专利名称：用23s核糖体基因探针阵列检测水生动物病原菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌检验技术，具体地讲是运用核酸分子杂交反应检测致病细菌，特别是水生动物病原菌(包括杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、鮰鱼爱德华氏菌、杀鱼肠球菌、链球菌、嗜冷屈挠杆菌、柱状屈挠杆菌、多杀巴斯德氏菌、杀鱼巴斯德氏菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香组假单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、哈维弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23种细菌)的技术。
背景技术：
目前，水生动物病原微生物检测方法基本上依靠生化鉴定和培养鉴定。这些鉴定费时费力，并且又是在种水平的鉴定上结果并不可靠。随着分子生物学鉴定方法的发展，基于这些方法的细菌分类正在逐渐被修正。这一状况从侧面说明了建立分子生物学鉴定方法的必要性。相关研究在国际上已广泛开展，国内这方面研究也在逐渐兴起。
在水生动物病原微生物检测方面，国内基本上采用的是生化方法，鲜有芯片或微阵列应用的文献报道，国际上虽有水生动物致病微生物检验芯片的研究报道，但其检测的范围并不全面。从技术层面讲，目前细菌分子检测运用最多DNA靶点是16S rRNA基因。但在许多情况下，相近种之间在16S rRNA基因序列上的差异非常有限(同属的细菌16S rRNA基因序列差别基本上小于4％相似度)，并且有时候这些差别位点分布比较均匀。所以用16S rRNA基因上的差别位点设计相近种鉴别探针难度较大，而且鉴别效果往往不理想。23S rRNA可变区域多，分子量更大，与16S rRNA基因相比变异位点丰富而集中，但在种的水平上具有保守性。再加上一般细菌都有多个拷贝的rRNA操纵子，使得利用23S设计种特异性探针非常便利，并且大大提高了探针的特异性。
DNA微阵列在水生动物疫病检测方面有广泛的应用前景，能够大大提高检验的效率，节省人力，时间。真正能够做到一次检验给出可能感染的病原微生物的感染状况的全面信息，并且结果准确，操作简便快速。
发明内容
目前我国尚没有在水生动物疫病检测方面运用寡核苷酸微阵列检测病原菌的标准方法，依然沿用了增菌法、PCR方法、荧光PCR方法检测水生动物疫病病原菌。增菌法需要经过前增菌、分离培养、生化鉴定等经典的检验方法检测目标菌。试验时间长，处理样品量小，而且灵敏度和特异性都相对较低。而PCR方法、荧光PCR方法检测通量低，一次只能实现一种病原菌的检验。
针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种运用寡核苷酸微阵列检测病原菌技术检测水生动物疫病病原菌的方法(包括杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、鮰鱼爱德华氏菌、杀鱼肠球菌、链球菌、嗜冷屈挠杆菌、柱状屈挠杆菌、多杀巴斯德氏菌、杀鱼巴斯德氏菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香组假单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、哈维弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23种细菌)为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的首先用生物信息学方法设计特异性探针序列如下序列一(气单胞菌属通用探针AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(杀鲑气单胞菌探针Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水气单胞菌探针Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA
序列四(豚鼠气单胞菌探针Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌属通用探针CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(产气荚膜梭菌探针Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探针Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鮰鱼爱德华氏菌探针Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(杀鱼肠球菌探针Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(链球菌属通用探针Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈挠杆菌探针FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱状屈挠杆菌探针1Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱状屈挠杆菌探针2Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多杀巴斯德氏菌探针1Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多杀巴斯德氏菌探针2Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(杀鱼巴斯德氏菌探针Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(恶臭假单胞菌探针1Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(恶臭假单胞菌探针2Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(荧光假单胞菌探针1Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(荧光假单胞菌探针2Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香组假单胞菌探针Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍乱弧菌及拟态弧菌探针3Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈维弧菌探针1Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈维弧菌探针2Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈维弧菌探针3Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(创伤弧菌探针1Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(创伤弧菌探针2Vvulp21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探针V.parp21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探针1Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探针2Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探针Vflfup21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探针Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT其中D代表碱基A或G或T中的任意一个；W代表碱基A或T中的任意一个。然后PCR扩增待测样品中全部微生物的23S rRNA基因内的部分DNA片断，同时进行地高辛标记时所使用的PCR引物寡核苷酸序列如下
引物序列1(23S rRNA基因片段扩增前引物P23forward)GCGATTTCYG AAYGGGGRAACCC引物序列2(23S rRNA基因片段扩增后引物P23reverse)TTCGCCTTTCCCTCACGGTA CT其中Y代表碱基C或T中的任意一个；R代表碱基A或G中的任意一个。运用寡核苷酸微阵列检测多种水生动物病原菌的方法包括以下步骤1.设计特异性寡核苷酸探针，用于分子杂交-酶联免疫显色检测；2.PCR扩增待测样品中全部原核微生物的23S rRNA基因的部分DNA片断，同时进行地高辛标记；3.将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上，组成探针微阵列，微阵列的点制按图1中的顺序和位置，在长波紫外灯下进行交联5-10分钟；本专利申请书的所有附图中的点所对应的探针均和图1中所示一样为1阳性对照2阴性对照3气单胞菌属通用探针AFp1CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG4杀鲑气单胞菌探针Asal1TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG5嗜水气单胞菌探针Ahyr1TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA6豚鼠气单胞菌探针Acav1TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA7梭菌属通用探针CloFp CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA8产气荚膜梭菌探针Cper1AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA9肉毒梭菌探针Cbot1GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC10鮰鱼爱德华氏菌探针Eict1ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT11杀鱼肠球菌探针Eserp1ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA12链球菌属通用探针IIEser&Strp1TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC13嗜冷屈挠杆菌探针FleFpTAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG14柱状屈挠杆菌探针1Fclup1ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC15柱状屈挠杆菌探针2Fclup2ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC16多杀巴斯德氏菌探针1Pmulp1AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG17多杀巴斯德氏菌探针2Pmulp2GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC18杀鱼巴斯德氏菌探针PpispCTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC19恶臭假单胞菌探针1Pputp1GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT20恶臭假单胞菌探针2Pputp2CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG21荧光假单胞菌探针1Pflup1GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT22荧光假单胞菌探针2Pflup2CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG23丁香组假单胞菌探针Psyrp2ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA24霍乱弧菌及拟态弧菌探针1Vchmip11ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG25霍乱弧菌及拟态弧菌探针2Vchmip12GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT26霍乱弧菌及拟态弧菌探针3Vcmap13GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG
27哈维弧菌探针1Vharp11CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG28哈维弧菌探针2Vharp12GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA29哈维弧菌探针3Vharp21TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA30创伤弧菌探针1Vvulp11AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG31创伤弧菌探针2Vvulp21TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG32副溶血弧菌探针Vparp21TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC33河流弗氏弧菌探针1Vflfup11TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT34河流弗氏弧菌探针2Vflfup12TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG35溶藻弧菌探针Vflfup21AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG36溶藻弧菌探针Valgp21AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT4.杂交和杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10mol/L 2μL序列三十六(引物) 10μmol/L 2μLdNTPs 每种 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA样品 2μL双蒸水 33.1μL总体积 50μLPCR方法中扩增程序为1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重复25次9)72℃2min将浓度为1mmol/L的寡核苷酸探针溶液0.1μL点在带有正电荷的尼龙膜上，在长波紫外灯下进行交联5-10分钟。
其地高辛标记PCR产物与寡核苷酸探针杂交方法如下*预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋，加入预杂交液，封好口。预杂交30min，50℃。
*扩增PCR产物热变性DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛标记靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的芯片装入塑料袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10uL，再加入1mL杂交液，封好口。50℃，杂交1hr，温和搅动。
与现有技术相比，本发明的有益效果是该方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确的鉴定特异的目标细菌。首先，避免了反复培养，节约时间；而且DNA-DNA的杂交鉴定方法较生理生化的鉴定方法更为准确，不受培养条件和细菌生理状态的影响，这将填补使用DNA分子杂交的鉴定方法进行水生动物疫病病原菌检测的空白。
图1微阵列的探针位置示意图。
图2实施例1某批次活鱼的微阵列检测检出杀鲑气单胞菌的结果。
图3实施例2某批次活鱼的微阵列检测检出嗜水气单胞菌的结果。
图4实施例3某批次活鱼的微阵列检测检出豚鼠气单胞菌的结果。
图5实施例4某批次活鱼的微阵列检测检出产气荚膜梭菌的结果。
图6实施例5某批次活鱼的微阵列检测检出肉毒梭菌的结果。
图7实施例6某批次活鱼的微阵列检测检出鮰鱼爱德华氏菌的结果。
图8实施例7某批次活鱼的微阵列检测检出杀鱼肠球菌的结果。
图9实施例8某批次活鱼的微阵列检测检出乙型溶血型链球菌的结果。
图10实施例9某批次活鱼的微阵列检测检出嗜冷屈挠杆菌的结果。
图11实施例10某批次活鱼的微阵列检测检出柱状屈挠杆菌的结果。
图12实施例11某批次活鱼的微阵列检测检出多杀巴斯德氏菌的结果。
图13实施例12某批次活鱼的微阵列检测检出杀鱼巴斯德氏菌的结果。
图14实施例13某批次活鱼的微阵列检测检出恶臭假单胞菌的结果。
图15实施例14某批次活鱼的微阵列检测检出荧光假单胞菌的结果。
图16实施例15某批次活鱼的微阵列检测检出霍乱弧菌的结果。
图17实施例16某批次活鱼的微阵列检测检出拟态弧菌的结果。
图18实施例17某批次活鱼的微阵列检测检出哈维弧菌的结果。
图19实施例18某批次活鱼的微阵列检测检出创伤弧菌的结果。
图20实施例19某批次活鱼的微阵列检测检出副溶血弧菌的结果。
图21实施例20某批次活鱼的微阵列检测检出河流弧菌的结果。
图22实施例21某批次活鱼的微阵列检测检出弗氏弧菌的结果。
图23实施例22某批次活鱼的微阵列检测检出溶藻弧菌的结果。
具体实施例方式
实施例1样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出杀鲑气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提取样品鱼鳞片下表皮、肾组织、肝组织、心脏各一克，匀浆后混合振荡，取匀浆液1mL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，补加TE缓冲液500μl，振荡混匀。加同体积Tris饱和酚pH值8.0，强烈振荡，12000转/分钟，离心3分钟，吸取上清液，重复酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，于12000转/分钟离心5分钟。弃去上清，加70％冰乙醇振荡洗涤一次，室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清。加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR扩增23S基因片段成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10μmol/L 2μL引物2 10μmol/L 2μLdNTPs 每种 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA样品 2μL双蒸水3 3.1μL总体积 50μLPCR方法中扩增程序为1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重复25次9)72℃2min3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交*预杂交预杂交液先预热到杂交温度(50℃)，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入塑料袋，加入预杂交液，封好口。预杂交30min，50℃。
*扩增PCR产物热变性DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛标记靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的芯片装入塑料袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10uL，再加入1mL杂交液，封好口。50℃，杂交1hr，温和搅动。
4.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三(3气单胞菌属通用探针3AFp1)探针位点四(杀鲑气单胞菌探针4)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有杀鲑气单胞菌，见图2。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有杀鲑气单胞菌。这说明杀鲑气单胞菌寡核苷酸探针的阳性结果是有效的。
实施例2样本某批次出口活鱼。常规微生物培养和生化检测出嗜水气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三(气单胞菌属通用探针AFp1)、探针位点五(嗜水气单胞菌探针Ahyr1)均为深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有嗜水气单胞菌探针，见图3。
2天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有嗜水气单胞菌。这说明寡核苷酸探针位点三、探针位点五阳性结果是有效的。
实施例3样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出豚鼠气单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三(气单胞菌属通用探针AFp1)、探针位点六(豚鼠气单胞菌探针Acav1)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有豚鼠气单胞菌，见图4。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有豚鼠气单胞菌。这说明寡核苷酸探针位点三、探针位点六的阳性结果是有效的。
实施例4样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出产气荚膜梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点七(梭菌属通用探针CloFp)、探针位点八(产气荚膜梭菌探针Cper1)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有产气荚膜梭菌，见图5。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有产气荚膜梭菌。这说明寡核苷酸探针位点七、探针位点八的阳性结果是有效的。
实施例5样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出肉毒梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点七(梭菌属通用探针CloFp)、探针位点九(肉毒梭菌探针Cbot1)均深蓝色点即为阳性杂交结果，表明样品中含有肉毒梭菌，见图6。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有肉毒梭菌。这说明寡核苷酸探针位点七、探针位点九的阳性结果是有效的。
实施例6样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出鮰鱼爱德华氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十(鮰鱼爱德华氏菌探针Eict1)表明样品中含有肉毒梭菌，见图7。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有鮰鱼爱德华氏菌。这说明寡核苷酸探针位点十的阳性结果是有效的。
实施例7样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出杀鱼肠球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十一(杀鱼肠球菌探针Eserp1)表明样品中含有杀鱼肠球菌，见图8。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有杀鱼肠球菌。这说明寡核苷酸探针位点十一的阳性结果是有效的。
实施例8样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出乙型溶血型链球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十二(链球菌属通用探针IIEser&Strp1)表明样品中含有链球菌，见图9。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有链球菌。这说明寡核苷酸探针位点十二的阳性结果是有效的。
实施例9样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出嗜冷屈挠杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十三(嗜冷屈挠杆菌探针FleFp)表明样品中含有嗜冷屈挠杆菌，见图10。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含有嗜冷屈挠杆菌。这说明寡核苷酸探针位点十三的阳性结果是有效的。
实施例10样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出柱状屈挠杆菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十四(柱状屈挠杆菌探针1Fclup1)十五(柱状屈挠杆菌探针2Fclup2)表明样品中含有柱状屈挠杆菌，见图11。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含柱状屈挠杆菌菌。这说明寡核苷酸探针位点十四，十五的阳性结果是有效的。
实施例11样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出多杀巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十六(多杀巴斯德氏菌探针1Pmulp1)探针位点十七(多杀巴斯德氏菌探针2Pmulp2)表明样品中含有多杀巴斯德氏菌菌，见图12。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含多杀巴斯德氏菌。这说明寡核苷酸探针位点十四的阳性结果是有效的。
实施例12样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出杀鱼巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十八(杀鱼巴斯德氏菌探针Ppisp)表明样品中含有杀鱼巴斯德氏菌，见图13。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含杀鱼巴斯德氏菌。这说明寡核苷酸探针位点十八的阳性结果是有效的。
实施例13样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出恶臭假单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点十九(恶臭假单胞菌探针1Pputpl)探针位点二十(恶臭假单胞菌探针2Pputp2)表明样品中含有恶臭假单胞菌，见图14。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含恶臭假单胞菌。这说明寡核苷酸探针位点十九，二十的阳性结果是有效的。
实施例14样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出荧光假单胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例1
2.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十一(荧光假单胞菌探针1Pflup1)二十二(荧光假单胞菌探针2Pflup2)表明样品中含有荧光假单胞菌，见图15。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含荧光假单胞菌菌。这说明寡核苷酸探针位点二十一，二十二的阳性结果是有效的。
实施例15样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出霍乱弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十三(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1Vchmip11)探针位点二十四(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2Vchmip12)探针位点二十五(霍乱弧菌及拟态弧菌探针3Vchmip13)表明样品中含有霍乱弧菌，见图16。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含霍乱弧菌。这说明寡核苷酸探针位点二十三，二十四，二十五的阳性结果是有效的。
实施例16样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出拟态弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十三(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1Vchmip11)探针位点二十四(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2Vchmip12)探针位点二十五(霍乱弧菌及拟态弧菌探针3Vchmip13)表明样品中含有拟态弧菌，见图17。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含拟态弧菌。这说明寡核苷酸探针位点二十三，二十四，二十五的阳性结果是有效的。
实施例17样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出哈维弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例1
3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点二十七(哈维弧菌探针1Vharp11)探针位点二十八(哈维弧菌探针2Vharp12)探针位点二十九(哈维弧菌探针3Vharp13)表明样品中含有拟态弧菌，见图18。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含哈维弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，二十七，二十八，二十九的阳性结果是有效的。
实施例18样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出创伤弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十(创伤弧菌探针1Vvulp11)探针位点三十一(创伤弧菌探针2Vvulp 21)表明样品中含有创伤弧菌，见图19。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含创伤弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，三十，三十一的阳性结果是有效的。
实施例19样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出副溶血弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十二(副溶血弧菌探针Vparp 21)表明样品中含有副溶血弧菌，见图20。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中含副溶血弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，三十二的阳性结果是有效的。
实施例20样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出河流弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十三(河流弗氏弧菌探针1Vflfup11)探针位点三十四(河流弗氏弧菌探针2Vflfup12)表明样品中含有河流弧菌，见图21。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中河流弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，三十三，三十四的阳性结果是有效的。
实施例21样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出弗氏弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十三(河流弗氏弧菌探针1Vflfup11)探针位点三十四(河流弗氏弧菌探针2Vflfup12)表明样品中含有弗氏弧菌，见图22。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中弗氏弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，三十三，三十四的阳性结果是有效的。
实施例22样本某批次进口活鱼。常规微生物培养和生化检测出溶藻弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同实施例12.PCR扩增23S基因片段同实施例13.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交同实施例14.杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶联免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读判读杂交结果尼龙膜上探针位点三十五(溶藻弧菌探针Vflfup 21)探针位点三十六(溶藻弧菌探针Valgp21)表明样品中含有溶藻弧菌，见图23。
5天后，常规微生物培养经使用生化检测仪得出结论被测样品中溶藻弧菌。这说明寡核苷酸探针位点，三十五，三十六的阳性结果是有效的。
SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>用23S核糖体基因探针阵列检测水生动物病原菌的方法<130>20060716<160>36<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21
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<221>primer_bind<222>(1)..(22)<400>36ttcgcctttc cctcacggta ct 2权利要求
1.一种用23S核糖体基因探针阵列检测水生动物病原菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)设计特异性寡核苷酸探针，用于寡核苷酸微阵列检测检测，所设计的特异性寡核苷酸探针序列如下序列一(气单胞菌属通用探针AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(杀鲑气单胞菌探针Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水气单胞菌探针Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA序列四(豚鼠气单胞菌探针Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌属通用探针CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(产气荚膜梭菌探针Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探针Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鲴鱼爱德化氏菌探针Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(杀鱼肠球菌探针Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(链球菌属通用探针Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈挠杆菌探针FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱状屈挠杆菌探针1 Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱状屈挠杆菌探针2 Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多杀巴斯德氏菌探针1 Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(杀鱼巴斯德氏菌探针Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(恶臭假单胞菌探针1 Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(恶臭假单胞菌探针2 Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(荧光假单胞菌探针1 Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(荧光假单胞菌探针2 Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香组假单胞菌探针Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍乱弧菌及拟态弧菌探针3 Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈维弧菌探针1 Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈维弧菌探针2 Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈维弧菌探针3 Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(创伤弧菌探针1 Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(创伤弧菌探针2 Vvulp 21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探针V.parp 21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探针1 Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探针2 Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探针Vflfup 21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探针Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT(2)PCR扩增待测样品中全部原核微生物的23s rRNA基因内的DNA片段，同时进行地高辛标记；(3)将寡核苷酸微阵列和地高辛标记的PCR产物进行分子杂交；(4)杂交结果通过酶联免疫显色技术显色；(5)显色结果用肉眼观察，可发现进行杂交的特异性探针位点显色。
2.运用23S核糖体基因探针阵列检测多种水生动物病原菌的方法在检测水生动物病原菌方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用23S核糖体基因探针阵列检验多种能够导致水生动物传染病病原菌的方法，其技术原理为分子杂交——酶联免疫显色技术，属于细菌检测技术，其技术方案是用生物信息学方法设计特异性探针，包括设计筛选的34条用作探针的寡核苷酸序列以及与之配套的PCR和杂交反应条件。通过PCR扩增并用地高辛标记细菌23srRNA基因内部分序列，并用该PCR产物和一组特异性的寡核苷酸探针杂交，经酶联免疫显色显色后，可以从待测样品中，精确检测出是否存在水生动物传染病病原菌。该方法的优点是，省去了重复的细菌培养筛选环节，节约时间；分子杂交鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
文档编号G01N21/77GK1877328SQ20061001476
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月12日 优先权日2006年7月12日
发明者黄熙泰, 侯艳梅, 刘寅, 张立怀, 郑泽军, 高旗利, 周浩, 董志珍, 李永君, 王玉玲, 魏晓娜, 霍蕾 申请人:南开大学, 中华人民共和国天津出入境检验检疫局