低聚原花青素(opc)的分析方法

专利名称：低聚原花青素(opc)的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测定分析物或待分析样品中含有的低聚原花青素(黄烷-3-醇的n-聚体混合物的总称，n≥2)的方法，所述的分析物或待分析样品例如是天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品等。
背景技术：
原花青素(OPC)据称是“法兰西悖论”的有效成分之一，因为在酒中也含有该物质(1995，Clin.Chim.Acta.235，207-219)。原花青素已知的医学效果有抗氧化活性、末梢循环改善活性、血液流动改善作用、肝功能改善作用(2004，Japan Food Science，403，一月刊，40-45)以及血小板凝集抑制作用(官方出版的专利公报2003-527418)。因此，需要开发方便的定性和定量测定OPC这种活性成分的方法。
分析原花青素的已知方法包括高效液相色谱-质谱法(LC-MS)的反相HPLC法(2003，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67，(5)，1140-1142)和LC-MS的梯度洗脱的正相HPLC(2003，J.Agric.Food Chem.，51，7513-7521)。然而，这两种方法都需要质谱检测器，没有一种方法被认为是方便的。此外，由于原花青素的组分黄烷-3-醇类的立体异构化，原花青素以许多立体异构体形式存在。可用作标准物质的化合物存在局限性。因此，除了一些已知化合物，不可能对原花青素进行定量分析。此外，自然界中的原花青素以从单体的黄烷-3-醇到二聚体、三聚体、进一步到更高聚合度的n-聚体形式存在。反相HPLC分析显示黄烷-3-醇(单体)、其二聚体以及三聚体的峰重叠。
如上所述，没有定性和定量测定OPC的简便方法。

发明内容
在这种情况下，本发明者着重于开发一种新的分析方法，该方法可测定天然物质、食品、饮料和药品中所含的n-聚体的含量以及丰度，而不受来自于黄烷-3-醇单体的干扰。因此，本发明的目的是提供一种用于测定分析物如天然物质、食品和饮料中含有的OPC的新方法。


图1显示儿茶素、黄烷-3-醇二聚体和三聚体的正相HPLC分析结果。
图2显示混合了儿茶素和原花青素的分析物的正相HPLC分析结果。
发明效果本发明者进行了各种研究试图解决前述问题。结果从实验和分子量的角度阐明了(a)水解低聚原花青素(OPC)产生的花青素量总是n/2，而与OPC中含有的黄烷-3-醇的聚合度n的大小无关。该结论使得他们研究出OPC测定的简便方法。本发明者进一步发现了意想不到的事实(b)使用正相柱高效液相色谱法可容易地实现迄今为止使用色谱法很难分离的不同聚合度n的黄烷-3-醇聚合物的分离。
本发明的方法利用上述事实(a)和/或事实(b)以简便的方式分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中的低聚原花青素(OPC)的量，以及分析OPC中n-聚体的比例和/或含量。
根据本发明的方法，可以分析低聚原花青素(OPC)而不受低聚原花青素中经常含有的黄烷-3-醇单体的干扰。
此外，本发明的方法可以测定分析物中低聚原花青素的各种聚合物的黄烷-3-醇聚合物而不需要质谱仪。因此，本发明的方法非常适宜分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中的低聚原花青素。
最佳实施方式本发明的方法适用的分析物是可能含有黄烷-3-醇的n-聚体(n≥2)的混合物(下文称为低聚原花青素或OPC)的任意样品，如天然物质(葡萄籽、罗望子果、苹果、树皮、松树皮衍生的多酚、茶叶、可可等，和/或它们的处理产品(提取物等))、食品和饮料、医药品和/或化妆品。
低聚原花青素通常包括至少一种如下通式表示的化合物 结构式1 结构式2 结构式3 结构式4 n＝0-18的整数，n1＝1-18的整数，n2＝0-18的整数，以及R＝H或OH。
本发明尤其适用于包括至少一种下述原花青素类的上述低聚原花青素结构式1的原花青素B1、B2、B3和B4，其中n＝0；结构式2的原花青素B5、B6、B7和B8，其中n1＝0和n2＝0；以及结构式1的原花青素C1、C2和C4，其中n＝1。上述B1、B2......、C1、C2......是各个化合物的立体异构体。主要的原花青素、OPC和儿茶素的结构如下所示。儿茶素 PB7(儿茶素-4α，6-儿茶素) PB1(表儿茶素-4β，8-儿茶素)PB2(表儿茶素-4β，8-表儿茶素) PB3(儿茶素-4α，8-儿茶素) PB5(表儿茶素-4β，6-表儿茶素)
(1)OPC总量的测定根据本发明，无需考虑分析物中低聚原花青素(OPC)含有的黄烷-3-醇聚合物的类型和聚合度，当测定水解OPC产生的花青素时，从测得值可以测定OPC的总量。本发明的方法可以按照下列顺序进行OPC的水解可以在酸性条件下通过热分解进行低聚原花青素的水解。优选的条件包括例如使用酸/低级醇混合物作为酸性条件，所述酸优选是盐酸、硫酸或硝酸，所述低级醇优选是丙醇、丁醇、戊醇和/或异戊醇。热分解可以在温度50-100℃，优选80-100℃，更优选85-95℃下进行，反应时间为30分钟或更长，优选1小时或更长。所述酸的浓度选自0.1-2N，更优选0.4-1N。
进行水解时，如果分析物是含有低浓度的低聚原花青素的液体样品，那么可使用适当的方法浓缩样品，例如冻干或在减压条件下固化至干燥。
将所述分析物(包括其浓缩物)溶解于上述酸/低级醇混合物中，其浓度为0.01-1％，优选0.05-0.2％(O.5-2mg/ml)，由此进行水解。
水解的具体例子如下在玻璃试管中，将含有原花青素的样品(0.5mg)溶解于1ml 0.6N的HCl/丁醇中，所得溶液在90℃的水浴中静置2小时。反应完成后，使用UV-265(Shimadzu Corp.)量700-400nm的吸收光谱。测量551nm处的吸光度证实水解反应是否进行完全而产生花青素。
花青素量的测量可通过任意公知方法测量水解产生的花青素量，例如，可容易地通过高效液相色谱法或吸光度法完成。吸光度法可以使用未处理的水解产物，并优选测量550-552nm的吸光度，在此波长处，花青素在可见吸收光谱图中显示最大吸收。在此波长处，低聚原花青素水解产生的花青素以外的组分(例如，儿茶素最大吸收波长270nm)的影响可以忽略。
HPLC方法的例子具体描述如下使用HPLC柱YMC-ODS-A312(6mm×150mm，YMC)，乙酸∶甲醇∶水＝15∶17.5∶67.5的混合物1ml/min，柱温40℃，检测A520nm的面积值以测定花青素。氯化氰定、氯化翠雀定和氯化天竺葵色素(均获自Funakoshi)可用作标准物质。这些标准物质的保留时间各不相同，其混合物或选自其中的任意一种可用作标准物质。对于HPLC柱，不仅上述C18基树脂，而且C8-、C30-或聚合物基C18树脂都可以进行相似的分析，只要其是反相树脂。
OPC总量的计算基于上述测定的花青素量，测定分析物中低聚原花青素的量，使用如下方法a)通过水解一个n-聚体产生的花青素量为n/2，而与OPC中含有的黄烷-3-醇聚合物的聚合度n的大小无关。基于这一事实，水解产生的花青素量乘以系数2，可以得到预定量的分析物中例如以mg计的OPC总量。或者，(b)水解OPC产生的花青素量与OPC的总量成比例，而与OPC中含有的黄烷-3-醇聚合物的聚合度n的大小无关。基于这一事实，将水解产生的花青素量与水解已知量的OPC标准物质产生的花青素量相比较，可通过校正曲线或下述公式测定分析物中OPC的总量(例如，以mg计)和/或分析物中OPC的比例(a％)OPC总量(mg)＝(样品的测量值/标准物质的测量值)×标准物质的量(mg)(公式1)分析物中OPC的比例(a％)＝(OPC总量(mg)/分析物的量)×100 (公式2)使用的适宜标准物质可选自原花青素B1和原花青素B2(两者均获自Funakoshi)。
(2)组成OPC的每种n-聚体的分析在本发明特别优选的实施方案中，除了在上述(1)中测定预定重量的分析物中的OPC总重量之外，或者独立于上述测定，可使用高效液相色谱法(HPLC)测定出OPC中各种黄烷-3-醇聚合物的比例。通过如此做法，本发明还提供了一种新的OPC测定方法，该方法测定了预定重量的分析物中含有的、具有不同聚合度n的各种聚合物的重量。
高效液相色谱法中使用的柱优选是正相柱，特别优选填装有硅胶基树脂的正相柱。本发明者的研究表明，具有不同聚合度(在此情况下，也包括n＝1)的原花青素可以通过色谱法在正相柱上十分满意地分离为各个组分。从黄烷-3-醇类具有高极性的事实判断，到目前为止，人们仍然认为正相柱不能分离黄烷-3-醇类。此外，本发明的方法能使用紫外检测器进行测量，而不需要质谱检测器。
高效液相色谱法的条件可以根据需要确定。具体而言，例如使用色谱柱Inertsil SIL(4.6mm×150mm，GL Sciences Inc.)，洗脱液例如是己烷、甲醇、四氢呋喃和甲酸的混合物。优选使用己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1进行等度洗脱(约1ml/min)。使用己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5甚至可以在0.3-1.5ml/min的流速下进行分析。柱温为10-60℃，优选40℃，检测器优选是光电二极管阵列检测器(PDA)，用于采集240-400nm的光谱数据。这是由于OPC在280nm具有最大吸收，但当样品与其他多酚类混合时，280nm以外波长处的不同峰构成了最大吸收，因此有可能将OPC与其他多酚类区别开并排除它们。然而，当仅可以使用单波长检测器的情况下，可以只使用A280nm的吸收进行分析。
使用色谱法分离的所有聚合物的总峰面积(所有聚合物包括二聚体或更高聚合度的聚合物)是在280nm处具有最大吸收的A280nm峰的面积值总和。所使用的色谱柱可以是Shimpack PREP-SIL(H)(4.6mm×300mm，Shimadzu Corp.)或Supersher Si60(4.5mm×100mm，Merck & Co.)以及Inertsil SIL(4.6mm×150mm，GL Sciences Inc.)。
基于高效液相色谱法得到的峰面积，利用下述公式可计算组成OPC的每种n-聚体的比例(b％)b％＝{峰面积(每种n-聚体)}/{总峰面积(所有聚合物)}×100 (公式3)根据如此得到的每种n-聚体的比例和前述(1)得到的OPC重量，可以通过下述公式测定预定重量的分析物中含有的例如以mg计的每种n-聚体的重量n-聚体的量(mg)＝OPC的总量(mg)×n-聚体的比例(b％)/100 (公式4)下面通过实施例更详细地描述本发明。然而，本发明并不限于这些实施例。
实施例1 酸水解条件的研究观察松树皮提取物(flavangenol)被酸分解时随时间的变化。松树皮提取物(1mg)溶解于1ml 0.6NHCl/BuOH中，在90℃的热水浴中加热该溶液。由20分钟至140分钟，每隔20分钟进行采样。样品用丁醇按1∶10进行稀释，测量400-700nm的可见吸收光谱。所有样品的最大吸收出现在551nm。测量结果显示在表1中。
表1 松树皮提取物酸分解随时间的变化

结果是，在酸分解过程中，吸光度随时间的推移缓慢增加，120分钟时达到峰值。基于该结果，随后的试验中，水解期间定为120分钟(2小时)。
实施例2 酸水解中花青素的产生和测定在玻璃试管中，将含有原花青素的样品(0.5mg)溶解于1ml 0.6N HCl/丁醇中，所得溶液在90℃的水浴中静置2小时。反应完成后，用UV-265(Shimadzu Corp.)测量700-400nm的吸收光谱，并测定551nm的吸光度。在下述条件下，使用HPLC对反应完成后的溶液进行分析以测定花青素柱YMC-ODS-A312，6mm×150mm流动相CH3COOH∶MeOH∶H2O＝15∶17.5∶67.5检测A520nm(使用PDA在400-600nm测量得到)用于分析的标准物质翠雀定、氰定和天竺葵色素购自Funakoshi。标准物质翠雀定在4.2分钟流出，其λmax为535nm；氰定在5.5分钟流出，其λmax为525nm；天竺葵色素在8.0分钟流出，其λmax为515nm。如同翠雀定、氰定和天竺葵色素一样，按照上述条件对来自样品酸水解物的组分进行分析。
松树皮提取物、葡萄籽多酚、茶多酚、苹果多酚、罗望子果、原花青素B1(Funakoshi)用作OPC的标准物质。
结果显示在表2和表3中。
表2 吸光度法测定OPC含量

表3 HPLC法测定OPC含量

*1.84μg/ml氰定+1.98μg/ml翠雀定实施例3 正相HPLC对儿茶素、二聚体和三聚体进行分析在下述条件下，使用正相HPLC分析用于儿茶素和原花青素的标准物质将(+)-儿茶素(Nacalai Tesque)、(-)-表儿茶素(Wako Pure ChemicalIndustries)、原花青素B1(Funakoshi)的样品(每种样品0.1mg)分别溶解于1ml流动相中，用0.45μm滤器过滤上述溶液，然后在下述条件下进行HPLC分析。
使用下面实施例5描述的方法合成三聚体。
柱Inertsil SIL，4.6mm×150mm流动相己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1检测A280nm(使用PDA在240-400nm测量得到)在这些条件下，单体((+)-儿茶素和(-)-表儿茶素)在2.9分钟流出，二聚体在3.6分钟流出，三聚体在4.3分钟流出。
这些物质的色谱图如图1所示。
实施例4 通过正相HPLC进行分析在下述条件下，使用正相HPLC分析含有儿茶素和原花青素的混合态样品含有原花青素的样品(1-2mg)溶解于1ml流动相中，用0.45μm滤器过滤上述溶液，在下述条件下进行HPLC分析。
使用的样品为苹果多酚、葡萄籽多酚、松树皮提取物和罗望子果。
柱Inertsil SIL，4.6mm×150mm流动相己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1检测A280nm(使用PDA在240-400nm测量得到)作为分析图的色谱图如图2所示。这些图中，符号X代表在280nm没有最大吸收且不同于OPC的多酚类。
每个样品中的二聚体和三聚体的浓度通过公式c％＝a％×b％测定。结果示于表4。
表4 二聚体和三聚体的含量

实施例5 OPC的合成根据论文(1981，J.C.S.Perkin I.1235-1245)按照下述方式合成OPC。
将(+)-紫杉叶素(500mg)溶解于50ml乙醇中，加入200mg NaBH4。然后，加入1g(+)-儿茶素并溶解。然后加入HCl，将混合物搅拌1小时。反应产物用反相HPLC纯化得到三聚体。
权利要求
1.一种测定预定重量分析物中含有的黄烷-3-醇的n-聚体(n≥2)混合物(下文将所述混合物称为低聚原花青素或OPC)的总重量的方法，所述方法包括基于水解一个n-聚体产生的花青素量为n/2，而与n的大小无关的事实，测量通过水解所述分析物中的OPC产生的花青素的重量，以及将所测得的花青素的重量乘以系数2，得到所述分析物中OPC的总重量。
2.一种测定预定重量分析物中含有的低聚原花青素(OPC)总重量的方法，所述方法包括基于水解OPC产生的花青素量与OPC的总量成比例，而与OPC中含有的n-聚体的量比和聚合度n的大小不同无关的事实，测量通过水解所述分析物中的OPC产生的花青素重量，单独测量通过水解已知重量的OPC标准物质产生的花青素量，以及通过校正曲线或下述公式测量所述分析物中OPC总重量和/或所述分析物中OPC的重量比(a％)OPC总重量(mg)＝(样品的测量值/标准物质的测量值)×标准物质的重量(mg) (公式1)分析物中OPC的重量比(a％)＝(OPC总重量(mg)/分析物的重量)×100(公式2)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标准物质为原花青素B1。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述的水解通过在酸性条件下的热分解进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酸性条件是酸和低级醇的混合物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述酸为盐酸、硫酸或硝酸。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述低级醇为丙醇、丁醇、戊醇和/或异戊醇。
8.根据权利要求4-7任意一项所述的方法，其中所述的热分解在温度50-100℃，优选80-100℃，更优选85-95℃下进行，反应时间为30分钟或更长，优选1小时或更长。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其中花青素量通过高效液相色谱法和/或吸光度法测量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述吸光度法通过测量550-552nm的吸光度进行，在此波长范围内花青素在可见吸收光谱图中显示出最大吸收。
11.一种测定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的方法，所述分析物中黄烷-3-醇的n-聚体的聚合度n不同，所述方法包括如下步骤a)根据权利要求1-10任意一项的方法测定预定重量的分析物中含有的OPC总重量；b)独立于步骤a)，通过高效液相色谱法(HPLC)分析所述分析物以分离OPC中含有的具有不同聚合度n的n-聚体，并测定各种n-聚体占所有n-聚体即OPC量的定量比例；以及c)根据a)和b)的结果测定所述分析物中每种n-聚体的重量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中高效液相色谱法中使用的柱为正相柱。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述正相柱中填充的树脂为硅胶基树脂。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中高效液相色谱法中，洗脱液是己烷、甲醇、四氢呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比为己烷/甲醇/四氢呋喃/甲酸＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5，优选比例为45∶40∶14∶1，进行等度洗脱，柱温为10-60℃，优选40℃，并测量280nm的吸光度。
15.根据权利要求11-14任意一项所述的方法，其中基于高效液相色谱法得到的峰面积，根据下述公式计算每种n-聚体的定量比例(b％)b％＝{峰面积(每种n-聚体)}/{总峰面积(所有聚合物)}×100 (公式3)。
16.根据权利要求11所述的方法，其中基于(a)测定的OPC重量和(b)测定的每种n-聚体的比例，在步骤(c)中，根据下述公式测定每种n-聚体的重量n-聚体的量(mg)＝OPC的总量(mg)×n-聚体的比例(b％)/100 (公式4)。
17.根据权利要求1-16任意一项所述的方法，其中待分析的低聚原花青素包括至少一种如下通式表示的化合物[化学式1]结构式1 结构式2 结构式3 结构式4 n＝0-18的整数；n1＝1-18的整数；n2＝0-18的整数；R＝H或OH。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的低聚原花青素为包括至少一种下述原花青素类的低聚原花青素结构式1的原花青素B1、B2、B3和B4，其中n＝0；结构式2的原花青素B5、B6、B7和B8，其中n1＝0和n2＝0；以及结构式1的原花青素C1、C2和C4，其中n＝1。
19.根据权利要求1-18任意一项所述的方法，其中所述分析物为天然物质(葡萄籽、罗望子果、苹果、树皮、松树皮衍生的多酚、茶叶、可可等，和/或它们的处理产品(提取物等))、食品或饮料、医药品和/或化妆品。
20.一种通过高效液相色谱法(HPLC)测定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的不同聚合度的n-聚体比例的方法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中高效液相色谱法中使用的柱为正相柱。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中正相柱中填充的树脂为硅胶基树脂。
23.根据权利要求20-22任意一项所述的方法，其中高效液相色谱法中，洗脱液是己烷、甲醇、四氢呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比为己烷/甲醇/四氢呋喃/甲酸＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5，优选比例为45∶40∶14∶1，进行等度洗脱，柱温为10-60℃，优选40℃，并测量280nm的吸光度。
24.根据权利要求20-23任意一项所述的方法，其中基于高效液相色谱法得到的峰面积，根据下面的公式计算每种n-聚体的比例(b％)b％＝{峰面积(每种n-聚体)}/{总峰面积(所有聚合物)}×100 (公式3)。
25.根据权利要求1-24任意一项所述的方法，如果所述分析物为包括软饮料或提神饮料、茶饮料、或酒精饮料的液体时，所述方法还包括冻干所述分析物或在减压条件下固化所述分析物至干燥，然后粉末化的步骤。
全文摘要
本发明提供一种用于分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中含有的低聚原花青素(OPC)的新方法。本发明为一种分析OPC的新方法，该方法通过分析水解OPC得到的花青素以测定OPC的总量，并用高效液相色谱法(HPLC)分析OPC聚合度的比例以测定OPC中各种聚合物的含量。
文档编号G01N33/02GK1989407SQ20058002518
公开日2007年6月27日 申请日期2005年7月27日 优先权日2004年7月29日
发明者福井祐子, 中原光一 申请人:三得利株式会社