专利名称：一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法
技术领域：
本发明涉及内毒素的检测，特别提供了一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法。
背景技术：
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有不同生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)。内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。细菌内毒素的检测方法有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的原理，定性或定量检测药品或机体体液中细菌内毒素感染程度的一种体外检测方法。具体作法又分为凝胶法和动态比浊定量法。对于动态比浊定量法而言，是否能够通过标准曲线来计算样品中内毒素浓度，以提高测定结果的准确性，给出一个合理的判断标准是非常必要的。
发明内容
；本发明的目的在于提供了一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，以判断样品中内毒素是否可以通过标准曲线进行定量，提供误差范围，进而为更准确的定量测定内毒素提供依据。
具体地，本发明提供了一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于
——将内毒素标准品和待测样品做系列稀释；——将上述经过系列稀释的内毒素标准品和待测样品分别与鲎试剂反应，在内毒素测定仪上测得浊度值达到一预设浊度时的特征反应时间，其中鲎试剂灵敏度范围为0.03-0.5EU/ml；——将所获得的系列稀释内毒素标准品和待测样品的特征反应时间的对数与稀释浓度的对数作曲线，得到双对数形式的标准曲线和样品稀释曲线；并进而得到标准曲线的斜率bs和样品稀释曲线的斜率b；——将标准曲线的斜率bs和样品稀释曲线斜率b二者比值b/bs的大小作为能否进行定量测定的判断依据，要求b/bs在133-80％之间。
本发明定量测定样品中内毒素浓度的判断方法中，当b/bs为133-80％之间时，内毒素浓度差异在16倍范围内，测定误差在50-200％之间。
本发明定量测定样品中内毒素浓度的判断方法中，当b/bs为111-91％之间时，内毒素浓度差异在1024倍范围内，测定误差在50-200％之间。
本发明定量测定样品中内毒素浓度的判断方法中，当b/bs为104-97％之间时，内毒素浓度差异在256倍范围内，测定误差在80-120％之间。
本发明定量测定样品中内毒素浓度的判断方法中，所述预设浊度值为0.02。
动态比浊法的原理是，在内毒素与鲎试剂反应过程中，采用专用仪器检测记录其浊度变化，预设一个浊度值0.02，当浊度值变化到该预设值0.02时所需的时间作为特征反应时间t0.02，该特征反应时间的对数与内毒素浓度C的对数呈线性关系，即1g(t0.02)＝a+b 1g(C)。当内毒素最高浓度为C0，稀释倍数为D时，则C＝C0/D，1g(t0.02)＝a+1g(C0)+b 1g(1/D)，说明标准曲线的斜率应与标准曲线斜率相同才可以定量，实际测定时肯定有差异。
对内毒素标准品工作液而言，在不同稀释倍数Ds1、Ds2下测定，分别得到相应的特征反应时间(t0.02)1(t0.02)2则1g(t0.02)1/(t0.02)2＝bs 1g(Ds2/Ds1)；在相同的(t0.02)1与(t0.02)2范围内，对样品而言，稀释倍数为D1、D2，则1g(t0.02)1/(t0.02)2＝b 1g(D2/D1)；显然，b/bs＝1g(Ds1/Ds2)/1g(D1/D2)，设D1/D2＝α*(Ds1/Ds2)，或α＝(D1/D2)/(Ds1/Ds2)，α为样品稀释倍数之比与工作品稀释倍数之比的比值，或为样品浓度之比与内毒素标准品工作液浓度之比的比值，即测定误差，理想状态下应该为100％。
则b/bs＝〔1g(Ds1/Ds2)〕/〔1g(α)+1g(Ds1/Ds2)〕或1g(α)＝〔1g(Ds1/Ds2)〕〔(1/(b/bs))-1〕b/bs是样品的稀释曲线斜率与标准曲线斜率的比值，它与Ds1/Ds2比值、测定误差α有关。在一定的测定范围内，b/bs值越接近100％，则测定误差α越接近100％；控制了b/bs值，就可以控制测定误差。
本发明的发明人正是根据上述原理，提出了定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，定量给出了通过标准曲线来计算样品中内毒素浓度的试验误差，也可以与内毒素测定仪、动态比浊定量法配合使用，判断定量测定样品内毒素浓度的试验误差，从而提高了测定结果的准确性。
具体实施例方式实施例1取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉，加入0.5ml无热源水溶解，得鲎试剂溶液；取160EU内毒素标准品工作液，按稀释度4等比稀释至1024倍，得到不同浓度的内毒素，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，混合后插入内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，检测时间为60分钟。反应结束后，得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与内毒素浓度的对数作标准曲线，斜率bs为-0.200；将t0.02的对数与稀释倍数倒数的对数做标准稀释曲线，斜率为-0.200，与标准曲线斜率bs相同。
取内毒素标准品工作液样品1，按稀释度4等比稀释至1024倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml。鲎试剂溶液，反应步骤同上，得到各自特征反应时间t0.02。将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品1的稀释曲线，斜率b为-0.222，b/bs＝111％，依据标准曲线计算得到的样品1最高、最低浓度之比为512倍，实际稀释倍数为1024倍，测定误差为50％。
取含内毒素的水样品2，按稀释度4等比稀释至1024倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，反应步骤同上，得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品2的稀释曲线，斜率b为-0.182，b/bs＝91％，依据标准曲线计算得到的样品2最高、最低浓度之比为2048倍，实际稀释倍数为1024倍，测定误差为200％。
实施例2取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉，加入0.5ml无热源水溶解，得鲎试剂溶液；取160EU内毒素标准品工作液，按稀释度2等比稀释至16倍，得到不同浓度的内毒素，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，混合后插入内毒素测定仪检测孔内，反应温度为36.7℃，检测时间为60分钟。反应结束后，得到各自特征反应时间t0.02，将0.02的对数与内毒素浓度的对数作标准曲线，斜率bs为-0.200，将t0.02的对数与稀释倍数倒数的对数做标准稀释曲线，斜率为-0.200，与标准曲线斜率bs相同。
取含内毒素的水样品3，按稀释度2等比稀释至16倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，反应步骤同上，得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品3的稀释曲线，斜率b为-0.266，b/bs＝133％依据标准曲线计算得到的样品3最高、最低浓度之比为8倍，实际稀释倍数为16倍，测定误差为50％。
取内毒素标准品工作液样品4按稀释度2等比稀释至16倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，反应步骤同上。得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品4的稀释曲线，斜率b为-0.160，b/bs＝80％，依据标准曲线计算得到的样品4最高、最低浓度之比为32倍，实际稀释倍数为16倍，测定误差为200％。
实施例3取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉，加入0.5ml无热源水溶解，得鲎试剂溶液；取20EU内毒素标准品工作液，按稀释度4等比稀释至256倍，得到不同浓度的内毒素，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，混合后插入内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，检测时间为60分钟。反应结束后，得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与内毒素浓度的对数作标准曲线，斜率bs为-0.170；将t0.02的对数与稀释倍数倒数的对数做标准稀释曲线，斜率为0.170，与标准曲线斜率bs相同。
取内毒素标准品工作液样品5按稀释度4等比稀释至256倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，反应步骤同上。得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品5的稀释曲线，斜率b为-0.176，b/bs＝104％依据标准曲线计算得到的样品5最高、最低浓度之比为204.8倍，实际稀释倍数为256倍，测定误差为80％。
取内毒素标准品工作液样品6，按稀释度4等比稀释至256倍，得到不同浓度的样品，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，反应步骤同上。得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与相应的稀释倍数倒数的对数作样品6的稀释曲线，斜率b为-0.165，b/bs＝97％依据标准曲线计算得到的样品6最高、最低浓度之比为307.2倍，实际稀释倍数为256倍，测定误差为120％。
实施例4取灵敏度为0.5EU/ml和0.03EU/ml标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉，加入0.5ml无热源水溶解，得不同灵敏度的鲎试剂；取200EU内毒素标准品工作液，按稀释度4等比稀释至1024倍，得到不同浓度的内毒素，各取0.2ml于7mm内径平底试管中，分别加入0.1ml不同灵敏度的鲎试剂，混合后插入内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.3℃，检测时间为60分钟。反应结束后，得到各自特征反应时间t0.02，将t0.02的对数与内毒素浓度的对数作标准曲线，0.5EU/ml灵敏度鲎试剂的斜率bs为-0.2828；0.03EU/ml灵敏度鲎试剂的斜率bs为-0.2898。
比较例使用常规内毒素检查法进行内毒素限量检查，需要人工记录反应时间，人工目测判断结果，单个人不能完成大量样品检测。
本发明利用仪器本身的特点，自动记录多个实验样品的特征反应时间，再计算样品稀释曲线斜率b与标准曲线的斜率bs的比值，实验结果客观，误差范围可控制，工作效率高。
权利要求
1.一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于——将内毒素标准品和待测样品做系列稀释；——将上述经过系列稀释的内毒素标准品和待测样品分别与鲎试剂反应，在内毒素测定仪上测得浊度值达到一预设浊度时的特征反应时间，其中鲎试剂灵敏度范围为0.03-0.5EU/ml；——将所获得的系列稀释内毒素标准品和待测样品的特征反应时间的对数与稀释浓度的对数作曲线，得到双对数形式的标准曲线和样品稀释曲线；并进而得到标准曲线的斜率bs和样品稀释曲线的斜率b；——将标准曲线的斜率bs和样品稀释曲线斜率b二者比值b/bs的大小作为能否进行定量测定的判断依据，要求b/bs在133-80％之间。
2.按照权利要求1所述定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于当b/bs为133-80％之间时，内毒素浓度差异在16倍范围内，测定误差在50-200％之间。
3.按照权利要求1所述定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于当b/bs为111-91％之间时，内毒素浓度差异在1024倍范围内，测定误差在50-200％之间。
4.按照权利要求1所述定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于当b/bs为104-97％之间时，内毒素浓度差异在256倍范围内，测定误差在80-120％之间。
5.按照权利要求1所述定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于所述预设浊度值为0.02。
6.按照权利要求1所述定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于检测时，反应温度为37.0±0.3℃，检测时间为60分钟。
全文摘要
一种定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，其特征在于将内毒素标准品和待测样品做系列稀释；与鲎试剂反应，测得浊度值达到一预设浊度时的特征反应时间；将特征反应时间的对数与稀释浓度的对数作曲线，并进而得到标准曲线的斜率bs和样品稀释曲线的斜率b；将二者比值b/bs的大小作为能否进行定量测定的判断依据，要求b/bs在133－80％之间。本发明提出了定量测定样品中内毒素浓度的判断方法，定量给出了通过标准曲线来计算样品中内毒素浓度的试验误差，也可以与内毒素测定仪、动态比浊定量法配合使用，判断定量测定样品内毒素浓度的试验误差，从而提高了测定结果的准确性。
文档编号G01N21/25GK1815235SQ20051004584
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月5日 优先权日2005年2月5日
发明者李京华, 邵英光, 岳丽娜, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所