗体的杂交瘤细胞(识别汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞)中扩增抗体基因构建重组噬菌体)]，挑选鉴定为阳性的单克隆(含有命名为噬菌体L13F3的重组大肠杆菌TG1)活化于5mL 2YTAG*培养基(1000mL17g蛋白胨10g酵母膏5g氯化钠100ug/ml氨苄青霉素2％葡萄糖)，37℃200rpm培养过夜，然后取50uL过夜培养的菌液二次活化于5mL 2YTAG培养基，37℃200rpm培养2-3小时至对数生长期(OD600约为0.5)，加入辅助噬菌体M13K07 10uL(1011pfu/mL)拯救，继续37℃150rpm培养1个小时，1500g离心20分钟收集菌体，重悬于6mL 2YTAK*选择培养基(1000mL17g蛋白胨10g酵母膏5g氯化钠100ug/ml氨苄青霉素50ug/ml卡那霉素)中，30℃200rpm培养过夜。次日菌液1500g离心20分钟，上清即为所需的噬菌体。
B、特异性噬菌体的捕获1)特异识别病原的单克隆抗体(识别汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体)用1×PBS稀释，取100uL包被于酶标板(Costar公司)，4℃，时间为16-24小时；2)洗涤，1×PBS(磷酸缓冲液)洗3遍；3)封阻，每孔加入300uL含有5％脱脂奶粉的1×PBS，37℃封阻2小时；4)洗涤，1×PBS洗3遍；5)每孔加入100uL样品以及阴性对照和阳性对照，孵育，37℃放置1-2小时；6)洗涤，1×PBS洗5遍；7)加入重组的噬菌体上清，孵育，即加入100uL噬菌体L13F3上清(含有1％脱脂奶粉)，37℃放置2小时；8)洗涤，TBSET[TBS缓冲液(1升蒸馏水中加入8克NaCl，0.2克KCL和3克Tris碱，调pH值为7.2)包含5mM EDTA和0.1％Tween-20]洗8遍，双蒸水洗2遍；9)每孔加入100uL双蒸水，加热煮10分钟(温度控制在93-95℃)裂解结合的噬菌体，噬菌体的基因组DNA被释放出来作为PCR反应的模板。
C、PCR检测主要有定性检测和定量检测(实时定量PCR)两种1.定性检测以噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物，进行PCR扩增，每个样品做两个重复，同时设不含有模板的蒸馏水作为PCR扩增的阴性对照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像系统扫描；1)PCR体系噬菌体的裂解液(基因组DNA) 10uL上游引物L 13sense(5′-TTCAGTACCTATGCCATGTCT-3′)1uL下游引物L 13anti(5′-GTAGTCAAGGGGGTTACCTCG-3′) 1uL0.1％BSA5uLdNTP(2.5mM each)5uL10×PCR buffer 5uLDNA多聚酶 0.5uL双蒸水 22.5uL每个样品做两个重复，同时设不含有任何模板(噬菌体基因组DNA)的蒸馏水作为PCR扩增的阴性对照。
2)PCR反应条件94℃，10分钟94℃45秒，55℃45秒，72℃30秒，30个循环72℃10分钟。
3)琼脂糖凝胶电泳PCR产物点样于1.5％琼脂糖凝胶，100V，电泳30分钟，凝胶成像系统扫描，该方法比传统的ELISA方法(使用单链抗体)灵敏度高，可以检测10pg/ml的汉坦病毒核蛋白(图1)。
2.实时定量PCR进行定量检测利用噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物和TaqMan探阵在定量PCR仪上进行实时定量PCR，在测定样品的同时，测定10倍稀释的不同浓度的病原抗原标准溶液，反应结束后用不同标准浓度测定的Ct值对浓度做标准曲线，再把测定样品的Ct值代入标准曲线即可算出样品中的病原的量。
1)PCR体系噬菌体的裂解液(基因组DNA)10uL上游引物L13For(5′-TCTCACAGTCTCCTCAGCCAAA-3′) 2uL下游引物L13Rev(5′-TCTACGCGTGCTTCTGAAAATTC-3′) 2uL
TaqMan探针(5′-CGACACCCCCAAAGCTTGAAGAAGG-3′) 2uL0.1％BSA5uLdNTP(2.5mM each)5uL10×PCR buffer 5uLDNA多聚酶 0.8uLMgCl2(25mM)6uL双蒸水 12.2uL2)PCR条件94℃，10分钟94℃45秒，55℃70秒，50个循环72℃10分钟。
3)结果分析实时定量PCR在MJ Research公司的PCR仪(Opticon PCR machine)上进行。在测定样品的同时，测定10倍稀释的不同浓度的汉坦病毒核蛋白溶液，反应结束后系统软件Opticon Monitor会给出不同浓度的Ct值，用不同浓度测定的Ct值对浓度做标准曲线(图2)。以此标准曲线为基础，定量测定线性范围内的两个浓度400ng/ml和4ng/ml，定量结果分别为358.01ng/ml和3.85ng/ml，结果在误差允许范围(10％)以内。可见用实时定量噬菌体免疫PCR定量检测病毒抗原是比较准确的。
*2YTAG培养基配方17g蛋白胨，10g酵母膏，5g氯化钠，20g葡萄糖，加900ml去离子水，完全溶解后用氢氧化钠调节pH值至7.0，加去离子水至1L，在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。使用时提前加入0.1g的氨苄青霉素(过滤除菌)。
2YTAK培养基配方17g蛋白胨，10g酵母膏，5g氯化钠，加900ml去离子水，完全溶解后用氢氧化钠调节pH值至7.0，加去离子水至1L，在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。使用时提前加入0.1g氨苄青霉素(过滤除菌)，0.05g卡那霉素(过滤除菌)。
1×PBS(磷酸缓冲液)配方8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，加双蒸水至800mL，用氢氧化钠调pH值至7.4，加水定容至1L。
TBSETTBS缓冲液(1升蒸馏水中加入8克NaCl，0.2克KCL和3克Tris碱，调pH值为7.2)包含5mM EDTA和0.1％ Tween-20。
上游引物L13sense序列为5′-TTCAGTACCTATGCCATGTCT-3′。
下游引物L13anti序列为5′-GTAGTCAAGGGGGTTACCTCG-3′。
上游引物L13For序列为5′-TCTCACAGTCTCCTCAGCCAAA-3′。
下游引物L13Rev序列为5′-TCTACGCGTGCTTCTGAAAATTC-3′。
TaqMan探阵序列为5′-CGACACCCCCAAAGCTTGAAGAAGG-3′。
权利要求
1.一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，它包括下列步骤A、特异性识别病原的重组噬菌体制备从噬菌体抗体库中筛选特异识别病原的重组噬菌体/展示有识别病原抗原的单链抗体，或是从分泌识别病原的单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增抗体基因构建重组噬菌体，挑经鉴定阳性的单克隆培养过夜，然后二次活化至对数生长期，加入辅助噬菌体拯救，然后离心收集菌体，重悬于选择培养基中培养过夜，次日菌液离心，上清即为所需的噬菌体；B、特异性噬菌体的捕获，其步骤是1)特异识别病原的单克隆抗体包被于酶标板；2)洗涤；3)封阻；4)洗涤；5)每孔加入样品以及阴性对照和阳性对照，孵育；6)洗涤；7)加入重组噬菌体上清，孵育；8)洗涤；9)每孔加入双蒸水，加热裂解结合的噬菌体，噬菌体的基因组DNA被释放出来作为PCR反应的模板；C、PCR检测a.定性检测以噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物，进行PCR扩增，每个样品做两个重复，同时设不含有模板的蒸馏水作为PCR扩增的阴性对照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像系统扫描；b.实时定量PCR进行定量检测利用噬菌体的裂解液为模板，加入设计的上下游引物和TaqMan探针在定量PCR仪上进行实时定量PCR，在测定样品的同时，测定10倍稀释的不同浓度的病原抗原标准溶液，反应结束后用标准浓度测定的Ct值对浓度做标准曲线，再把测定样品的Ct值代入标准曲线即可算出样品中的病原的量。
2.根据权利要求1所述的一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，其特征是定性检测的上下游引物为上游引物L13sense序列为5′-TTCAGTACCTATGCCATGTCT-3′；下游引物L13anti序列为5′-GTAGTCAAGGGGGTTACCTCG-3′。
3.根据权利要求1所述的一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，其特征是定量检测的上下游引物和TaqMan探阵为上游引物L13For序列为5′-TCTCACAGTCTCCTCAGCCAAA-3′；下游引物L13Rev序列为5′-TCTACGCGTGCTTCTGAAAATTC-3′；TaqMan探针序列为5′-CGACACCCCCAAAGCTTGAAGAAGG-3′。
全文摘要
本发明公开了一种噬菌体免疫PCR检测病原的方法，其步骤是首先把特异识别病原的单克隆抗体包被于酶标板上捕获样品中的病原抗原，然后加入特异识别病原抗原的重组噬菌体，洗涤后结合到样品上的噬菌体作为模板进行PCR反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过进行实时定量PCR对样品中的病原进行定量。本方法检测病原简单灵敏且成本低廉，适用于病原感染的实验室诊断和血清流行病学调查。
文档编号G01N33/569GK1834655SQ200610018858
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者张先恩, 郭永超, 周亚凤, 张治平, 乔岩梅 申请人:中国科学院武汉病毒研究所