专利名称：高效选出特异性地结合于配体的蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及选出对于特定配体特异性地结合的蛋白质的方法。
背景技术：
蛋白质、核酸或脂质等在生物体内发挥各种作用的生物体内因子，虽然很多是像酶等那样单独地发挥其功能，但已知有通过生物体内因子之间的相互作用、传达信息，来诱导或控制各种生物体内反应的情况。因此，正确地阐明生物体内因子之间的相互作用，在理解生物体内反应上是重要的，进而，认为通过积累关于这样的反应机理的知识，对于帮助特定疾病等的治疗方法或治疗剂等的开发是极其有用的。
作为研究生物体内因子之间的相互作用，特别是蛋白质(例如抗体、受体等)与其特异性配体(例如蛋白质、低分子化合物、脂质、糖链等)之间相互作用的一种方法，可以举出从噬菌体展示等多样化文库中选出特异性地结合于特定配体的蛋白质的方法等。在这些方法中，鉴定特异性地结合于特定配体的蛋白质时，大多通过ELISA(酶联免疫测定法)或RIA测定对配体的特异性及亲和性，来选出特异性地结合于目的配体的分子(非专利文献1、非专利文献2)。
非专利文献1Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci.，893576-3580，1992非专利文献2Cumbers等，Nat.Biotechnol.，201129-1134，2002发明内容确认存在下述问题很多多样化文库产生的蛋白质等生物体内因子，对目的配体以外的因子也显示出非特异性的结合性。由此，如果仅把对目的配体的结合性作为指标进行一次筛选，则有过半数为非特异性的结合性因子，表明要获得显示出所必需的特异结合性的因子是非常困难的。
本发明人等鉴于上述情况，对于从多样化文库中选出对目的配体显示出特异结合性的蛋白质的方法进行了精心研究，结果发现了可以容易且高效地鉴定特异性地结合于目的配体的蛋白质的方法。
本发明涉及从多样化文库中选出特异性地结合于目的配体的蛋白质的方法。
本发明人等在把对配体的亲和性作为指标进行蛋白质的筛选时，不仅测定对目的配体的亲和性，同时测定对对照配体的亲和性，通过比较，排除非特异性地结合于目的配体的蛋白质，从而实现容易且高效地鉴定所希望的蛋白质的方法。
即，本发明涉及以下的(1)～(11)。
(1)本发明第1种实施方式所述的发明为，从多样化文库中选择特异性地结合于目的配体的至少一种蛋白质的方法，其包括下述工序(a)使该文库中存在的各种蛋白质与目的配体接触，孵育该蛋白质群与目的配体的混合物，回收至少一种蛋白质与目的配体的复合体的工序；(b)使在工序(a)中选出的至少数种蛋白质与目的配体接触，孵育该蛋白质与目的配体的混合物，确认该蛋白质与目的配体的结合性的工序；(c)使在工序(a)中选出的至少数种蛋白质与1种或2种特定的对照配体接触，孵育该蛋白质与对照配体的混合物，判断该蛋白质与对照配体是否结合了的工序；以及(d)选择在工序(b)中确认了与目的配体的结合性、且在工序(c)中不与对照配体结合的蛋白质的工序。
(2)本发明第2种实施方式所述的发明为，根据上述(1)所述的方法，其特征在于，在所述工序(a)中使与所述目的配体接触的蛋白质呈现于宿主的表面上。
(3)本发明第3种实施方式所述的发明为，根据上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，所述目的配体和/或对照配体结合于载体上。
(4)本发明第4种实施方式所述的发明为，根据上述(3)所述的方法，其特征在于，所述载体是磁珠。
(5)本发明第5种实施方式所述的发明为，根据上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(b)中有无结合性的判定，是通过选自ELISA法、RIA法、表面等离子共振(SPR)法、印迹法、使用了配体珠的方法中的方法来实施的。
(6)本发明第6种实施方式所述的发明为，根据上述(5)所述的方法，其特征在于，所述目的配体和/或对照配体被标记了。
(7)本发明第7种实施方式所述的发明为，根据上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其特征在于，所述多样化文库是蛋白质表达文库。
(8)本发明第8种实施方式所述的发明为，根据上述(7)所述的方法，其特征在于，所述蛋白质表达文库是抗体表达文库。
(9)本发明第9种实施方式所述的发明为，根据上述(8)所述的方法，其特征在于，所述抗体表达文库是由将抗体呈现于细胞表面上的细胞构成的文库。
(10)本发明第10种实施方式所述的发明为，根据上述(9)所述的方法，其特征在于，所述细胞是DT40细胞。
(11)本发明第11种实施方式所述的发明为，用上述(1)～(10)中任一项所述的方法选出的蛋白质。
通过使用本发明所述的方法，可以迅速且高效地从多样化文库中选出特异性地结合于目的配体的蛋白质。
图1显示下述的结果从各种抗体分子分别呈现于细胞表面的鸡DT40细胞的多样化文库中，用链霉亲和素磁珠选择产生对链霉亲和素显示特异结合性的抗体的细胞，用细胞培养上清进行ELISA的结果。22号克隆(箭头)为SD-10。
图2显示下述的结果选出抗兔IgG抗体时，不用卵白蛋白，而使用卵白溶菌酶作为对象抗原来进行ELISA的结果。
图3显示下述的结果通过ELISA详细检测在图1中最终选出的抗体对各种配体(链霉亲和素、卵白蛋白、hIgG(人IgG)、脱脂奶)的特异性的结果。
具体实施例方式
1.多样化文库本发明中的“多样化文库”是指，可以呈现各种各样蛋白质的文库。只要是可以呈现各种各样蛋白质的文库，对于任何形式，都可以应用本发明所述的方法。虽没有限定，但可以利用例如可以表达多种蛋白质的噬菌体文库、可以在细胞表面呈现多种蛋白质的细胞文库等，特别是可以在细胞表面呈现多样化抗体分子的细胞文库等是适合的。在此，所述“细胞文库”可以利用由可以在细胞表面上呈现多种抗体分子的来自鸡的DT40细胞所构成的文库等(WO2004/011644)。
本发明中的“蛋白质”是除了来自天然的蛋白质以外，还包括其变异体、构成其一部分的多肽，还包括人工合成的肽等、2个以上氨基酸通过共价键(例如肽键)等键合而得的分子的概念。
本发明中的“蛋白质表达文库”被包含于上述“多样化文库”中，是表示可以表达各种各样蛋白质的宿主集团等的概念。在此的“宿主”包括本领域技术人员基于技术常识可以想到的全部物质，例如包括原核细胞、真核细胞、噬菌体或病毒等。另外，通过“宿主”表达的蛋白质可以表达于该“宿主”的细胞内，也可以表达于细胞表面上，或者也可以表达在适用于培养该“宿主”而使该蛋白质表达的培养基中。可以适用于本发明所述方法的“蛋白质表达文库”还可以购买市售品。
本发明中的“抗体表达文库”被包含于上述“蛋白质表达文库”中，是表示可以表达各种各样抗体分子的宿主集团等的概念。作为“宿主”，包括本领域技术人员基于技术常识可以想到的全部物质，例如包括原核细胞、真核细胞、噬菌体或病毒等，优选真核细胞、噬菌体，更优选动物细胞、噬菌体，特别优选DT40细胞及Ramos细胞。
2.目的配体及对照配体本发明中的“目的配体”及“对照配体”，只要是与蛋白质结合的物质，可以是任何形式，没有限定，例如蛋白质、核酸、脂质、糖质、低分子化合物等，包括本领域技术人员所能想到的全部物质。另外，本发明中的“对照配体”，只要是与蛋白质结合的物质，可以是任何形式，没有限定，例如蛋白质、核酸、脂质、糖质、低分子化合物等，包括本领域技术人员所能想到的全部物质，但从与“目的配体”的关系上讲，优选与“目的配体”氨基酸序列之间的氨基酸同源性低(约30％以下、更优选20％以下、进一步优选10％以下)，且该“对照配体”本身没有非特异性的结合活性。本发明中使用的“对照配体”可以是1种、也可以是多种，没有限定，例如可以是2种以下，优选1种，另外，从与“目的配体”的关系上讲，可以选择脱脂奶中含有的多种蛋白质、脂质、糖质等、卵白溶菌酶或卵白蛋白等。
另外，“目的配体”或“对照配体”可以被标记，该标记只要是在本领域中通常使用的方法及标记化合物，可以使用任意的方法及物质。虽没有限定，但可以优选使用荧光标记等。
3.选择结合于目的配体的蛋白质在本发明中，选择与目的配体结合的蛋白质可以基于本领域的常识来进行。例如，可以在适当的载体上结合目的配体，使经结合的目的配体与多样化文库中存在的蛋白质接触，在适当的条件下进行孵育，然后通过离心分离等回收所生成的载体-目的配体-蛋白质的复合体，选择与目的配体结合的蛋白质。在得到与目的配体结合的蛋白质的情况下，在表达该蛋白质的宿主不是单一克隆时，可以用临界稀释法及继代培养来得到单一克隆。如此得到的几种蛋白质是与目的配体以不同的亲和性结合的蛋白质。
在此使用的“载体”没有限定，可以使用Sepharose珠、琼脂糖珠、玻璃基质、磁珠等适当的物质，但特别优选磁珠。
作为进行目的配体与蛋白质的结合的条件，本领域技术人员可以根据目的配体来设定。没有特别的限定，例如，希望选择的蛋白质是抗体分子时，可以设定在约4℃～37℃左右的温度下、进行约15分钟～24小时左右孵育的条件等。
进而，对于与目的配体结合而得到的蛋白质来说，作为确认与目的配体结合的方法，可以用本领域所公知的方法进行，例如可以利用ELISA法、RIA法、表面等离子共振(SPR)法、印迹法、使用了配体珠的方法等。在此使用的目的配体可以使用被标记了的物质。或者，在可以获得特异性地结合于与目的配体特异性地结合的蛋白质的物质(例如抗体等的蛋白质、核酸、脂质等)等的情况下，可以使用经标记或未标记的该物质通过通常的方法来确认目的配体与该蛋白质的结合特异性。
4.判定与目的配体结合的蛋白质与对照配体的结合性将与目的配体的结合性作为指标来选择蛋白质，作为判定由此选出的蛋白质与对照配体的结合性的方法，可以用本领域公知的方法来进行。
例如可以利用ELISA法、RIA法、表面等离子共振(SPR)法、印迹法、使用了配体珠的方法等。在此使用的对照配体可以使用被标记了的物质。或者，在可以获得特异性地结合于与对照配体特异性地结合的蛋白质的物质(例如抗体等的蛋白质、核酸、脂质等)等的情况下，可以使用经标记或未标记的该物质通过通常的方法来确认对照配体与该蛋白质的结合特异性。
在此，判定是否是与目的配体结合而不与对照配体结合的蛋白质，根据使用的方法而不同，例如在用O.D.值(根据适于检测蛋白质与配体的结合的波长而测定的吸光度)等来表现结合强度时，显示与目的配体的结合性的O.D.值/显示与对照配体的结合性的O.D.值的值至少为2以上，将卵白蛋白作为对照配体时至少为1.0以上，将卵白溶菌酶作为对照配体时，至少为0.7以上，此时可以判定是与目的配体特异性地结合而与对照配体不具有结合性的蛋白质。
经上述工序得到的蛋白质，可以判断是对目的配体特异性地结合的蛋白质。
以下示出实施例，但本发明不限于此。
实施例在本实施例中，就下述方法进行说明在免疫球蛋白的基因位点上诱发体细胞重组，从产生各种免疫球蛋白分子的DT40细胞集团中，选出特异性地结合于链霉亲和素的抗体分子的方法。关于该DT40细胞集团的制备方法，参见WO2004/011644。
1.选出特异性地结合于链霉亲和素的抗体培养细胞DT40细胞用5％的CO2恒温槽在5％的CO2、39.5℃的条件下进行培养。培养基使用IMDM培养基(Invitrogen公司)，加入10％FBS、1％鸡血清、青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml、2-巯基乙醇55μM来使用。另外，Trichostatin A(和光纯药)以在甲醇中溶解5mg/ml的方式保存，用适当的培养基稀释到最终浓度为2.5ng/ml来使用。细胞浓度保持在105～106个/ml来继续培养。
链霉亲和素磁珠的制作磁珠使用Dynabeads M-280 Tosylactivated(Dynal公司)，另外磁台使用Dynal MPC(Dynal公司)。将珠200μl用500μl的缓冲液A(0.1M磷酸钠、pH7.4)洗3次后，在400μl的缓冲液A中在37℃下通过旋转搅拌使其与240μg的链霉亲和素(NACALAI TESQUE公司)反应24小时。接着，用500μl的缓冲液C(10mM磷酸钠，pH7.4，150mM NaCl，0.1％ BSA)洗涤珠2次。然后添500μl的缓冲液D(0.2M Tris-HCl，pH8.5，0.1％ BSA)，在37℃下通过旋转搅拌使其反应4小时，进行阻滞。然后用500μl的缓冲液C洗涤2次，然后悬浊于400μl含有0.02％叠氮化钠的缓冲液C中。
兔IgG磁珠的制作磁珠使用Dynabeads M-280 Tosylactivated(Dynal公司)，另外磁台使用Dynal MPC(Dynal公司)。将珠200μl用500μl的缓冲液A(0.1M磷酸钠、pH7.4)洗3次后，在200μl的缓冲液A中在37℃下通过旋转搅拌使其与120μg的兔IgG(SIGMA公司)反应过夜。接着，用200μl缓冲液C(10mM磷酸钠，pH7.4，150mM NaCl，0.1％ BSA)洗涤珠2次。然后添加200μl的缓冲液D(0.2M Tris-HCl，pH8.5，0.1％ BSA)，在37℃下通过旋转搅拌使其反应4小时，进行阻滞。然后用500μl的缓冲液C洗涤2次，然后悬浊于200μl含有0.02％叠氮化钠的缓冲液C中。
通过链霉亲和素磁珠及兔IgG磁珠进行的选择用10ml洗涤缓冲液(含1％ BSA的PBS)洗涤经2.5ng/ml的Trichostatin A处理7周后的约5×107个野生型DT40细胞1次，进而用1ml洗涤1次，然后在1ml的洗涤缓冲液中与5×106个链霉素磁珠(用兔IgG磁珠进行选择时为兔IgG磁珠)混合，在4℃下使其稳定地旋转，同时进行孵育30分钟。然后用1ml的洗涤缓冲液洗涤5次。最后，将结合于磁珠的细胞悬浊成500μl，将其加入到30ml的培养基中，然后每孔300μl地分注到96孔板上，在39.5℃下进行培养。1周后，用培养上清进行ELISA。
用2片板进行的ELISA准备2片96孔免疫板·MaxiSorp(NaigeNunc公司)，分别加入5μg/ml的链霉亲和素(NACALAI TESQUE)和卵白蛋白(Sigma公司)(都溶解于PBS中)200μl，在室温下放置一夜后固定于板上(用兔IgG磁珠进行选择时，使用兔IgG(SIGMA公司)和卵白溶菌酶(SIGMA公司))。然后用0.5％脱脂奶200μl在室温下阻滞1小时，用ELISA洗涤缓冲液(加有0.05％ Tween20的PBS)200μl洗涤3次。向其中加入细胞培养上清100μl，在室温下使其反应1小时。在此，将同样的培养上清分注于链霉亲和素固定板和卵白蛋白固定板的两者(用兔IgG磁珠选择时为兔IgG固定板和卵白溶菌酶固定板)中各100μl。然后用ELISA洗涤缓冲液200μl洗涤5次，用PBS将辣根过氧化物酶共轭山羊抗鸡IgM抗体(Bethyl公司)稀释到2000倍，每个加入100μl。在室温下反应45分钟后，用ELISA洗涤缓冲液洗涤5次，然后加入100μl的TMB+(Dako公司)，在室温下使其反应4分钟后，用1N硫酸100μl使反应停止。定量是用mQuant Biomolecular Spectrometer(Bio-Tek Instruments公司)测定450nm处的吸光来进行的。
ELISA的结果示于表1和图1中。表1是用O.D.值表示与链霉亲和素反应的抗体(全部为28个克隆)的ELISA结果，并且用O.D.值表示关于与相同克隆的卵白蛋白的反应性的ELISA结果。另外，将表1图表化，得到图1。
已明确在与链霉亲和素反应的全部28个克隆中，其多数也与卵白蛋白反应。这些克隆之一(克隆22命名为克隆SD-10)显示仅与链霉亲和素特异性地反应(表1中，克隆22，参见图1中用箭头显示的图)。实验证明，由于对链霉亲和素显示出高亲和性的克隆也都对卵白蛋白发生强反应，所以如果仅把对链霉亲和素的亲和性作为指标进行筛选，则选出对任何配体都非特异性地结合的抗体的概率非常高。另一方面，确认了通过使用本发明的方法，可以从一开始就高效地排除这样的非特异性的抗体。实际上，如果单独用链霉亲和素进行检测，则28个克隆会作为候补而被选出，但其大部分也对卵白蛋白很强地结合。通过排除这样的克隆，可以马上限定于1个克隆。虽在本实验中，将目的配体设为链霉亲和素、将对照配体设为卵白蛋白，但确认了在与其他特定蛋白质的组合(例如目的配体∶对照配体＝兔IgG∶脱脂奶、卵白溶菌酶∶脱脂奶)中该方法也有效。实际使用卵白溶菌酶的结果示于图2中。可以确认96孔板的53个孔中存在细胞。其中，对兔IgG的O.D.值为1以上的反应物质有6个克隆(克隆3、13、31、35、38、47)。通过同时检测与溶菌酶的反应性，可以马上判明这6个克隆是否对兔IgG为特异性。
2.特异性的确认制作用于验证链霉亲和素特异性的ELISA用培养上清用于通过ELISA分析进一步特异性的培养上清，为了去除来自血清的IgM等，使用如下调制的培养基。从鸡血清(Invitrogen公司)中用50％饱和硫酸铵沉淀除去免疫球蛋白，用PBS透析上清。用CentriPrep(Amicon公司)的浓缩来修正因透析产生的体积增加，制作除去抗体的鸡血清。将其以6％的浓度加入到AIM-V无血清培养基(Invitrogen公司)中。向其中以约106/ml浓度加入细胞，培养2天，取培养上清进行ELISA。
用于验证链霉亲和素特异性的ELISA在96孔免疫板·MaxiSorp中加入5μg/ml的链霉亲和素、卵白蛋白、人IgG(Sigma公司)和0.5％脱脂奶(Difco公司)(都溶解于PBS中)200μl，室温下放置一夜后固定于板上。然后用0.5％脱脂奶200μl在室温下进行阻滞1小时，用200μl的ELISA洗涤缓冲液洗涤3次。向其中加入将细胞培养上清从1倍到3125倍分6个阶段各5倍地稀释而得的物质100μl，在室温下使其反应1小时。在此使用的克隆是将刚才的SD10进行一次临界稀释而得到的克隆SD10-1。随后用ELISA洗涤缓冲液200μl洗涤5次，用PBS将辣根过氧化物酶共轭山羊抗鸡IgM抗体稀释到2000倍，每个加入100μl。在室温下反应45分钟后，用ELISA洗涤缓冲液洗涤5次，然后加入100μl的TMB+，在室温下使其反应4分钟后，用1N硫酸100μl使反应停止。定量是用mQuant Biomolecular Spectrometer测定450nm处的吸光来进行的。
用于验证特异性的ELISA结果示于图2中。确认了将图1所示的SD-10进行临界稀释得到的SD-10-1仅与作为最初目的的链霉亲和素发生强反应。不应用本发明时，必须对28个克隆进行同样的检测，因此判明了至少有28倍的成本削减效果。
权利要求
1.一种方法，其是从多样化文库中选择特异性地结合于目的配体的至少一种蛋白质的方法，其包括下述工序(a)使该文库中存在的各种蛋白质与目的配体接触，孵育该蛋白质群与目的配体的混合物，回收至少一种蛋白质与目的配体的复合体的工序；(b)使在工序(a)中选出的至少数种蛋白质与目的配体接触，孵育该蛋白质与目的配体的混合物，确认该蛋白质与目的配体的结合性的工序；(c)使在工序(a)中选出的至少数种蛋白质与1种或2种特定的对照配体接触，孵育该蛋白质与对照配体的混合物，判断该蛋白质与对照配体是否结合了的工序；以及(d)选择在工序(b)中确认了与目的配体的结合性、且在工序(c)中不与对照配体结合的蛋白质的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述工序(a)中使与所述目的配体接触的蛋白质呈现于宿主的表面上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目的配体和/或对照配体结合于载体上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体是磁珠。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述工序(b)中有无结合性的判定，是通过选自ELISA法、RIA法、表面等离子共振(SPR)法、印迹法、使用了配体珠的方法中的方法来实施的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的配体和/或对照配体被标记了。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述多样化文库是蛋白质表达文库。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质表达文库是抗体表达文库。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体表达文库是由将抗体呈现于细胞表面上的细胞构成的文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞是DT40细胞。
11.一种蛋白质，其是用权利要求1～10中任一项所述的方法选出的。
全文摘要
本发明涉及选出对于特定配体特异性地结合的蛋白质的方法。该方法是从多样化文库中选择特异性地结合于目的配体的蛋白质的方法，其包括下述工序使该文库中存在的蛋白质与目的配体接触，选择结合于目的配体的蛋白质的工序；使得到的蛋白质与对照配体接触，判定该蛋白质与对照配体有无结合性的工序；以及，选择判定与对照配体没有结合性的该蛋白质的工序。
文档编号G01N33/543GK101052728SQ20058003755
公开日2007年10月10日 申请日期2005年11月7日 优先权日2004年11月8日
发明者太田邦史, 濑尾秀宗, 柴田武彦 申请人:独立行政法人理化学研究所