专利名称：使用含有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子和不同于蛋白质配体的配体测定 ...的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及朊病毒病领域，并特别涉及用于检测与这些疾病相关的朊病毒形式的方法。
天然的或正常的朊病毒蛋白，用PrPc表示细胞朊病毒蛋白，是在哺乳动物淋巴细胞和神经细胞中广泛表达的一种糖蛋白。
PrPc的构象改变导致对蛋白酶K耐性的病理蛋白PrPsc的出现和扩增。这种病理蛋白在本申请中将称为PrPsc或PrPres，不区别两者。在本申请中，术语“PrP”将表示任何形式的PrP，所述的PrP可以是正常的或不正常的并可以是蛋白酶K耐性的或无蛋白酶K耐性的。
哺乳动物器官中PrPsc的积聚是许多疾病的原因，这些疾病称为朊病毒病或传染性海绵状脑病(TSE)，以及特别是小型反刍动物中的瘙痒病、麋鹿中和羚羊中的慢性萎缩病(CWD)、牛海绵状脑病(BSE)和人中的克雅氏病(CJD)。
受感染宿主中的疾病的产生反映为脑中病理蛋白PrPsc的积聚，所述的蛋白积聚导致了脑细胞不可逆的损伤。
受BSE感染的牛中的症状出现得晚，其在2-6年的潜伏期后出现，以及其缓慢的发展已经相当地减缓了流行病模型的发展。BSE可通过消化传递给人并已经在人中引起了新形式克雅氏病(vCJD)的出现。
在该疾病发展之前在无症状受感染动物中，特别是在患病动物的生理液体如血和尿中检测病理蛋白PrPsc是困难的。据现在认为，当消化受感染组织时，供给人作为食物的动物中存在的PrPsc得以传递给人。因而一个主要公共卫生目标是通过检测以下来源中的PrPsc的存在来避免这种传播-在提供给人消费的动物中检测，以将它们从食物链中除去，-在供血和用于在人中输血的血液衍生产品中检测。事实上，病原蛋白PrPsc在脑受影响以前很久就存在于血细胞和淋巴细胞中，并因而其在可能检测引起临床上明显的朊病毒病的神经学体征之前很久就已存在于血细胞和淋巴细胞，如此所示，在人中的生理病理学是未知的。既然不可能进行如绵羊中的感染的试验性感染，那么用于在血或其它生物液体中检测的试验的缺少使得不可能研究并因而预防人之间通过供血传播或设想在脑损伤开始之前治疗受感染个体。
-在神经学阶段前在动物群中治疗，因而使得可能在它们到达屠宰场之前尽早地排除受感染动物。
因而，PrPsc在人或在动物生物样品中的存在的检测变得非常重要，并且几个研究团队正在研发免疫检测方法(WO 02/086511)。而且，用于将多肽、小分子或抑制剂与PrPsc复合而用以治疗vCJD的方法是积极研究的目标。然而，当生物样品中PrPsc以小量存在时，当前技术的方法常常遭遇可靠鉴别PrPsc的困难。
现在本发明者已经证明，出乎所有预料，在用于诊断可能含有PrP的生物样品中的这种蛋白的试验中使用具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子并使用不同于蛋白质配体的配体，使得可能在稀释情况下和在现有技术使用的方法不可检测到它的条件下检测该蛋白，这两种成分的结合使用没有改变PrP结合至用于诊断试验的PrP-特异性结合伴侣的能力。
因而，本发明的一个主题是用于检测可能含有PrP的人或动物源生物样品中的PrP，特别是PrPsc的方法，所述方法的特征在于它使用具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子和不同于蛋白质配体的配体。
本发明也涉及用于检测PrP的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含不同于蛋白质配体的配体和具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子。
表述“不同于蛋白质配体的配体”意于表示能结合至PrP并且本质不是蛋白的化合物。对于从该配体定义排除的蛋白质配体，可提及抗-PrP抗体。
表述“具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子”意在用于表示具有至少一个正电荷的分子或具有涉及糖苷键官能的分子，或具有两者的分子。
通过联合使用如上定义的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子和不同于蛋白质配体的配体的分子，本发明方法因而具有使得能检测其中PrP以小量存在的生物样品中的PrP的优势。
进行本发明的检测方法的生物样品是可能含有PrP的任何动物或人源样品。
对于这种样品的实例，可提及脑、中枢神经系统组织、器官如脾和肠，以及生物液体如脑脊髓液、尿液和血液。
本发明方法可能涉及的动物是产生朊病毒疾病的动物。对于非限制性实例，将提及绵羊(ovine race)和牛。
对于具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子中含有的正电荷，优选由碱性官能如胍或铵官能提供的正电荷。
对于具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子中含有的糖苷键，优选异苷类型，例如在大环内酯类和氨基糖苷类中的那些。
优选用于本发明目的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子是具有至少一个正电荷和至少一个糖苷键的分子，以及具有至少两个胍和/或铵官能的分子，优选在非聚合亲水性分子体系中。
根据本发明特别的实施方案，具有至少一个正电荷和至少一个糖苷键的分子选自具有胍环的氨基糖苷类，优选链霉素。
根据本发明另一个特别的实施方案，具有至少两个胍和/或铵官能的分子选自聚丙酰胺、三乙烯四胺(TET)、双-3-氨基丙胺、四盐酸精胺、二氢链霉素倍半硫酸盐和链霉素，后面的两种化合物也属于具有至少一个正电荷和至少一个糖苷键的分子家族。
使用具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子，特别是具有至少两个胍(guanidinium)和/或铵官能的分子，优选链霉素，更优选以盐的形式使用，使得存在于受测试生物样品中的PrP沉淀。这种沉淀性质在存在PrPsc时，特别是在用蛋白酶K(PrPres)处理后得以增加。这种沉淀是由于用具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子处理后获得的PrP聚集体(也称为通过具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子交联的PrP)的形成引起的。
因而，有可能通过一种方法检测PrP，特别是PrPsc，所述的方法特征在于将源于或获自动物或人的生物样品与具有至少两个胍和/或铵官能团的分子接触，符合该定义的抗生素除外，如链霉素。
这种方法可以通过以下步骤实施a)加入具有至少两个胍和/或铵官能团的分子至源于或获自动物或人的生物样品，抗生素除外。
b)将该溶液接受加热(例如，在37-150℃之间)，并然后离心，并且将沉淀颗粒与上清液分离，c)在电泳凝胶上迁移、转移并免疫检测后检测PrPsc，或在捕获于固相支持物上，随后通过ELISA类型的免疫检测后检测PrPsc。
方法也包含由在下文说明的条件下变性组成的步骤，以作为额外步骤。
方法也包含由在下文说明的条件下加入蛋白酶K组成的步骤，以作为额外步骤，优选在步骤a)之前。
类似地，用于检测PrPsc的步骤可以在下文说明的条件下实施。
因为它们结合PrPsc的能力，具有至少两个胍和/或铵官能团的分子，抗生素除外，可特别用于PrPsc的沉淀、检测和/或诊断，甚至是在通过免疫组织化学检测的期间，并也可用于将PrPsc从组织或从生物液体中除去。
不同于蛋白质配体的配体的加入，特别是大环配体或糖胺聚糖的加入(不像蛋白质配体)，使得可能增强PrP蛋白检测的敏感性并能更有效地捕获由具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子交联的PrP。因此，PrP可以在其仅以小量存在的生物样品中得以检测。
具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子的量，以及不同于蛋白质配体的配体的量可以通过本领域技术人员根据样品的特异性方便地确定。因而，例如，具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子如链霉素的量可以在50和500mg/ml之间，优选在100和300mg/ml之间。
出乎所有意料，具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子作用于PrP，然后不同于蛋白质配体的配体与因而形成的PrP聚集体复合(反之亦然)，没有以任何方式削弱PrP的检测，例如使用抗-PrP检测抗体的检测。
根据本发明特别的实施方案，在加入不同于蛋白质配体的配体前将所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子加入至所述的生物样品中，这样使得PrP沉淀。
优选地，为了促进PrP沉淀，在加入具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子后，将反应介质温和地加热至25-45℃之间的温度，优选37℃。
在将接受测试的生物样品与所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子接触前，可将样品用蛋白酶K预处理使得能蛋白水解细胞PrP。因而处理过的样品，就朊病毒蛋白而言，仅含有蛋白酶K抗性的PrPsc蛋白(PrPres)。该蛋白酶K处理步骤是用于测定朊病毒病或用于测定受测试的样品受PrPsc污染的区别步骤，其中不存在PrPsc或PrPres的特异性抗体或配体。
用于本发明方法的蛋白酶K的量可以由本领域技术人员容易地确定。因而，例如，该量可以是在80和160μg/ml之间。
因而，根据优选的实施方案，本发明用于检测PrP的方法包含加入蛋白酶K至样品中的额外步骤。该蛋白酶K消化步骤可以在将PrP与所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子交联之前，或在这种交联之后进行。
根据另一实施方案，本发明方法包括以下步骤a)将蛋白酶K加入至所述的样品中以消化PrPc，b)向因而获得的混合物中加入所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子以获得PrP聚集体，c)加入不同于蛋白质配体的配体，并
d)显示PrPres的存在。
在存在具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子时形成的PrP聚集体(含有PrP)可以在它们与不同于蛋白质配体的配体反应之前从反应介质分离，不论是否用蛋白酶K预处理。分离方法通过本领域技术人员已知的用于分离沉淀的任何方法实施。例如，将PrP聚集体通过离心，并然后通过除去上清液而分离。该分离步骤使得可能除去后续的用于检测PrP的反应不需要的所有产品，例如蛋白酶K，如果合适，还除去消化了的蛋白和溶液中游离的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子。
为了进一步提高本发明的检测方法的灵敏性，在PrP聚集体与不同于蛋白质配体的配体反应之前，也可能实施存在于接受测试的生物样品中的所述聚集体的变性。该变性步骤可以通过本领域技术人员已知的用于将蛋白聚集体变性的任何方法实施。优选地，变性通过加入盐酸胍进行。
因而，根据本发明的用于检测PrP的方法包含至少一种下面的额外步骤i)和ii)i)将PrP聚集体从反应混合物分离，并ii)变性PrP聚集体，如果合适，这些步骤包含于步骤b)和步骤c)之间。
根据优选的实施方案，本发明检测方法连续地实施这两个步骤i)和ii)，优选在步骤b)和步骤c)之间。
根据本发明方法生物样品中PrP存在的显示可以根据用于检测样品中的分析物的常规方法进行。
例如，可以通过免疫检测或非免疫检测进行。
术语“免疫检测”意于指与PrP的免疫反应的证实，这种免疫反应包括接受检测的PrP和PrP-特异性结合伴侣之间的结合，或者包括可能包含于接受测试的样品中的PrP和受标记PrP之间的竞争性反应。
对于非免疫检测，可提及例如，本领域技术人员熟知的电泳凝胶染色技术。
通过免疫反应对PrP的检测可以例如在加入PrP-特异性结合伴侣后进行。
术语“PrP-特异性结合伴侣”意于指能结合PrP的任何伴侣。然后免疫反应的显影将包括PrP-特异性结合伴侣/PrP复合物的显影。
根据优选的实施方案，本发明方法是这样的，即如果合适，在步骤d)中加入用于PrP-特异性结合伴侣和PrP之间的免疫反应的PrP-特异性结合伴侣。
对于PrP-特异性结合伴侣，可提及例如抗体、抗体片段、多肽、蛋白、核酸、半抗原和核酸适体(aptamer)。
术语“抗体”包括多克隆抗体或单克隆抗体、通过基因重组获得的抗体和抗体片段。
多克隆抗体可以通过用至少一种感兴趣的靶标抗原，在本情况下是PrP，免疫动物，随后回收纯化形式的所需的抗体，所述的纯化抗体的回收是通过取样所述动物的血清，并将所述抗体从其它血清成分分离，特别是通过其上连接有抗体特异性识别的抗原，特别是PrP的柱上的亲和色谱分离。
单克隆抗体可通过杂交瘤技术获得，其一般性原理在下文叙述。
首先，用感兴趣的靶标抗原，在本情况下是PrP，免疫动物，一般是小鼠(或在体外免疫的情况下是培养中的细胞)，然后其B淋巴细胞能产生对抗所述抗原的抗体。然后将这些产生抗体的淋巴细胞与“无限增殖的”骨髓瘤细胞(在实例中是鼠细胞)融合以产生杂交瘤。使用因此获得的非均质混合物，然后进行能产生特异性抗体并无限增殖的细胞的选择。每种杂交瘤以一个克隆的形式增殖，每种导致单克隆抗体的产生，所述的产生的单克隆抗体的对于感兴趣的抗原的识别性质可以进行测试，例如通过ELISA，通过一维或二维免疫印迹法，通过免疫荧光法或使用生物传感器测试。随后将因而选择的单克隆抗体纯化，特别是根据上面描述的亲和色谱技术进行。
对于用于本发明的合适抗体，可提及抗体8G8、12F10(SpiBio，法国)和3F4(Immunok)。
抗体片段是它们保留了PrP-结合功能的那些抗体片段。
术语“多肽”意于指至少两个氨基酸的链。术语“氨基酸”用意指编码蛋白的一级氨基酸，酶促作用后衍生的氨基酸如反式-4-羟脯氨酸和天然的但不存在于蛋白质中的氨基酸如正缬氨酸、N-甲基-L-亮氨酸或staline(Hunt S.in Chemistry and Biochemistry of the aminoacids，Barett GC，编著，Chapman and Hall，London，1985)、可用于固相支持或液相合成的用化学官能保护的氨基酸和非天然氨基酸。
术语“蛋白”包括全蛋白和异蛋白(heteroprotein)如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白和糖蛋白，包括纤维状蛋白和球状蛋白。
术语“核酸”意于指寡核苷酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸及其衍生物。
术语“寡核苷酸”表示至少2个核苷酸的链(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或两者)，所述的核苷酸可以是天然的或经修饰的。术语“修饰的核苷酸”意于指例如，含有受修饰碱基和/或包含在核苷酸间的键的水平和/或主链水平上的修饰的核苷酸。对于受修饰的碱基的实例，可提及肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤和溴-5-脱氧尿苷。为了举例说明受修饰的核苷酸间的键，可提及硫代磷酯键、N-烷基亚磷酰胺键、烷基磷酸酯键和烷基磷酸二酯键。α-寡核苷酸，如那些描述于FR-A-2 607 507中的α-寡核苷酸、LNA，如描述于Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，Volume 8，Issue 16，18 August 1998，pages 2219-2222中的硫代磷酯-LNA和2′-硫代-LNA以及作为M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.(1992)，114，1895-1897的文章主题的PNA，是包括其主链受到修饰的核苷酸的寡核苷酸的实例。
术语“半抗原”表示非免疫源性化合物，即化合物本身不能通过产生抗体来促进免疫反应，但能为通过在已知条件下免疫动物，特别是通过用半抗原-蛋白结合物免疫动物而获得的抗体识别。这些化合物一般具有少于3000Da的分子量，并最通常为少于2000Da，并且可以，例如，是糖基化的肽、代谢物、维生素、激素、前列腺素、毒素或多种医药产品、核苷和核苷酸。
核酸适体是捕获伴侣，其本质是蛋白和核酸，并且其功能是作为抗体并用于结合至蛋白质配体(Toulmé，J.J.和Giege，R.，1998，Medicine Science，14(2)，155-166)。
这些多肽、蛋白、半抗原和核酸适体全部具有结合至PrP或结合至PrP聚集体的能力。
特别是在步骤d)中进行的PrP-特异性结合伴侣和PrP之间的免疫反应的显影可以通过本领域技术人员已知的任何检测方法，例如直接或间接方法进行。
在直接检测的情况中，即不涉及标记，免疫反应例如通过等离子共振或通过带有导电聚合物的电极上的循环伏安法(cyclicvoltametry)观测。
在间接检测的情况下，及涉及标记，可通过已预先接受标记的PrP-特异性结合伴侣进行标记。
根据本发明方法，存在于生物样品中的PrP的显影也可以根据“竞争”法进行。然后加入预先标记的PrP，特别是在步骤d)中加入，代替PrP-特异性结合伴侣。在该情况下，不存在PrP时检测信号处于最大值，并然后当没有经标记的寻找的PrP的浓度增加时(由于竞争性反应)，检测信号逐渐降低。
术语“标记”意于指能直接或间接产生可检测信号的标记物的连接。这些标记物的非限制性名单包括·能产生例如通过比色法、荧光或发光而可检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，·发色团如发光化合物或染料，·放射性分子例如32P、35S或125I，·荧光分子例如荧光素、罗丹明、alexa或藻蓝蛋白，以及·粒子例如金粒子、磁性胶乳粒子或脂质体。
也可使用间接体系，例如通过另外的配体/抗配体对。配体/抗配体(antiligand)对是本领域技术人员所熟知的，并且可提及的是例如以下对生物素/链霉抗生物素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与其互补的多核苷酸。在这种情况下，是配体携带有结合剂。该抗配体可通过在前面段落描述的标记物直接检测，或通过配体/抗配体可自身检测。
在某些情况下，这些间接检测体系可以导致信号扩增。这些信号扩增技术为本领域技术人员所熟知，并且可参考文章J.Histochem.Cytochem.45481-491，1997。
蛋白标记是本领域技术人员周知的，并通过例如Greg T.Hermanson in Bioconjugate Techniques，1996，Academic Press Inc，525B Street，San Diego，CA92101 USA描述。
根据使用的标记的类型，例如使用酶，本领域技术人员将加入试剂显影该标记。
这种试剂是本领域技术人员所周知的并特别在Principles andPractice of Immunoes say，2ndEdition，Edited by C.Price，D.J.Newman Stockton Press，1997，345 Park Avenue South，New York中描述。
PrP检测可以是固相检测，即使用其上固定有用于捕获受检测蛋白的结合伴侣的固相。在本发明情况下，是不同于蛋白质配体的配体作为预-固定于固相上的捕获伴侣。本领域技术人员熟知的固相检测的一个实例是三明治类型的检测，例如ELISA类型的检测。
因而，根据本发明的优选实施方案，将不同于蛋白质配体的配体结合至固相支持物上。
对于固相支持物，可提及珠如磁性珠和微量滴定板。
以本领域技术人员已知的方式，如通过吸附或共价结合，优选共价结合，可将该不同于蛋白质配体的配体结合至固相支持物上。
因而，该固相支持物可以用能与配体携带的官能团形成键的官能团进行官能化。根据优选的实施方案，固相支持物用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)键或用NH2官能团进行官能化。该官能团可以与配体携带的官能团反应。在该实施方案中，携带能反应从而与固相支持物的官能键形成键的官能团的配体，特别是携带NH2或COOH键的配体是特别优选的。
不同于蛋白质配体的配体的实例包括，例如，大环配体和糖胺聚糖。
不像蛋白质配体，这些配体全部具有扩增PrP蛋白检测灵敏性的特性。
根据本发明的一个实施方案，不同于蛋白质配体的配体选自大环配体和糖胺聚糖。
糖胺聚糖为本领域技术人员所周知并描述于例如Polysaccharides，M.Yalpani，Elsevier，Amsterdam，1988中。
对于适合于本发明目的的糖胺聚糖，可提及例如，肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸和硫酸角质素。
术语“大环配体”意于指包含一串形成大环的环的化合物。
大环配体为本领域技术人员熟知。对于非限制性实例，可提及环芳、Metacyclophane、环糊精、环(四-变色酸)、spherand和环[n]veratrylene。
大环配体具有特别的优势，即通过笼效应它们使得有可能捕获游离形式或聚集体形式的接受测试的蛋白。
大环配体可以根据本领域技术人员已知的技术，例如在Comprehensive Supramolecular Chemistry，Pergamon，Oxford，1996中描述的技术而得以制备。
优选用于本发明方法的大环配体选自metacyclophane，特别优选杯芳烃。这种杯芳烃化合物可以根据描述于Arduini，A.等，1996，Macrocycle Synthesis，Eds.Harwood，L.M.& Moddy，C.J.OxfordUniversity Press，Oxford以及Da Silva等，2001，J.Supramol.Chem.，1135-138的方法而获得。
根据优选的实施方案，本发明的大环配体符合下面的通式(I)
其中R1代表氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，R是如下定义，R2代表氢原子或R、COR、Pol或CH2Pol基团，其中Pol代表磷酸基、硫酸基、胺基、铵基或羧酸基，并且R是如下定义，R3代表氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R是按如下定义，R4代表氢原子、羟基、OR基团、OCH2R基团或OCOR基团，其中R是如下定义，Y是碳、氮或硫原子，R5和R6，每个独立地是缺失或代表氢原子、CH2基团或如下定义的R基团，或者R5和R6一起代表氧或硫原子。
X代表CH2基团或氧原子或硫原子，m代表等于0或1的整数，R代表氢原子或饱和的或非饱和的、有支链的或无支链的、环状的或非环状的基于烃的链，所述的链可能为卤素基团取代或不受其取代，并且所述的链带有极性或非极性官能团。
n是在3和15之间的整数，取代基R1至R5、R、X和Y以及整数m根据单元可性质不同。
因而，式(I)化合物是一连串n个单元的形式，其特征是苯环的存在，并且该环的取代基可以从一个单元到另一单元而不同，但在它们上面的定义限制内。
可能为卤素基团取代的或不为其取代的并且带有极性官能团或非极性官能团的饱和的或非饱和的、有支链的或无支链的、环状的或非环状的基于烃的链是本领域技术人员周知的。例如，可提及烷基类、烯烃类、芳基类和饱和环如环己烷。非极性基团的一个实例是CF3以及极性基团的一个实例是如上定义的取代基Pol。
特别优选的式(I)化合物符合下式(Ia) 其中n是在4和8之间的整数，每个R2基团，独立地是硫酸基团或磷酸基团。
R7代表(CH2)t-(CO)s-(NH2)基团或(CH2)t-COOH基团，其中t是0到6之间的整数以及s是0到6之间的整数。
特别优选的式(Ia)的化合物是其中两个R2基团每个是硫酸基团，n是4、6或8，以及R7是氢原子、-CH2COOH基团、-CH2CONH2基团或-CH2CH2NH2基团的那些式(Ia)化合物，它们构成了本发明的实施方案。
根据优选的实施方案，大环配体符合通式(Ia)，其中n＝6、X＝Y＝硫酸基团以及R7是-CH2CH2NH2。
对于本发明的用于免疫检测病原PrP的方法的实施，可使用诊断试剂盒，所述试剂盒包含不同于蛋白质配体的配体，优选大环配体，以及具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子。
根据优选的实施方案，存在于试剂盒中的所述不同于蛋白质配体的配体结合至固相支持物上用于根据固相检测方法实施病原PrP的检测。
从以非限制性说明的方式给出的以下实施例以及从
图1-10，本发明将得到完全理解，其中-图1是给出阳性的(+)或阴性的(-)小鼠血清、绵羊血清和牛血浆的样品中PrPres的OD值的图示，所述的OD值是通过本发明方法检测后获得的，
-图2是给出使用两个不同显示(revealing)抗体获得的阳性(血浆+)或阴性(血浆-)牛血浆样品中PrPres的OD值的图示，所述的OD值通过本发明方法检测后获得，-图3是给出使用两个不同显示(revealing)抗体获得的关于克雅氏病为阳性(CJD+)或阴性(CJD-)的人血清和人血浆样品中的PrPres的OD值的图示，所述的OD值通过本发明方法检测后获得，-图4是蛋白印迹法后用链霉素倍半硫酸盐(泳道5-7和13-15)或用链霉素(泳道2-4和10-12)处理过的BSE牛脑样品迁移后获得的电泳凝胶(图4B)的图示(图4A)，泳道1和9对应于未处理的对照以及泳道8对应于分子量标记泳道，-图5是蛋白印迹法后用渐增量的三乙烯四胺处理过的BSE牛脑样品(泳道2-6)迁移后获得的电泳凝胶(图5B)的图示(图5A)，泳道1对应于未处理的对照以及泳道8对应于分子量标记泳道，图6是蛋白印迹法后用渐增量的双-3-氨基丙胺处理过的BSE牛脑样品(泳道3-7)迁移后获得的电泳凝胶(图6B)的图示(图6A)，泳道2对应于未处理的对照以及泳道1对应于分子量标记泳道，-图7是蛋白印迹法后用链霉素和杯芳烃对-磺酸-3，7-(2-氨基乙氧基)杯-[6]-芳烃(泳道7-15)处理过的BSE牛脑样品迁移后获得的电泳凝胶(图7B)的图示(图7A)，泳道1-3对应于没有加入链霉素或杯芳烃的对照样品，以及泳道4-6对应于其中仅加入杯芳烃的样品。
-图8是蛋白印迹法后用链霉素和肝素处理过的用1％的对克雅氏病阳性或阴性(分别为CJD+或CJD-)的脾匀浆加载的正常人血(或对克雅氏病阴性)样品(泳道1-5对CJD+以及泳道8-12对CJD-)迁移后获得的电泳凝胶(图8B)的图示(图8A)，泳道6对应于分子量标记泳道以及泳道7对应于阳性对照样品，-图9是蛋白印迹法后用链霉素和肝素处理过的用5％的对克雅氏病阳性或阴性(分别为CJD+或CJD-)的脾匀浆加载的正常人血样品(泳道1-5对CJD+以及泳道8-12对CJD-)迁移后获得的电泳凝胶(图9B)的图示(图9A)，泳道6对应于分子量标记泳道以及泳道7对应于阳性对照样品，并且-图10是蛋白印迹法后用链霉素和肝素处理过的用10％的对克雅氏病阳性或阴性(分别为CJD+或CJD-)的脾匀浆加载的正常人血样品(泳道1-5对CJD+以及泳道8-12对CJD-)迁移后获得的电泳凝胶(图10B)的图示(图10)，泳道6对应于分子量标记泳道以及泳道7对应于阳性对照样品。
实施例1样品的预处理1.不用链霉素处理的实体器官样品如脑提取物首先将器官(脑等)在5％(w/v)葡萄糖溶液中匀浆化以获得10％悬液。
加入水中的5μl 2mg/l的蛋白酶K(PK)溶液、1μl 10％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液和6μl 2.5％w/v的N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷至100μl上面描述的匀浆溶液。
搅动该混合物并然后在37℃下孵育60分钟。
然后加入500μl氯仿∶甲醇(1∶2)混合物并搅动混合物。
随后在室温下以15,000rpm进行离心步骤10分钟。
然后除去上清液并将沉淀颗粒再悬浮于25μl 6M的盐酸胍溶液。将悬液在37℃下孵育30分钟。
最后，加入400μl PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)溶液和吐温20(0.05％w/v)。
2.用链霉素处理的实体器官样品如脑提取物首先将器官(脑、脾等)在5％(w/v)葡萄糖溶液中匀浆化以获得10％悬液。
加入水中的5μl 2mg/l的蛋白酶K(PK)的溶液、20μl 2.5％w/v的N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷至100μl的上面描述的匀浆溶液。搅动该混合物并然后在37℃下孵育30分钟。
加入20μl浓度为1g/ml的硫酸链霉素溶液，并搅拌该混合物且于37℃下再孵育1小时。
然后加入500μl氯仿∶甲醇(1∶2)混合物并搅动该混合物。
随后在室温下以10,000rpm进行离心步骤10分钟。
然后除去上清液并将沉淀颗粒再悬浮于25μl 6M的盐酸胍溶液。将该悬液在37℃下孵育30分钟。最后，加入400μl PBS溶液和吐温20(0.05％w/v)。
3.用链霉素处理的生物液体如血清和血浆将蛋白酶K溶液加入至100μl血清或血浆中，使得酶的终浓度为80μg/ml。然后通过搅动混合该溶液并将其在37℃下孵育30分钟。
加入20μl浓度为1g/ml的硫酸链霉素溶液，并搅拌该混合物且于37℃下再孵育1小时。
在15000rpm下离心10分钟后，去除上清液。
将残留的沉淀颗粒通过搅动再悬浮于水中的25μl 6M的盐酸胍溶液。然后将悬液在37℃下孵育30分钟。
然后加入400μl含有0.05％(w/v)吐温20缓冲剂的PBS溶液，并搅动该混合物。
4.从神经系统制备的纯化的经消化的(PrPres)PrPsc纤维(SAF)样品首先将器官(脑等)在5％(w/v)葡萄糖溶液中匀浆化以获得10％悬液，并过滤。
将PK按每100mg组织25μg的比例使用。通过搅动匀浆化后，将试管置于37℃的孵育器中1小时。
通过用10mM的Pefabloc匀浆化终止PK的作用。
超速离心的准备包括用600μl 30％的肌氨酰匀化1000μl经消化的磨碎材料。在将该混合物转移至超离心管(Beckman，Quick Seal，2.2ml)中的蔗糖垫层(400μl 10％的蔗糖)上之前将其留在室温下至少15分钟。将该离心管用超纯水装满，并然后将其加热密封并置于超速离心转子中。
该超速离心以100000rpm在20℃下持续2小时。
然后吸掉2/3的上清液，包括脂质级分。通过倒置于吸水纸上干燥沉淀颗粒。
然后将该沉淀颗粒用100或200μl的PBS吸收用来立即使用或用100或200μl变性缓冲液吸收以用于冷冻。在后一种情况中，将沉淀颗粒在100℃下加热10分钟。冷却后，在20℃下以12000rpm将该离心管离心5分钟。
将上清液在-80℃下冷冻。这些样品用作“阳性”纯化的PrPres标准品。
实施例2杯芳烃配体对磺酸-3，7-(2-氨基乙氧基)杯-[6]-芳烃(称为C6S)的制备1.制备该C6S大环辅助配体具有以下通式 该配体根据描述于Eric Da Silva和Anthony W.Coleman，Synthesis and complexation propertiest owards amino acids ofmono-substituted p-sulphonato-calix-[n]-arene，Tetrahedron 59(2003)7357-7364中的方法制备。
然后可以将该配体结合至带有如下文说明的活性表面的固相支持物(珠或板)上。
2.结合C6S配体至板上96-孔“NHS活化板”购自Covalab公司(Lyon，法国)。将100μl配体溶液以多种浓度溶解于50mM磷酸缓冲液，pH8.2中。于37℃下孵育2小时后用MilliQ水洗涤孔3次(3×200μl)。在使用它们之前将该板于室温下干燥。结合方案
3.结合至珠上将4ml NHS活化的珠溶液(2×109珠/ml；DynabeadsM270Amine，Dynals公司，Norway)等分至1ml的试管中。将珠离心并通过磁化沉淀。移除上清液并用1ml水洗涤该珠3次。将珠沉淀颗粒吸收于多种体积的50mM磷酸缓冲液(pH8.2)中的杯芳烃溶液中。加入600μl、120μl、60μl和12μl 50mg/ml(50mM的磷酸缓冲液，pH8.2)的配体溶液。室温下搅拌该珠24小时。用MilliQ 18Ω水洗涤该珠3次以除去没有反应的配体。将该珠保存于1ml的水中以恢复最初的2×109珠/ml的浓度。该珠溶液随时可使用。这些珠在全文中定义为“C6S珠”。
C6S结合至珠上的方案
实施例3PrPres的检测1.使用的样品阳性牛脑、血清和血浆样品源于已经确认患有TSE(传染性海绵状脑炎)朊病毒病的动物，其中所述疾病的确认是通过常规的参照方法，包括通过蛋白印迹法搜索脑组织中的PrPres，如Madec等，2000，Microbiol pathogenesis，28353-362描述的。阴性对照对应于来自动物的脑、血清和血浆样品，其中所述动物患朊病毒病的可能性已经通过相同的分析方法排除。用于血浆的抗凝血剂是EDTA。
这些样品由AFSSA(Agence Francaise de SécuritéSanitaire desAliments)[法国食品安全局]，Lyon，FRANCE提供。
2.根据ELISA类型方法的PrPres的检测在使用前，根据上面的实施例2.2而获得的板的孔通过用脱脂乳(5％)和PBS/吐温20(0.05％w/v)的混合物在37℃下处理60分钟而预饱和。然后每孔用800μl PBS/吐温20(0.05％w/v)洗涤孔三次。
通过将板倒置除去残余缓冲液。将100μl每种根据上面的实施例1.3制备的生物液体样品分配进板孔中并将该板在37℃下孵育100分钟，同时以400rpm机械搅动。
该第一次孵育后，将每孔用800μl PBS/吐温20(0.05％w/v)混合物再次洗涤三次并然后干燥该板。
将用过氧化物酶标记并在PBS/吐温20(0.05％w/v)混合物中稀释至0.05μg/ml的抗-PrP显示抗体以100μl/孔的比例加入并将该板在37℃下再孵育60分钟。使用的抗体识别人PrP的氨基酸145-154所限定的区域和动物PrP的该同源区域(抗体AC23)。然后将该板用800μl PBS/吐温20(0.05％w/v)溶液(PW41，Sanofi Pasteur)冲洗三次并通过倒置该板除去残余缓冲液。
通过加入100μl根据厂商推荐方法(bioMérieux试剂盒)制备的显色溶液至每孔进行显示。将板在室温下暗处孵育10分钟。
通过加入50μl硫酸溶液(1.8N)停止反应。
使用分光光度计(PR2100分光光度计，Biorad)在490nm的波长下读取获得的信号。
3.根据蛋白印迹技术检测脑中的PrPres使用的方法符合用于在动物中诊断朊病毒疾病并由Madec等，2000，Microbiol pathogenesis，28353-362描述的参考方法。
4.结果结果在下表1中给出表1通过上面描述的ELISA类型的方法检测牛血清和血浆中的PrPres，与使用来自相同动物脑进行的蛋白印迹类型的参考方法相比较的特异性的显示。
表1
这些结果清楚地显示，因为两种测试方法(本发明方法和参照的蛋白印迹法)之间的一致，本发明方法使得有可能检测生物液体中的PrP。
而且，本发明方法也可应用于生理性液体如血清和血浆。
实施例4本发明方法在多种物种上的应用1.样品除了在上面实施例3中使用的样品，还使用源于通过用蛋白印迹法搜索脑组织中的PrPres而确认患有朊病毒病即瘙痒病的动物的阳性绵羊脑、血清和血浆样品以及来自受源于牛脑(视为阳性牛)的BSE毒株感染的绵羊种成员的血浆。
鼠血清样品取自C57BL6小鼠，其中所述的小鼠通过用100μl来自感染了小鼠-适应性C506M3瘙痒病毒株的羊的脑悬液，以10％于5％的葡糖糖溶液中，并稀释为1/200，将其在腹膜内注射预先接种。接种后15天从眶窦收集血液。
这些样品也由AFSSA(Agence Francaise de SécuritéSanitaire des Aliments)[食品安全法国局]，Lyon，FRANCE提供。
2.根据ELISA类型方法检测生理液体中的PrPres重复在上面的实施例3.2中描述的方法。
3.结果结果在图1中报告，给出了在阳性或阴性(+或-)小鼠血清、绵羊血清和牛血浆样品中获得的OD值。
该图证明，令人惊奇地是，无论哪种物种，源于患有朊病毒病的动物的样品的光密度值较于源于对照动物的样品的OD值是显著阳性的。
本发明方法因此可应用于多种物种。
实施例5在本发明方法中多种抗体的使用1.样品使用如上面实施例3中描述的牛样品。
2.根据ELISA类型方法检测生理液体中的PrPres重复上面的实施例3.2中描述的方法，使用如上面描述的抗体AC23或抗体8D11G12(bioMérieux，法国)作为显示抗体。
3.结果结果在图2中报告，给出了在阳性或阴性(+或-)牛血浆样品中获得的OD值。
该图证明本发明方法可以用多种抗-PrP抗体进行。
实施例6实体器官中的PrPres的检测1.样品使用的样品对应于i)源于通过常规参照方法，包括通过蛋白印迹法搜索脑组织中的PrPres而确认患有朊病毒病或不患有该病的阳性或阴性牛的脑样品，和对应于ii)取自已经用瘙痒病的小鼠-适应性毒株I/C接种并显示该病特异性症状的小鼠的脑和脾。
这些样品由AFSSA(Agence Francaise de SécuritéSanitaire desAliments)[法国食品安全局]，Lyon，FRANCE提供。
将它们按上面实施例1.2中说明的处理。
2.根据ELISA类型方法检测实体器官中的PrPres重复在上面的实施例3.2中描述的方法。
3.结果将通过参照的蛋白印迹法在相同的实体器官样品上获得的结果与通过本发明方法获得的结果比较。
结果证明使用本发明方法(结合在脑制备过程使用链霉素和根据ELISA类型方法使用杯芳烃)，使得能在所有阳性样品中检测PrPres。
本发明方法的这种用途使得能检测取自用瘙痒病的小鼠-适应性毒株接种的小鼠的脑和脾中的PrPres。
实施例7人血清和血浆中的PrPres的检测1.样品使用的样品对应于取自通过常规参照方法确认为患有克雅氏病或不患有该疾病的阳性患者和阴性患者的血浆和血清。
2.根据ELISA类型方法检测血清和血浆中的PrPres使用如上面描述的抗体AC23或抗体8D11G12(bioMérieux，法国)作为显示抗体，重复在上面的实施例3.2中描述的方法。
3.结果结果在图3中说明，该图是给出使用两种不同的显示抗体，通过本发明方法在关于克雅氏病阳性(CJD+)或阴性(CJD-)的人血清和血浆样品中检测PrPres后获得的OD值的图示。
图3证明，令人惊奇的是，本发明方法使得能在患有CJD的患者的血清和血浆中特异性检测PrPres。
本发明方法因此也可应用于人。
实施例8多种具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子的使用1.样品的制备接受测试的样品从BSE-阳性牛脑匀浆按如下制备-将1μg蛋白酶K加入至100μl悬浮于5％葡萄糖溶液中的10％的BSE-阳性牛脑匀浆中，并然后将其在37℃下孵育1小时。
-然后加入100μl Laemmli缓冲液，搅动混合物，在100℃下加热5分钟，并在12000rpm下离心5分钟，回收上清液。将对应于250、300、400、500或2500μg的脑组织的5、6、8、10或50μl体积的该悬液用于下面描述的实验，加入或不加入具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子。
2.蛋白印迹如由Laemmli，Nature 227(1970)，680-685描述的在存在十二烷基硫酸钠的一维15％的聚丙酰胺电泳凝胶上(SDS PAGE)迁移后，将蛋白通过电泳转移至硝酸纤维素膜上并与识别由氨基酸146-160组成的朊病毒蛋白特异性表位的单克隆抗体(Spi-Bio，法国)在室温下进行免疫印迹60分钟。第二检测抗体(1/5000)是针对小鼠免疫球蛋白重链和轻链、结合至辣根过氧化物酶上的山羊抗体(IgG H+L)。
然后洗涤该印迹并且通过在胶片上(Biomex light，Kodak)使用ECL试剂盒(Amersham)或用super Signal Ultra(Pierce)化学发光并在Fluor S.Multimager(BioRad)上显影检测信号。
3.使用二氢链霉素倍半硫酸盐检测PrPsc该分子是具有两个胍官能团和一个铵官能团的分子。
将渐增浓度(0、2.5、5和10mg)的二氢链霉素倍半硫酸盐或作为对比的链霉素加入至恒定体积的在上面第1点中制备的样品中的PrPsc(50μl)。
在37℃下孵育1小时后，在12000rpm下进行5分钟离心并回收上清液(起始上清液)。
也将沉淀颗粒回收并加入50μl 8M脲和Laemmli缓冲液的v/v溶液。用涡旋搅拌器用力搅拌后，将它们在100℃下加热5分钟并在12000rpm下离心5分钟。最后，回收上清液(沉淀颗粒上清液)。
将起始上清液及沉淀上清液如上面第2点中说明的在SDS PAGE上迁移。
该测试的结果在图4中显示，给出迁移后电泳凝胶的图示并且不同的泳道1-15对应于下表2中给出的处理条件，加入或不加入基于链霉素的分子。
表2
如图4中指出的，缺少受测试的分子时，所有的PrPsc带确定为存在于上清液中，而存在链霉素或二氢链霉素倍半硫酸盐时，PrPsc物质在沉淀颗粒中发现。
结果显示加入介质的二氢链霉素倍半硫酸盐和链霉素一样，诱导与PrP的交联，该交联使得用简单的离心(不需要超速离心)能获得PrP的完全沉淀。因此获得的聚集体可以使得能根据本发明方法检测PrP，如果合适，在与不同于蛋白质配体的配体反应后进行检测。
4.使用三乙烯四胺或TET检测PrPsc该分子是具有4个铵官能团的分子。
对于该实验，将渐增浓度的TET(105、210、420、630和840μg)加入至从250μg脑获得的根据上面第1点制备的恒定体积(5μl)的PrPsc，所述的脑来自患有BSE的牛属动物。立即将该混合物在12000rpm下离心5分钟并将上清液用于通过蛋白印迹法的免疫检测。
该结果在图5中显示，给出迁移后获得的电泳凝胶的图示，其中不同的泳道1-7对应于下表3中给出的处理条件，有或没有TET。
表3
图5中的结果显示通过加入105、210、420、630和840μg引起的介质中三乙烯四胺的量的增加自发地导致了朊病毒蛋白较于无该分子的对照在表观分子量上的增加。因而，朊病毒蛋白的检测与加入的三乙烯四胺的量成比例。这些结果确认在测试条件下TET对PrP产生与链霉素相同的效果，即PrP的交联与TET的剂量成比例，体现为已经在丙烯酰胺凝胶中迁移的带的表观分子量的增加。
5.使用双-3-氨基丙胺检测PrPsc该分子是具有3个铵官能团的分子。
重复在上面第3点中描述的过程，所不同的是将渐增量的双-3-氨基丙胺(130、260、520、780和1040μg)加入至恒定体积(5μl)的在上面第1点中制备的样品中的PrPsc，并将该混合物在室温下孵育30分钟。
结果在图6中显示，给出沉淀颗粒上清液迁移后获得的电泳凝胶的图示，并且其中不同的泳道1-7对应于下表4中给出的处理条件，有或没有双-3-氨基丙胺。
表4
图6中指出的结果显示通过加入130、260、520、780和1040μg引起的介质中双-3-氨基丙胺的量的增加导致了3个朊病毒蛋白带较于无该分子的对照在表观分子量上的增加。在这些条件下，朊病毒蛋白在前面几点中提到的离心条件下沉淀，这也确证了与通过链霉素产生的那些效果相似的效果。
6.结论结果显示加入至介质中的测试分子诱导了PrP的交联，该交联使得用简单的离心能使其完全沉淀。
因此而获得的聚集体可以使得能根据本发明方法检测PrP，如果合适，在与不同于蛋白质配体的配体反应后进行检测。
实施例9通过用杯芳烃C6S和用链霉素处理样品，用蛋白印迹法检测牛脑中的PrPres使用的样品对应于源于通过常规的参照方法，包括通过蛋白印迹法搜索脑组织中的PrPres而确认患有朊病毒病的阳性牛属动物的脑样品。
首先将器官在5％(w/v)葡萄糖溶液中匀浆化以获得10％的悬液。将1μl 0.1M的杯芳烃C6S溶液加入至100μl上面描述的匀浆溶液，并随后搅动该混合物并在37℃下孵育1小时。
然后加入7μl 2mg/l的蛋白酶K(PK)溶液并搅动该混合物，并随后在37℃下孵育30分钟。
加入20μl含有渐增浓度的硫酸链霉素(5％、10％和20％)的溶液，并搅拌混合物，然后在37℃下再孵育1小时。在加入100μl变性Laemmli缓冲液后，将混合物在100℃下加热5分钟并在12 000rpm下离心5分钟。去掉上清液并回收沉淀颗粒。加入50μl 8M脲和Laemmli缓冲液的50％v/v溶液。
用力搅动后，将混合物在100℃下加热5分钟并在12000rpm下离心5分钟，并且随后回收上清液以便在如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685描述的SDS-PAGE上迁移。迁移后，将蛋白通过电泳转移至硝酸纤维素膜上并与识别由氨基酸126-160组成的特异性表位的单克隆抗体(Spi-Bio，法国)在环境温度下进行免疫印迹60分钟。二抗(1/5000)是针对小鼠免疫球蛋白重链和轻链、结合至辣根过氧化物酶上的山羊抗体(IgG H+L)。然后洗涤该印迹并且通过在胶片上(Biomex light，Kodak)使用ECL试剂盒(Amersham)或用super SignalUltra(Pierce)化学发光并在Fluor S.Multimager(BioRad)上显影检测信号。
结果在图7中给出，其中泳道1-3对应于没有用杯芳烃和链霉素处理的对照样品，泳道4-6对应于单独用杯芳烃处理的样品(根据上面的步骤处理，但没有链霉素处理步骤)以及泳道7-15对应于用杯芳烃处理并然后用比例为5％(泳道7-9)、10％(泳道10-12)和20％(泳道13-15)的链霉素处理的样品。
结果证明，通过一起使用杯芳烃和链霉素，PrPres的检测得以提高，并且本方法的灵敏性随着使用的链霉素的增加得以增加。
实施例10通过用肝素和用链霉素处理样品，用蛋白印迹法检测生理液体中的PrPres1.样品1.1用于产生阳性和阴性标准的脾提取物的制备脾提取物从来自死于新突变体类型的克雅氏病的患者和来自不患有克雅氏病(CJD)的患者的脾尸检样品而制备。
首先将该脾样品在裂解缓冲液(0.5％NP-40(Nonidet P-40)+0.5％DOC(去氧胆酸钠))中匀浆化以获得10％的悬液。
然后将因而获得的匀浆在500g下离心5分钟以除去细胞碎片。保存上清液用于血液样品的加载。
1.2血液样品的处理一组多个血样得以制备，所述的血液取自不患有克雅氏病的患者(正常供体)，并让其与糖胺聚糖接触，在本情况下糖胺聚糖为锂盐形式的肝素。
1.3用阳性和阴性标准加载的样品的产生和处理1.3.1加载将该组用肝素预处理过的血液分配为多个等分样品以用于根据下表5说明的量用不同浓度的CJD(1％、5％和10％)(v/v)阳性或阴性的脾匀浆加载每个等分样品表5
1.3.2用蛋白酶K消化加载后，根据0-300μg/ml的终浓度(0-50-100-200和300μg/ml，于250μl样品中)将样品用蛋白酶K(PK)消化。搅动后，将样品在孵育器中在37℃下孵育30分钟。
1.3.3用链霉素孵育然后将25μl 1g/ml(在蒸馏水中)的链霉素(Gibco)加入至混合物(200mg/ml终浓度)中，并然后用涡旋搅动器匀化后，将样品在37℃下于孵育器中孵育60分钟。
1.3.4蛋白印迹的准备孵育结束时，将样品在15000rpm下离心10分钟并移除上清液。
将沉淀颗粒再溶解于50μl SDS变性缓冲液中，并在100℃下加热10分钟后，将样品再次在12 000rpm下离心5分钟。
取上清液用于蛋白印迹分析。
2.根据蛋白印迹技术检测加载的血中的PrPres2.1电泳迁移和转移将15μl每种上清液上样至12％的bistrisacrylamide凝胶(NuPage，Invitrogen)上。将迁移在200伏特下进行45分钟并然后将蛋白转移至PVDF薄膜上，所述的该膜已经用半干式电泳系统(石墨电极)在21伏特、110毫安和2瓦特下再水化1小时。
2.2免疫显影然后根据以下步骤处理该膜-在PBS-0.05％吐温(PBST)+5％牛奶中饱和该膜-在+(2-8)℃下孵育过夜-在PBST中冲洗该膜-加入一抗3F4(Proteogenix，9620.103)，以PBST中的0.2μg/ml使用-环境温度(AT)下孵育1小时-在PBST中洗涤-加入二抗结合过氧化物酶的抗-小鼠抗体(Jackson，115-035-062)在PBST中稀释至1/20000使用-在环境温度下孵育30分钟-在PBST中洗涤-在PBS，pH7.2中洗涤-用放射自显影底物(Super Signal，Pierce)浸渍。
-照相显相3.结果结果在图8-10中给出，图8对应于蛋白印迹法后用1％的CJD+或CJD-的脾匀浆加载的正常样品迁移后获得的电泳凝胶(图8B)的图示(图8A)，图9对应于蛋白印迹法后用5％的CJD+或CJD-的脾匀浆加载的正常样品迁移后获得的电泳凝胶(图9B)的图示(图9A)，以及图10对应于蛋白印迹法后用10％的CJD+或CJD-的脾匀浆加载的正常样品迁移后获得的电泳凝胶(图10B)的图示(图10A)。
在这些凝胶上，在泳道1-5和泳道8-12中的样品具有在下表6中指出的性质，泳道6对应于分子量标记泳道以及泳道7对应于阳性对照样品，所述的该阳性对照样品根据常规用于诊断CJD的参照技术(Madec等，2000，Microbiol.Pathogenesis，28353-362)制备，从来自死于克雅氏病患者的脑提取物获得。
表6
结果证明了用CJD阳性脾匀浆加载的血液样品中的蛋白酶K-抗性带，无论加载密度。事实上，无论用于阳性样品的蛋白酶K的浓度如何，该带保持可见，而当用于阴性样品(用CJD(-)脾加载)的PK的浓度高于100μg/ml时该带消失。
因此，联合使用肝素和链霉素的测试证实了血液样品中的淋巴源(脾)PrPres的检测的灵敏性和特异性。
这与其中进行试验以检测受病原朊病毒(PrPsc)感染个体的血液中的PrPres的病理生理学情形很好地符合，其中所述的血液取自疾病的神经侵染阶段和/或第一次临床表现前。
这就是筛选来自作为正常携带者和/或处于亚临床阶段的受感染个体的血液供体，发现其在公共健康中的用途的内容。
权利要求
1.用于检测可能含有PrP的人或动物源生物样品中的所述PrP的方法，所述的方法特征在于它使用具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子和选自大环配体和糖胺聚糖的不同于蛋白质配体的配体。
2.如权利要求1所述的用于检测PrP的方法，所述的方法特征在于在加入不同于蛋白质配体的配体之前，将所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子加入至所述的生物样品中以便沉淀PrP。
3.如权利要求1或2中所述的检测PrP的方法，其中所述的方法的特征在于其包含将蛋白酶K加入至样品中的额外步骤。
4.如权利要求1-3任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于其包含以下步骤a)将蛋白酶K加入至所述的样品中使得消化PrPc，b)向因而获得的混合物中加入所述的具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子使得获得PrP聚集体，c)加入不同于蛋白质配体的配体，并d)显示PrPres的存在。
5.如权利要求1-4任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于其包含至少一种以下额外步骤i)和ii)i)将PrP聚集体从反应混合物分离，并ii)变性PrP聚集体，如果合适，这些步骤包含于步骤b)和步骤c)之间。
6.如权利要求1-5任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于，如果合适，在步骤d)中加入用于PrP-特异性结合伴侣和PrP之间的免疫反应的PrP-特异性结合伴侣。
7.如权利要求1-6任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于将不同于蛋白质配体的配体结合至固体支持物。
8.如权利要求1-7任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子是具有至少两个胍和/或铵官能团的分子，优选链霉素，更优选以盐的形式。
9.如权利要求1-8任意一项所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于不同于蛋白质配体的配体是大环配体。
10.如权利要求9所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于大环配体选自metacyclophane，优选选自杯芳烃。
11.如权利要求10所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于大环配体相应于下面的通式(I) 其中R1代表氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，R是按如下定义，R2代表氢原子或R、COR、Pol或CH2Pol基团，其中Pol代表磷酸基、硫酸基、胺基、铵基或羧酸基，并且R是如下定义，R3代表氢原子、羟基、OR基团或OCOR基团，其中R是按如下定义，R4代表氢原子、羟基、OR基团、OCH2R基团或OCOR基团，其中R是如下定义，Y是碳、氮或硫原子，R5和R6，每个独立地为缺失或代表氢原子、CH2基团或如下定义的R基团，或者R5和R6同时代表氧或硫原子，X代表CH2基团或氧原子或硫原子，m代表等于0或1的整数，R代表氢原子或饱和的或非饱和的、有支链的或无支链的、环状的或非环状的烃链，所述的该烃链可能为卤素基团取代或不受其取代，并且所述的链带有极性或非极性官能团。n是在3和15之间的整数，取代基R1至R5、R、X和Y以及整数m可以根据单元而在性质上不同。
12.如权利要求11所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于大环配体相应于下面的通式(Ia) 其中n是在4和8之间的整数，每个R2基团，独立地是硫酸基团或磷酸基团。R7代表(CH2)t-(CO)s-(NH2)基团或(CH2)t-COOH基团，其中t是0到6之间的整数以及s是0到6之间的整数。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的方法特征在于所述的配体是式(Ia)的杯芳烃，其中两个R2基团每个是硫酸基团，n是4、6或8，以及R7是氢原子、-CH2COOH基团、-CH2CONH2基团或-CH2CH2NH2基团。
14.如权利要求10所述的用于检测PrP的方法，其中所述的方法特征在于大环配体相应于通式(Ia)，其中n＝6、X＝Y ＝硫酸以及R7是-CH2CH2NH2。
15.用于检测PrP，特别是PrPsc的方法，其中所述的方法特征在于其包含将源于或获自动物或人生物体的生物样品与非抗生素的、具有至少两个胍和/或铵官能团的分子接触的步骤。
16.用于检测PrP的诊断试剂盒，其中所述的试剂盒特征在于其包含选自大环配体和糖胺聚糖的不同于蛋白质配体的配体和具有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子。
17.如权利要求16所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒特征在于所述的不同于蛋白质配体的配体结合至固体支持物上。
全文摘要
本发明涉及用于检测可能含有PrP的生物学人或动物样品中的所述PrP的方法。本发明方法特征在于其使用含有至少一个正电荷和/或至少一个糖苷键的分子和选自大环配体和糖胺聚糖的不同于蛋白质配体的配体。
文档编号G01N33/68GK1910290SQ200580002815
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月19日 优先权日2004年1月20日
发明者A·本辛克－利尼尔, A·W·科尔曼, E·达席尔瓦, M·迪潘, E·勒克莱尔, A·马丁, A·穆萨, H·佩罗, F·龙佐 申请人:拜奥默里克斯公司, 克劳德伯纳德里昂大学, 国家科学研究中心, 法国食品卫生安全局