肌－肌醇单磷酸酶的功能表征的利记博彩app

专利名称：肌－肌醇单磷酸酶的功能表征的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及肌-肌醇单磷酸酶2(IMPA2)的功能表征，IMPA2是在磷脂酰肌醇信号路径中起作用的酶之一。特别地，本发明提供证据表明IMPA2与抑郁和焦虑引起的症状相关。
背景技术：
在磷脂酰肌醇信号系统中，肌-肌醇单磷酸酶(IMPA)具有重要作用，其催化各种肌-肌醇单磷酸酯发生脱磷酸作用，释放肌-肌醇(Berridge和Irvine，1989)。生物化学试验表明锂对IMPA酶起无竞争性的抑制作用，可能是通过结合并阻断该酶的金属结合位点。IMPA的还原活性会导致细胞内游离的肌-肌醇损耗，肌-肌醇用于再合成信号前体肌醇磷脂(Berridge等人，1989)。数十年来，在狂躁抑郁症(两极的)的治疗中，锂被用作稳定情绪的试剂。但是，其稳定情绪的分子机制还未被确定。锂对IMPA活性的抑制作用及其抗两极的作用出现在同一浓度范围内，并且对于锂的稳定情绪的作用来说，这种生物化学作用仍然是令人好奇的假设。
已经有人提出，在编码肌-肌醇单磷酸酶的基因中发生的改变(例如功能缺失或者产生功能突变)可能暗示在两极紊乱中，神经元活性发生扰乱，或者解释所观察到的锂治疗效率的变化(Steen等人，1996)。迄今，两种人基因IMPA1和IMPA2已经被克隆，并被预测编码IMPA酶(McAllister等人，1992；Sjoholt等人，2000)。有趣的是，人IMPA2基因位于染色体18p11.2上，在数个连接试验中，该区域被认为是两极紊乱的易感基因座。在B原淋巴细胞系的试验中，提供了IMPA2可能与两极相关的另一个证据，该细胞系来自I型两极情感紊乱(BD-I)患者。已经发现，与健康雄性受试者相比，这些来自雄性BD-1患者的细胞具有显著较低的IMPA2 mRNA水平，并且其细胞内的基线钙水平升高了(Yoon等人，2001)。
在探究该酶作为锂在狂躁抑郁症疾病中起稳定情绪作用的靶点的可能作用中，采用了大量的传统行为测试，对IMPA2敲除小鼠进行了表型分型。
本发明的结果表明，IMPA2敲除小鼠较少倾向于焦虑和抑郁引起的症状，并且指向了IMPA2在情感紊乱中的可能作用，特别是指向在存在于严重的情绪和焦虑紊乱中的神经可塑性和细胞恢复力下降中所起的作用。
通过本发明将IMPA2功能性表征为与神经元的可塑性相关的基因，提供了鉴定可用于神经元细胞性能降低的患者的化合物的手段，以长期改变IMPA2的循环量(circuitery)，并功能性地对新的输入响应(学习)，该化合物还可以用于治疗神经组织性能降低的患者，以通过再组织其功能来弥补由退行性紊乱引起的组织部分破坏或者功能丧失，从损伤中恢复。
发明概述第一个方面，本发明提供IMPA2酶在鉴定抗焦虑或抗抑郁的化合物的分析中的用途，其中所示抗焦虑或抗抑郁化合物能够增强神经元的可塑性。因此，在还有一个方面，本发明提供IMPA2酶在鉴定能够增强哺乳动物的CNS中的神经元可塑性的化合物的分析中的用途。
因此，本发明的一个目的是提供用于鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦虑或抗抑郁化合物能够增强神经元的可塑性，所述方法包括步骤a)提供一种包含IAMPA2蛋白的化合物；b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物为抗焦虑或抗抑郁化合物。
第二个方面，本发明提供一种用于确定一种化合物是否能够增强神经元可塑性的方法，所述方法包括步骤a)提供一种包含IAMPA2蛋白的化合物；b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物为增强神经元可塑性的化合物。
第三个方面，本发明提供按照本发明的分析所鉴定的化合物的用途，用于制备治疗焦虑的药物或者用于制备提高神经元可塑性的药物，特别是用于制备增强记忆力或治疗记忆功能障碍以及治疗神经元损伤的药物，神经元损伤是如下种类的中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤，包括(但是不限于)由攻击、事故引起的损伤、肿瘤(例如影响大脑的大脑肿瘤或非脑部肿瘤，例如侵犯大脑的头盖骨的骨瘤)或者去除肿瘤或者治疗癫痫症的手术；多发性硬化症；和影响皮层的神经退行性疾病，例如老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺脑白质营养不良(cerebellar-spinal adrenoleucodystrophy)、皮克病或威尔逊病。
第四个方面，本发明提供治疗与神经元适应性反应降低相关的症状的方法，例如治疗记忆功能障碍，以及治疗影响皮层的神经退行性疾病，例如老年痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺营养失调白斑病、皮克病或威尔逊病，包括将有效量的IMPA2抑制剂施用给需要该治疗的受试者的步骤。
本发明的另一个目的是提供治疗神经学上的症状的方法，包括增强神经元可塑性的治疗，例如增强记忆力和学习能力，以及治疗如下种类的神经元损伤中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤，包括(但是不限于)由攻击、事故引起的损伤、肿瘤(例如影响大脑的大脑肿瘤或非脑部肿瘤，例如侵犯大脑的头盖骨的骨瘤)或者去除肿瘤或者治疗癫痫症的手术；多发性硬化；和影响皮层的神经退行性疾病，例如老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺脑白质营养不良皮克病或威尔逊病，包括将有效量的IMPA2抑制剂施用给需要该治疗的受试者的步骤。
最后一个方面，本发明提供IMPA2敲除动物作为研究增强神经元可塑性的作用的模型的用途。特别是在动物模型中，研究增强对应激的适应性反应的作用。在其他用途中，这种转基因动物可以被销售给研究人员。
在下文中，将更加详细地讨论本发明的这些和其他方面。
附图简介附

图1载体VICTR48的示意图，该载体用于从OST203987产生IMPA2敲除。
附图2不同小鼠组织样本中的IMPA1和IMPA2的表达水平。在归一化为小鼠的β-肌动蛋白后，在不同小鼠组织样本中的表达水平被表示为相对水平。
附图3不同小鼠组织样本中的IMPA1和IMPA2的表达水平。在不同小鼠的组织样本中的表达水平被表示为平均循环阈(CT)值。
附图4在升高的零迷宫(Elevated Zero Maze)测试中监测的不同参数的结果，即总移动距离、在开放臂(open arm)中的相对持续时间和在开放臂中的相对距离。
附图5在Porsolt强迫游泳测试的第一个段时间内监测的不同参数的结果，即在前180秒中的相对静止不动的持续时间、在最后180秒中的相对静止不动的持续时间和在整个测试过程中静止不动的相对持续时间。
附图6在Porsolt强迫游泳测试的第二个时段内的结果。记录了相同的参数。
附图7在开阔场地测试(Open Field Test)中监测的不同参数的结果，即在中央花费的时间、在中央的移动距离、总的移动距离、移动次数、移动持续的时间、直立活动(rearing)次数和直立活动的持续时间。
附图8在非受胁迫和受胁迫的Impa2 KO小鼠和WT同窝小鼠中，MIP合成酶的表达水平。发现基因型和胁迫对表达水平具有显著的影响。表达水平在被归一化为小鼠的β-肌动蛋白后被表示为相对水平。
附图9在非受胁迫和受胁迫的Impa2 KO小鼠和WT同窝小鼠中，BDNF的表达水平。发现了基因型和胁迫对表达水平具有显著的作用。表达水平在被归一化为小鼠的β-肌动蛋白后被表示为相对水平。
通过参考如下的实验性详细描述，将会更好地理解本发明，但是本领域技术人员容易认识到，实验性的详细描述仅仅是示例性地说明在后面的权利要求书中所更加充分地描述的发明。另外，在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开在此通过参考被结合到本申请中，以更加充分地描述与本发明相关的现有技术。
发明详述第一个发方面，本发明提供IMPA2酶在鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中抗焦虑或抗抑郁化合物能够增强神经元的可塑性。接着，在另一个方面，本发明提供IMPA2酶在用于鉴定能够增强哺乳动物的CNS中的神经元的可塑性的化合物的分析中的用途。在此所用的IMPA2蛋白或功能片段是指能够水解肌-肌醇1-磷酸盐的分离蛋白而生成肌醇和无机磷酸盐的分离的蛋白。该蛋白质优选选自i.小鼠IMPA2(SEQ ID No4)、大鼠IMPA2(SEQ ID No6)、人IMPA2(SEQ ID No2)或其功能性片段，或者ii.编码IMPA2蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的全长与人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更加优选至少95％或最优选至少98％序列同一性。
特别是编码所述IMPA2蛋白的分离的多核苷酸在根据本发明的分析中的用途，其中所述IMPA2蛋白优选选自i.编码小鼠(EMBLBC011093-SFQ ID No3)、大鼠(EMBLAY160191-SEQ ID No5)或人(EMBLBC011093-SEQ ID No1)的IMPA2酶的多核苷酸；或ii.编码蛋白IMPA2的多核苷酸序列，其中所述氨基酸序列的全长与编码人IMPA2蛋白的多核苷酸(SEQ ID No1)具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更加优选至少95％或最优选至少98％序列同一性。
如在此所用，“神经元的可塑性”、“可塑性”、“神经可塑性”等是指神经系统改变和/或发展神经元之间的连接以改变大脑或脊髓的功能的能力，通常对感觉或动作刺激或损害作出反应。该术语包括神经形成，在结构上存在但无活性的突触的活化，突触的强化和消弱、突触的生成和破坏。
存在许多神经学症状，对这些症状中进行增强神经元可塑性的治疗正在研究中。例如，为了提高记忆力或治疗记忆功能障碍，以及治疗如下种类的神经元损害中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤，包括(但是不限于)由攻击、事故引起的损伤、肿瘤(例如影响大脑的大脑肿瘤或非脑部肿瘤，例如侵犯大脑的头盖骨的骨瘤)或者去除肿瘤或者治疗癫痫症的手术；多发性硬化；和影响皮层的神经退行性疾病，例如老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺脑白质营养不良(cerebellar-spinaladrenoleucodystrophy)、皮克病或威尔逊病。
因此，本发明的目的是提供用于鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦虑或抗抑郁化合物能够增强神经元的可塑性，所述方法包括步骤a)提供包含IMPA2蛋白的组合物；b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物为抗焦虑或抗抑郁化合物。
在另一个方面，本发明提供一种用于确定一种化合物是否能够增强神经元可塑性的方法，所述方法包括步骤a)提供一种包含IAMPA2蛋白的化合物；b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物为增强神经元可塑性的化合物。
包含IMPA2蛋白的组合物可以是表达按照本发明的IMPA2蛋白的细胞提取物、全细胞或者生物体。在特定的实施方案中，包含IMPA2蛋白的组合物由表达IMPA2的全细胞组成，更加特别是由表达IMPA2的CHO细胞组成。
典型地，进行从约1分钟到约24小时的接触，优选从约2分钟到约1小时的接触，更加优选接触约1小时。
在这些分析中，通过测量水解肌-肌醇1-磷酸盐生成肌醇和无机磷酸盐来评价IMPA2蛋白活性，特别是通过测量放射标记的肌醇形式的肌-肌醇单磷酸盐产物或者放射标记的32Pi形式的无机磷酸盐(Pi)的积累或者在比色分析中来评价IMPA2蛋白活性。例如，可以如Ragan(1988)Biochem.J.249143-148，或者Vadnal(1995)Neuropsychopharmacol.12277-285所述，进行基于比色手段的Pi释放分析来测量Pi浓度随时间的变化。
如上文的Vadnal(1995)中所述，反应混合物含有0.05ml的120mM Tris-HCI，pH 7.8；0.05ml的18mM或3mM氯化镁；0.05ml的4.2mM D-肌-肌醇1-磷酸盐，单独的0.125ml水或者具有阳性对照或者推定的调节剂测试化合物或组合物。各种含量的已知肌-肌醇单磷酸酶抑制剂(拮抗剂)作为对照，例如锂、卡巴咪嗪和/或丙戊酸。加入0.025ml的肌-肌醇单磷酸酶(例如人IMPA2)溶液，将反应混合物在37℃下温育约15分钟到1小时。加入0.05ml的20％三氯乙酸(TCA)来终止反应。离心上清液，用0.10ml上清液来估计释放的Pi，采用孔雀绿试剂方法，如Eisenberg(1987)Methods Enzymol.141127-143所描述。用Lowry(1951)J.Biol Chem.193265-275的方法来分析蛋白。
通常重复分析三次。可替代地，如上面的Ragan(1988)所述，反应混合物的最终体积为0.300ml，含有0.1mM底物、250mM氯化钾、50mM TrisHCL，pH 8.0，和3mM氯化镁，反应时间为15分钟到1小时。采用Itaya(1966)Clin.Chem.Ac ta 14361-366的方法通过比色测量所释放的Pi(还可以参见Kodaina(1986)″The initialphosphate burst in ATP hydrolysis by myosin and subfragment-1as studied by a modified malachite green method fordetermination of inorganic phosphate，″J Biochem.(东京)991465-1472)。肌-肌醇单磷酸酶的特定活性被表示为每分钟(mU)每毫克蛋白所释放的磷酸根的纳摩尔数。
还可以通过采用例如Atack(1993)J.Neurochem.60652-658；或者Ragan(1988)同上文所述的分析方法，在体外和体内测量底物肌-肌醇单磷酸盐(肌-肌醇I-磷酸盐)的积累，确定本发明的IMPA2蛋白的可能调节物的动力学活性，并进行评价。例如，如Atack(1993)同上文所述，存在推定的肌-肌醇单磷酸酶拮抗剂时，测量在表达IMPA2蛋白的组织培养细胞中的放射标记的肌醇单磷酸盐的积累。如下文所述，通过遗传操作组织培养细胞，表达本发明的IMPA2蛋白或其片段或变体。
例如，如上所述，可以操作CHO细胞来表达数量巨大的异源蛋白。特别地，为了评价推定的拮抗剂或激动剂对体内的肌-肌醇单磷酸酶的作用，首先用3H-肌醇标记CHO细胞。预先标记包括培养细胞，以便在含有放射标记的肌醇(例如，14C-肌醇或3H-肌醇)的培养基中汇合两天。如果采用3H-肌醇，则使用0.5uCi/mI 80Ci/mmol(AmershamInternational)。试验当天，在含有0.5uCi/mI3H-肌醇的Krebs-Henselcit缓冲液中收集细胞，浓度为2×106细胞/ml。
在存在10ul各种浓度的已知酶抑制剂和测试化合物-推定的酶调节物时，将所收集的细胞的等分试样在37℃的摇动水浴中培养1小时。加入300ul的1.0M TCA来终止反应，并离心。用水饱和的二乙醚洗涤500ul上清液。用1M Tris调节pH到约7.0。然后，将上清液加载到Dowex柱中。用5ml水洗涤柱4次，以洗脱3H-肌醇；然后用5ml的25mM甲酸胺洗涤3次，以洗脱β-甘油磷酸。用10ml的200mM磷酸胺洗涤柱，收集3H-肌醇1-单磷酸盐，在闪烁计数器上进行计数。
可替代地，如Ragan(1988)同上文所述，采用14C-肌醇。抑制肌-肌醇单磷酸酶会导致底物肌-肌醇单磷酸盐(肌-肌醇1-磷酸盐)的水平升高，而激活该酶会导致底物水平下降和产物(肌醇和无机磷酸盐)的水平升高。
采用这些分析及其变化形式，可以采用已知方法(例如，Lineweaver-Burke plots，如被Lee(1996)Xenobiotica 268′)1-83)8采用)，可以在有和无测试调节剂(例如，竞争性或非竞争性的拮抗剂)时分析IMPA2酶的动方学；对于酶动力学的讨论通常可以参见例如，Suarez(1997)Proc.Nad.Acad.Sci.USA 947065-7069；Northrop(1997)Bioorg.Med Chem.5641-644)；Sterrer(1997)J.Recept.Signal Transduct.Res.17511-520)。
因此，本发明的目的是提供组织培养细胞如CHO细胞或HEK293细胞在按照本发明的分析中的用途，细胞通常被遗传操作来表达IMPA2。适合实施按照本发明的分析的细胞优选为来源于多细胞生物体的高等真核细胞，有利地为哺乳动物细胞。细胞可以用本领域可获得的任何合适的技术转化。许多技术如磷酸钙沉淀和电穿孔被描述在Sambrook等，(1989)Molecular BiologyA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor中，其在此引入作为参考。
在另一个方面，本发明提供使用按照本发明的分析所确定的化合物的用途，用于制备用于治疗焦虑的药剂或者用于制备提高神经元可塑性的药剂，特别是用于制备增强记忆力或治疗记忆功能障碍，以及治疗神经元损伤的药剂，神经元损伤是如下种类的中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤，包括(但是不限于)由攻击、事故引起的损伤、肿瘤(例如影响大脑的大脑肿瘤或非脑部肿瘤，例如侵犯大脑的头盖骨的骨瘤)或者去除肿瘤或者治疗癫痫症的手术；多发性硬化；和影响皮层的神经退行性疾病，例如老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺营养失调白斑病、皮克病或威尔逊病。
在本领域，用于制备药物组合物的方法和药物载体是已知的，列举在教科书如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Williams & Wilkins，Pensylvania，USA中。
本发明的化合物和组合物可以通过任何合适的路径来施用，本领域技术人员容易为所治疗的症状确定最合适的路径和剂量。剂量可以由从业医师或者兽医来确定，取决于所治疗的症状的状态和性质、所治疗的受试者的年龄和基本健康状况、施用路径和可能已经给予的任何在先治疗。采用本发明的分析被鉴定为抗焦虑的化合物或者神经可塑性增强化合物的化合物可选择地与一种或多种药学活性试剂一起施用，该活性试剂适合治疗症状，即化合物可以与一种或多种这种试剂一起给予，或者在一种或多种试剂之前或之后给予。例如，当该症状涉及阿尔茨海默病时，该化合物与另一种试剂治疗一起使用，试剂例如是乙酰胆碱脂酶活性位点抑制剂，例如胆碱酯酶抑制剂、加兰他敏(galantamine)或tracine。
载体或稀释剂和其他的赋形剂将取决于施用路径，本领域技术人员容易确定用于各种特定情况的最适合的剂型。本发明的化合物可以经口腔、体表或胃肠外，以含有常规的药学上可接受的载体、佐剂和运载体的剂量单位制剂形式施用。在此所用的胃肠外包括皮下的、静脉内的、肌肉内的、膜内的、头颅内的注射或灌注技术。特别感兴趣的是，穿过血脑屏障将化合物施用到CNS中。优选的施用路径是直接施用到CNS中，例如通过插管(canulla)灌注或注射。这种施用将直接进入到损伤部位，进入邻近组织或者进入脑脊髓液。
本发明包括用于改善疾病的各种药物组合物。使用载体、赋形剂和添加剂或者佐剂，将本发明的组合物和任选的一种或多种其他药学上有活性的试剂，或者本发明的化合物和一种或多种其他药学上有活性的试剂的组合制备成适合施用给受试者的形式，来制备按照本发明的一个实施方案的药物组合物。
经常使用的载体和佐剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石粉、牛乳蛋白质、白明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、酒精、甘油和多元醇。静脉内运载体包括液体和营养补充物。防腐剂包括抗生素、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其他药学上可接受的载体包括水溶液、无毒性的赋形剂，包括盐水、防腐剂、缓冲液等，如Remington′sPharmaceutical Sciences，第20版。Williams & Wilkins(2000)和The British National Formulary第43版(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of GreatBritain，2002；http//bnf.rhn.net)所描述，其内容在此引入作为参考。药物组合物的pH和各种组成的精确浓度按照本领域的常规技术来调整。参见Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basisfor Therapeutics(第7版，1985)。
优选以剂量单位形式来制备和施用药物组合物。固体剂量单位包括片剂、胶囊和栓剂。对于受试者的治疗，根据化合物的活性、施用方式、紊乱的性质和严重性、受试者的年龄和体重，可以采用不同的日剂量。但是，在特定条件下，较高或较低的日剂量是合适的。日剂量的施用可以通过以单个剂量单位或者数个较小剂量单位的单次施用来进行，或者在特定间隔时间内多次施用细分的剂量。
用于该说明目的，应当清楚理解，措辞“包含(comprising)”是指“包括但是不限于”，而措辞“包含(comprises)”具有相应的含义。
本发明的另一个目的是提供治疗与神经元适应性反应降低相关的症状的方法，例如治疗记忆功能障碍以及治疗影响皮层的神经退行性疾病，例如老年痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺营养失调白斑病、皮克病或威尔逊病的方法，包括将有效量的IMPA2抑制剂施用给需要该治疗的受试者的步骤。
本发明的另一个目的是提供治疗神经学上的症状的方法，包括增强神经元可塑性的治疗，例如增强记忆力和学习能力以及治疗如下种类的神经元损伤中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤，包括(但是不限于)由攻击、事故引起的损伤、肿瘤(例如影响大脑的大脑肿瘤或非脑部肿瘤，例如侵犯大脑的头盖骨的骨瘤)或者去除肿瘤的手术或者治疗癫痫症；多发性硬化；和影响皮层的神经退行性疾病，例如老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺营养失调白斑病、皮克病或威尔逊病，包括将有效量的IMPA2抑制剂施用给需要该治疗的受试者的步骤。
通常，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等，在此用于指作用于受试者、组织或细胞，以获得期望的药学上的和/或生理上的效果。该效果可以是预防性的、完全或部分地预防疾病或其征候或症状和/或是治疗性的、部分或完全地治愈疾病。如在此所用的“治疗”包括任何的治疗或预防脊椎动物、哺乳动物特别是人中的疾病，包括预防疾病在受试者中发生，该受试者易患该疾病但是还未被诊断患有该疾病，抑制该疾病，即阻止疾病发展；或者减轻或改善疾病的作用，即使疾病作用消退。
如在此所用，术语“有效量”是指本发明的化合物的含量，其足以产生期望的治疗性反应，例如预防或治疗疾病，该疾病容易(suspectible to)通过施用包含本发明的化合物作为活性成分的药物组合物来治疗。特定的“治疗有效量”可以由从业医师或兽医确定，必将随着如所治疗的特定症状、受试者的生理条件和临床史、所治疗的动物类型、治疗持续时间、协同治疗(如果有)的性质和所使用的特定剂型的因素而变化。
在此还描述了非人的动物和细胞，其含有至少一种被整合的打靶构建体，该构建体功能性地破坏所述非人的动物或细胞的内源性IMPA2基因的基因座，典型地通过缺失或突变有效地功能性表达IMPA2基因产物所需的遗传元件，例如外显子序列、剪接信号、启动子增强子。在该实施方案中，打靶构建体的一部分整合到内源性IMPA2基因的基因座的基本结构或调控元件中，从而功能性地破坏该元件，产生无效的等位基因。典型地，虽然可以采用其他策略，但是通过将编码可选择的标记的非同源序列(例如neo基因表达盒)整合到IMPA2基因的基本结构和/或调控序列中，通过使打靶构建体的同源夹子(homologyclamp)与内源性IMPA2基因序列发生同源重组，来产生无效的等位基因。
最通常，通过电穿孔或微注射将打靶构建体转移到全能胚胎干(ES)细胞系，例如鼠AB-1或CCE细胞系中。在IMPA2基因的基因座上或侧面，打靶构建体与内源性序列同源重组，功能性地破坏IMPA2基因的至少一个等位基因。典型地，打靶构建体与内源性IMPA2基因座序列同源重组，导致编码和表达可选择标记的非同源序列的整合，例如neo非同源序列通常为阳性选择表达盒的形式。被功能性破坏的等位基因被称作为IMPA2无效的等位基因。在培养基中繁殖细胞，选择具有至少一种IMPA2无效等位基因的ES细胞，该培养基允许优先繁殖表达可选择标记的细胞。通过PCR分析和/或Southern印迹分析，检查所选择的ES细胞，证实存在正确打靶的IMPA2等位基因。繁育与无效等位基因异源的非人动物，生成与所述无效等位基因同源的非人动物，即所谓的“敲除”动物(Donehower等，(1992)Nature 256215；Science2561392，在此引入作为参考)。可替代地，通过在含有高水平选择试剂(例如，G418或潮霉素)的培养基中进行培养，来生产对于无效的等位基因来说是纯合子的ES细胞，该等位基因具有整合的可选择标记。采用PCR分析和/或Southern印迹分析从所选择的ES细胞克隆和/或尾巴活组织检查分离的DNA，来证实正确打靶的无效等位基因的杂合性和/或纯合性。
已经被描述了数种基因打靶技术，包括但是不限于共同电穿孔，“一打即跑(hit-and-run)”，单交换整合和双交换重组(Bradley等，(1992)Bio/Technology 10534)。本发明基本上可以采用本领域知晓的任何IMPA2可用的同源基因打靶策略来实施。打靶构建体的结构取决于所选择的特定打靶技术。例如，用于单交换整合或“一打即跑”的打靶构建体仅需要连接到靶向区域上的单一同源片段，而双交换替换类型的打靶构建体需要两个同源片段，与置换区域的两侧连接。
例如，而不是限制，优选的实施方案是打靶构建体，包括，按顺序(1)具有基本上与内源性IMPA2基因外显子上游(即，在与外显子的翻译阅读框相反方向上)的约3kb内的序列相同的第一个同源片段，(2)替换区，包含驱动neo基因转录的pgk启动子的阳性选择表达盒，(3)具有基本上与所述内源性IMPA2基因外显子下游的约3kb内的序列相同的第二个同源片段，和(4)阴性选择表达盒，包含驱动HSV tk基因转录的HSV启动子。这种打靶构建体适合双交换替换重组，该重组缺失了跨越所述外显子的内源性IMPA2基因座的一部分，并且用具有阳性选择表达盒的置换区来替换它。如果被缺失的外显子对于功能性IMPA2基因产物的表达是必需的，则所生成的外显子缺失的等位基因被功能性地破坏，并且被称作为无效的等位基因。
本发明的打靶构建体包括至少一个IMPA2同源夹子，它以多核苷酸键(即通过磷酸二酯键)的形式连接到靶向区域上。同源夹子具有一条序列，该序列基本上与非人宿主动物的内源性IMPA2基因序列相对应或互补，并且可能包含IMPA2基因两侧的序列。
虽然，在本领域中，最终未确定用于基因打靶的重组同源性的最低或最高的大小界线，一般认为，同源片段的最佳模式在约50kb到数万kb的范围内。因此，打靶构建体通常至少为约50-100个核苷酸，优选至少为约250-500个核苷酸，更加优选至少为约1000-2000个核苷酸，或者更长。构建体同源区(同源片段)通常至少为约50-100个碱基，优选至少为约100-500个碱基，更加优选至少为约750-2000个碱基。一般认为，长度为约7-8kb的同源区是优选的，在一个优选的实施方案中，具有在置换区一侧的侧面的约7kb的第一个同源区和在置换区另一侧的侧面的约1kb的第二个同源区。
根据内源性IMPA2基因靶向序列的序列组成和复杂性，以及本领域提供的教导(Hasty等，(1991)Mol.Cell.Biol.115586；Shulman等，(1990)Mol.Cell.Biol.104466)，从业人员进行判断，会选择同源区的同源(即基本上相同)长度。打靶构建体具有至少一个同源区，该同源区具有与内源性IMPA2基因序列基本上相对应或者基本上互补的序列(例如，外显子序列、增强子、启动子、内含子序列或者在IMPA2基因的约3-20kb内的侧翼序列)。这种靶向转基因同源区作为与基本上相同的内源性IMPA2基因序列同源配对和重组的模板。在打靶构建体中，这种同源区典型地在置换区的侧面，置换区是打靶构建体的一个区域，它将要与被打靶的内源性IMPA2基因序列发生置换(Berinstein等，(1992)Mol.Cell.Biol.12360)。因此，两侧是同源区的打靶构建体的一个区段可以通过双交换同源重组而置换内源性IMPA2基因序列的一个区段。同源区与靶向区以传统的线性多核苷酸键(5′到3′磷酸二酯骨架)方式连接在一起。打靶构建体通常是双链DNA分子，最通常是线性的。
不愿受同源重组或者基因转换的任何特定理论的约束，一般认为，在这种双交换置换重组中，第一个打靶构建体同源区和第一个内源性IMPA2基因序列之间的第一个同源重组(例如，链交换、链配对、链分离、链连接)是通过第二个靶向结构域同源区与第二个内源性IMPA2基因序列之间的第二个同源重组来实现的，从而产生位于两个同源区之间的打靶构建体的一部分，替换了位于第一个和第二个内源性IMPA2基因序列之间的内源性IMPA2基因的部分。因此，同源区通常用于相同方向(即，对于转基因的各个同源区来说，上游方向相同，以避免发生重排)。因此，用双交换置换重组来缺失内源性IMPA2基因的一部分，伴随着将非同源部分(例如，neo基因表达盒)转移到相应的染色体位点上。还可以用双交换重组来将非同源部分(nortion)添加到内源性IMPA2基因中，而不缺失内源性染色体部分。但是，还可以仅用双交换重组来缺失内源性IMPA2基因序列的一部分，而不将非同源的部分转移到内源性IMPA2基因中(参见，Jasin等，(1988)Genes Devel.21353)。非同源部分的上游和/或下游可以是一种基因，该基因提供用于确定双交换重组是否发生；这种基因典型地是HSV tk基因，该基因用于阴性选择。
典型地，本发明的打靶构建体用于功能性地破坏内源性IMPA2基因，包含至少两个通过非同源的序列分开的同源区，非同源序列含有编码可选择标记如neo的表达盒(Smith和Berg(1984)Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.49171；Sedivy和Sharp(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86227；Thomas和Capecchi(1987)op.cit.)。但是，一些本发明的打靶构建体可以仅在非同源序列一侧的侧翼具有同源区。本发明的打靶转基因可以是在本领域被称作为“一打即跑”或者“一进就出”的转基因类型的(Valancius和Smithies(1991)Mol.Cell.Biol.111402；Donehower等，(1992)Nature356215；(1991)J.NIH Res.359；在此引入作为参考)。
阳性选择表达盒编码一种可选择标记，该标记提供用于选择整合了跨越阳性选择表达盒的转基因序列的细胞的手段。阴性选择表达盒编码一种可选择标记，该标记提供用于选择不具有阴性选择表达盒的整合拷贝的细胞的手段。因此，通过将阳性-阴性选择方法结合起来，有可能通过选择阳性标记的存在和阴性标记的缺乏，来选择已经发生了同源置换的重组并且将同源区之间的转基因部分(即置换区)掺入到染色体位置上的细胞。包含在本发明的打靶构建体中的优选的表达盒编码和表达可选择的抗药性标记和/或HSV胸苷激酶。合适的抗药性基因包括，例如gpt(黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)，其可以用霉酚酸进行筛选；neo(新霉素磷酸转移酶)，其可以用G418或潮霉素进行选择；和DFHR(二氢叶酸还原酶)，其可以用氨甲蝶呤选择(Mulligan和Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782072；Southern和Berg(1982)J.Mol.IMPA21.Genet.1327；其在此引入作为参考)。
筛选正确打靶的重组体通常至少采用阳性选择，其中非同源的表达盒编码和表达功能性的蛋白(例如，neo或者gpt)，该蛋白赋予具有内源性整合的表达盒的靶向细胞以一种可选择的表型，因此，通过添加选择试剂(例如，G418或霉酚酸)，这种被打靶的细胞具有超过不具有整合的表达盒的细胞的生长或存活优势。优选地，筛选正确打靶的同源重组体还采用阴性选择，使得淘汰掉仅具有非同源的转基因整合的细胞。典型地，这种阴性选择采用编码单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的表达盒，该基因位于转基因中，使得仅通过非同源重组来整合。这种布置通常通过将HSV tk表达盒(或者其他阴性选择表达盒)连接到引起重组的同源区的末端上来实现，使得同源区的双交换置换重组将阳性选择表达盒转移到染色体位置上，而不会将基因(或者其他阴性选择表达盒)转移到染色体位置上。核苷酸类似物9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]-鸟嘌呤优先对表达HSV tk的细胞产生毒性，它在选择不具有整合HSV tk的表达盒的细胞时被用作阴性选择试剂。FIAU也可以被用作选择试剂来选择缺乏HSV tk的细胞。
为了降低具有不正确整合的打靶构建体序列的细胞的背景，通常采用组合阳性-阴性选择的方案(Mansour等，(1988)op.cit.，在此引入作为参考)。
通常，本发明的打靶构建体优选包括(1)两侧是两个同源区的阳性选择表达盒，这两个同源区与宿主细胞的内源性IMPA2基因序列基本上相同，和(2)末端的阴性选择表达盒。但是，还可以使用仅包括阳性选择表达盒的打靶构建体。典型地，打靶构建体含有阳性选择表达盒，该表达盒包括连接到启动子下游的neo基因(即，在翻译阅读框方向朝向所编码的多肽的羧基末端)，该启动子例如是HSV tk启动子或者pgk启动子。更典型地，打靶构建体还含有阴性选择表达盒，该表达盒包括连接到HSV tk启动子下游的HSV tk基因。
优选地，本发明的打靶构建体具有同源区，该同源区与预先确定的靶点内源性DNA序列高度同源，优选是同基因的(即相同的序列)。通过基因组克隆或者高保真PCR扩增基因组DNA，从非人动物的系中获得同基因的序列或几乎同基因的序列，该非人动物是用于基因打靶程序的ES细胞的来源。
含有打靶构建体的载体典型地在大肠杆菌中生长，然后用标准的分子生物学方法来分离，或者被合成为寡核苷酸。还可以进行不需要原核载体或真核载体的定向打靶灭活。通过任何合适的技术，其中包括微注射、电穿孔、脂转染、生物导弹术、磷酸钙沉淀和病毒载体，将打靶转基因转移到宿主细胞中。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用Polybrene、原生质体融合和其他方法(一般参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其在此引入作为参考)。
因此，本发明的另一个目的是提供IMPA2敲除的动物作为神经可塑性模型的用途，特别是用于研究增强神经元可塑性的作用。特别是在动物模型中研究增强对应激的适应性反应的作用。在其他用途中，这种转基因动物被销售给研究人员。“敲除动物”或者“转基因动物”用于此是指非人类的动物，通常为哺乳动物，特别是啮齿类动物小鼠，具有20种非内源的(即异源的)核酸序列，在细胞的一部分中作为染色体外元件存在，或者被稳定地整合到其种系DNA中。采用本领域已知的方法，通过遗传操作，例如宿主动物的胚胎或胚胎干细胞的遗传操作，将该异源核酸导入所述转基因动物的种系中。
本发明的这些和其他的方面将在下文中被更加详细地讨论。
实验材料和方法IMPA2敲除小鼠IMPA2敲除小鼠从Lexicon Genetics Inc.获得，它是从OST203987产生的。用载体VICTR48建立基因陷阱(gene-trap)，在内含子1中发生插入(附图1)。
IMPA1和IMPA2的实时定量反转录(RTQ)PCR分析从野生型小鼠上切取不同组织(大脑、肝脏、脊髓、胃、肾脏、脾脏、大肠、肺、心脏食管、胰腺、回肠)，从这些组织中分离总RNA，用实时定量PCR分析总RNA，分析IMPA1和IMPA2的组织分布。
采用随机六聚体引物和Superscript II RT(Invitrogen LifeTechnologies)，用1μg总RNA进行第一链cDNA合成。采用Taqman PCR试剂盒，在ABIPrism 7000热循环仪(Applied Biosystems)上进行定量PCR。连续稀释cDNA来产生阈值循环(treshold cycle)与β-肌动蛋白浓度的对数值的标准曲线。RTQ特异引物对和探针被列举在下文中。
●小鼠IMPA2筛选 RTQ引物和探针IMPA2_FW 5′-GAG GTG GCC GTG CAG TTG-3′(SEQ ID No.7)IMPA2_REV 5′-AGA CGC GTT TTT CCT CTG TCA-3′(SEQ ID No.8)IMPA2_探针 5′-CCT GAT GAT TTG TCC CGC ACG CA-3′[5′FAM][3′TAMRA](SEQ ID No.9)●小鼠IMPA1筛选 RTQ引物和探针IMPA1_FW 5′-AGC TGT TTC AAT TGG CTT CCT T-3′(SEQ IDNo.10)IMPA1_REV 5′-GCC GGT GTA CAT CTT ATC TTC CA-3′(SEQ IDNo.11)IMPA1_探针 5′-TGA ATA AAG AGA TGG AGT TTG GAA TTG TGT ACAGCT-3′[5′FAM][3′TAMRA](SEQID No.12)重复实验样本三次，仅显示符合质量标准的结果。在归一化为小鼠β-肌动蛋白后，将不同小鼠组织中的表达水平表示为相对水平(附图2)，并且表示为平均CT值(附图3)。
表型分析小鼠行为测试对由10只野生型(+/+)、12只杂合的(+/-)和11只纯合的(-/-)IMPA2小鼠，雄性和雌性的混合组成的组进行三种行为测试升高的零迷宫测试(本领域已知的评价与焦虑相关的行为的方法)，Porsolt强迫游泳测试(本领域已知的评价与抑郁相关的行为的方法)和开阔场地测试(本领域已知的评价运动活性的方法)。
升高的零迷宫测试在正常的光照/黑暗循环的黑暗阶段，进行升高的零迷宫测试。在升高的零迷宫测试中，每只小鼠接受6分钟的测试时段。在该时段，记录如下参数总移动距离，在开放臂中的相对距离和在开放臂中的相对持续时间(附图4)。使用未校准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验用于所获得的数据的统计分析(表1)。
表1对于从升高的零迷宫测试从IMPA2小鼠获得的数据用未校准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验检验数据而得到的描述性的统计学和P值。
Porsolt强迫游泳测试Porsolt强迫游泳测试进行了2天。第一天，让IMPA2小鼠游泳10分钟，对前6分钟进行记录。24小时后，让同一小鼠进行第二次游泳，进行6分钟，并对该6分钟进行记录。将每个记录时期分为两个分开的时间段0→180秒和180→360秒。在正常光照/黑暗循环的光照阶段进行Porsolt强迫游泳测试。在这两个时段中记录如下参数在第一个180秒钟内的静止不动持续时间和在后一个180秒钟内的静止不动持续时间(图5和6)。用未标准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验对所获得的数据进行统计分析(表2和3)。
表2对来自第一天的IMPA2小鼠的强迫游泳测试的数据用未校准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验而得到的描述性的统计学和P值。
表3对来自第二天的IMPA2小鼠的强迫游泳测试的数据用未校准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验而得到的描述性的统计学和P值。
开阔场地测试在正常的光照/黑暗循环的光照阶段进行开阔场地测试。在自动开阔场地系统中，让每只小鼠进行30分钟的测试时段。记录在水平的和垂直的方格上的运动。在该时段中，记录如下参数在中央的停留时间、在中央的移动距离、总移动距离、移动次数、移动持续时间、直立活动的次数和直立活动的持续时间(附图7)。采用未校准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验，用于对所获得的数据的统计分析(表4)。
表4对来自IMPA2小鼠的开阔场地测试的数据采用未标准的Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分试验而获得的描述性的统计学和P值。
表4(续)
相对于温和胁迫的Impa2 KO小鼠和野生型同窝小鼠，针对未受胁迫的小鼠中的MIP合成酶和BDNF进行的实时定量反转录(RTQ)PCR分析。
连续7天，对Impa2 KO小鼠和WT同窝小鼠进行受限性胁迫。第一天，胁迫小鼠6小时。第二天到第七天，每天胁迫小鼠1小时。第八天，断颈处死小鼠，取出大脑，小心解剖出海马。WT和KO小鼠未接受刺激，作为对照。从海马中分离总RNA。如“IMPA1和IMPA2的实时定量反转录(RTQ)PCR分析”章节中所述进行RTQ PCR。RTQ特异性引物对和探针被列举在下文中。
MIP合酶_FW 5′-CTGCGCCTTCCTCAATGG-3′(SEQ ID No.13)MIP合酶_REV 5′-GCTGCGAAGCCAGTTCCA-3′(SEQ ID No.14)MIP合酶_探针 5′-TCCCCACAGAACACACTGGTACCCG[5′]6_FAM[3′]TAMRA(SEQ ID No.15)BDNF_FW 5′-CGGGACGGTCACAGTCCTA-3′(SEQ ID No.16)BDNF_REV 5′-CACTTGGTCTCGTAGAAATACTGCTT-3′(SEQ IDNo.17)BDNF_探针5′-AGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAAC[5′]FAM[3′]TAMRA(SEQ ID No.18)用双因子方差分析来分析所获得的数据，接着进行Wilcoxon-Mann-Whitney等级总分后分析。在数据分布不正常的情形下，通过log-转换将数据归一化。
结果对IMPA1和IMPA2的实时定量反转录PCR分析对多种小鼠组织中的IMPA1和IMPA2实时定量反转录(RTQ)PCR分析，显示大范围的组织分布，包括大脑(附图2)。另外，小鼠IMPA1的表达水平通常高于小鼠IMPA2的表达水平(附图3)。
在未受胁迫的小鼠与受温和胁迫的野生型Impa2 KO小鼠和野生型同窝小鼠中对MIP合酶和BDNF进行实时定量反转录(RTQ)PCR分析。结果发现，与WT同窝小鼠相比，IMPA2 KO小鼠中的MIP合酶表达水平较高。此外，在对胁迫反应时，IMPA2 KO小鼠和WT同窝小鼠中的MIP合酶被显著地上调(附图8)。
另外，与WT同窝小鼠相比，IMPA2 KO小鼠中的BDNF的基因型表达水平更高，并且与未受胁迫的动物相比，在受胁迫的动物中，该表达水平被显著上调(附图9)。
对于MIP合酶和BDNF来说，均未出现显著的基因型表达水平与胁迫诱导的表达水平之间的协同作用。
表型分析小鼠行为测试升高的零迷宫测试与野生型的同窝小鼠相比，IMPA2+/-小鼠在开放臂中的相对移动距离显著增加(p＝0.0358)。本发明人还观察到一种趋势，与野生型的同窝小鼠相比，IMPA2-/-小鼠在开放臂中的相对移动距离增加了(p＝0.061)。在升高的零迷宫中诱导焦虑的条件下，与WT同窝小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠在“产生焦虑的”开放臂中花费显著更长的时间(分别为p＝0.0357和p＝0.0426)。
Porsolt强迫游泳测试在强迫游泳测试诱导胁迫的条件下，在记录的第一天的10分钟游泳时段的前6分钟内，在IMPA2-/-、+/-和WT同窝小鼠之间，未观察到显著性差异(表2)。但是，第一天的这种刺激性试验在第二天使IMPA2-/-和+/-小鼠具有优势。也就是说，在6分钟游泳时段的前3分钟内，与WT同窝小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠的静止不动时间显著增加(分别为p＝0.0513和p＝0.0375；表3)。
开阔场地测试对于所试验的所有参数来说，在开阔场地测试中，在IMPA2-/-、+/-和WT同窝小鼠之间没有发现显著性差别。
讨论肌-肌醇单磷酸酶2(IMPA2)是在磷脂酰肌醇信号路径中起作用的关键酶之一。锂是最简单的稳定情绪的药物，它抑制肌醇合成和再循环中的关键酶IMPA1和IMPA2。此外，两极紊乱的易感基因座被绘制在染色体18p上，在IMPA2所处的区域中。为了进一步评价IMPA2在情感谱线(affective spectrum)异常中的潜在生物学作用，产生和评价了IMPA2敲除(Lexicon Genetics Inc.)。
在多个小鼠组织中进行了IMPA2的实时定量反转录PCR，显示了大范围的组织分布，包括大脑。但是与IMPA1水平相比，IMPA2的表达水平相对较低。在开阔场地测试、升高的零迷宫测试和强迫游泳中，测试了IMPA2缺陷小鼠的与焦虑和抑郁相关的行为。在零迷宫中观察到了基因一剂量效应，其中与WT同窝小鼠相比，IMPA2-/-小鼠在迷宫的开阔区域停留更长的时间，但是它们在运动活性方面不存在差别。在第一个强迫游泳时段内，在IMPA2-/-、+/-和WT同窝小鼠之间未观察到显著性差别，但是在24小时后的第二个时段内，与WT同窝小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠的静止不动表现有显著的减少。当IMPA2-/-、+/-和WT同窝小鼠都探查开放场地30分钟时，在它们之间没有发现差别。
总之，在此提供的结果表明，IMPA2敲除小鼠表现出与忧虑和抑郁相关的行为减少，但是其运动功能与WT同窝小鼠无差别，指示了IMPA2在情感紊乱中的可能作用。
为了证实最初的假设，即IMPA2可能在情感紊乱中起作用，即IMPA2 KO小鼠适度的抗抑郁和抗焦虑的表型，通过研究MIP合酶和BNDF的海马趾表达的改变，进行进一步了分子表征。
MIP合酶是与肌醇信号路径相关的基因，已知该路径在狂躁抑郁中起作用，而BDNF是神经营养信号路径中的基因，已知它与食欲行为和抑郁样表型的发展相关。
在IMPA2 KO小鼠和WT同窝小鼠中，胁迫引起MBP合酶和BDNF的上调，以及在IMPA2 KO中的基因型上调，表明了IMPA2在肌醇和神经营养路径对应激的适应性反应中的作用，提示了IMPA2 KO具有改进的适应性潜能(未受胁迫的条件下)和对应激物的反应。
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<400>1ctggcggcgg gacggcggga tccggtggga gccggagtcc cgccgagggg ggctggaggt 60ggaggggccc ggcgaggccg cg atg aag ccg agc ggc gag gac cag gcg gcg 112Met Lys Pro Ser Gly Glu Asp Gln Ala Ala15 10ctg gcg gcc ggc ccc tgg gag gag tgc ttc cag gcg gcc gtg cag ctg 160Leu Ala Ala Gly Pro Trp Glu Glu Cys Phe Gln Ala Ala Val Gln Leu15 20 25gcg ctg cgg gca gga cag atc atc aga aaa gcc ctt act gag gaa aaa 208Ala Leu Arg Ala Gly Gln Ile Ile Arg Lys Ala Leu Thr Glu Glu Lys30 35 40cgt gtc tca aca aaa aca tca gct gca gat ctt gtg aca gaa aca gat 256Arg Val Ser Thr Lys Thr Ser Ala Ala Asp Leu Val Thr Glu Thr Asp45 50 55
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<221>CDS<222>(158)..(1030)<223>
<400>3cggacgcgtg ggcgcgcgct ggaggacgca cggcttggcg ggaaggcgag gggactgtgc60ggagcctccg gtgctggcgg cggccacgag tgggagcccg ggtccggccg cagcacgcgg 120aacagagcag aaggtggcgg ggtccagcga agccacg atg aag ccg agc agc gag175Met Lys Pro Ser Ser Glu1 5
gaa gag gga gag ttg gtg cag ggc gtg ggc ccc tgg gat gag tgc ttc 223Glu Glu Gly Glu Leu Val Gln Gly Val Gly Pro Trp Asp Glu Cys Phe10 15 20gag gtg gcc gtg cag ttg gcg ctg cgt gcg gga caa atc atc agg aag 271Glu Val Ala Val Gln Leu Ala Leu Arg Ala Gly Gln Ile Ile Arg Lys25 30 35gcc ctg aca gag gaa aaa cgc gtc tct aca aaa aca tct gct gcc gat 319Ala Leu Thr Glu Glu Lys Arg Val Ser Thr Lys Thr Ser Ala Ala Asp40 45 50ctt gtg aca gaa aca gat cac cga gta gaa gat tta att gtt tct gag 367Leu Val Thr Glu Thr Asp His Arg Val Glu Asp Leu Ile Val Ser Glu55 60 65 70ttg cga aag cgg ttt cct tca cac agg ttc att gca gaa gag gcc aca 415Leu Arg Lys Arg Phe Pro Ser His Arg Phe Ile Ala Glu Glu Ala Thr75 80 85gcc tcc ggg gcc aag tgt gtg ctc acc cac agc ccg acc tgg atc atc 463Ala Ser Gly Ala Lys Cys Val Leu Thr His Set Pro Thr Trp Ile Ile90 95 100gac ccc atc gac ggc acc tgc aac ttc gtg cac agg ttc ccc act gtg 511Asp Pro Ile Asp Gly Thr Cys Asn Phe Val His Arg Phe Pro Thr Val105 110 115gca gtt agc atc gga ttt gct gtt cac cag gag ctg gaa ttt gga gtg 559Ala Val Ser Ile Gly Phe Ala Val His Gln Glu Leu Glu Phe Gly Val120 125 130att cac cac tgc aca gag gag cgg ctg tac acc ggc agg agg ggc caa 607Ile His His Cys Thr Glu Glu Arg Leu Tyr Thr Gly Arg Arg Gly Gln135 140 145 150ggt gcc ttt tgc aat ggc cag cgg ctc cag gtc tcc agg gag aca gat 655Gly Ala Phe Cys Asn Gly Gln Arg Leu Gln Val Ser Arg Glu Thr Asp155 160 165ctc gca aag gcc ttg gtt ctg aca gaa atc ggg ccc aaa cgc gac ccc 703Leu Ala Lys Ala Leu Val Leu Thr Glu Ile Gly Pro Lys Arg Asp Pro170 175 180
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<220>
<221>CDS<222>(185)..(1057)<223>
<400>5cttgggctgc agccccttgc gggccttcct gctgcaaggc gcgctggagg acgcacggct 60tggcgggaag gcgaggggac cgtgcggagc ctccggtgct ggcggcggcc accagttcgg 120gagccgggag ccggccgcag cacgcggaac agagcagagg gtggcggggc ccggcgaaac 180cacg atg aag ccg aac agc gag gaa gag gag gag ttg gtg cag ggc gtg 229Met Lys Pro Asn Ser Glu Glu Glu Glu Glu Leu Val Gln Gly Val1 5 10 15ggc ccc tgg gac gag tgc ttc gag gtg gcc gtg cag ttg gcg ttg cgt277Gly Pro Trp Asp Glu Cys Phe Glu Val Ala Val Gln Leu Ala Leu Arg20 25 30gcg gga caa atc atc aga aag gcc ctc act gag gaa aaa cac gtc tcg325Ala Gly Gln Ile Ile Arg Lys Ala Leu Thr Glu Glu Lys His Val Ser35 40 45acg aaa aca tct gct gca gat ctt gtg aca gaa aca gat cac cga gta373Thr Lys Thr Ser Ala Ala Asp Leu Val Thr Glu Thr Asp His Arg Val50 55 60gaa gac tta att gtt tct gag ttg cga aag cgg ttc cct tca cac agg421Glu Asp Leu Ile Val Ser Glu Leu Arg Lys Arg Phe Pro Ser His Arg65 70 75ttc att gca gaa gag gcc aca gcc tcc ggg gcc aag tgt gtg ctc acc469Phe Ile Ala Glu Glu Ala Thr Ala Ser Gly Ala Lys Cys Val Leu Thr80 85 90 95cac agc ccg acc tgg atc atc gac ccc atc gac ggc acc tgc aac ttt517His Ser Pro Thr Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Cys Asn Phe100 105 110gtg cac aga ttc ccc act gtg gca gtt agc atc gga ttt gct gtt cac565Val His Arg Phe Pro Thr Val Ala Val Ser Ile Gly Phe Ala Val His115 120 125
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275 280 285Glu Lys290<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2正向引物<400>7gaggtggccg tgcagttg18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2正向引物<400>8agacgcgttt ttcctctgtc a21<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2探针<400>9cctgatgatt tgtcccgcac gca 23<210>10
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA1正向引物<400>10agctgtttca attggcttcc tt 22<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA1反向引物<400>11gccggtgtac atcttatctt cca 23<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMP1探针<400>12tgaataaaga gatggagttt ggaattgtgt acagct36<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶正向引物<400>13
ctgcgccttc ctcaatgg18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶反向引物<400>14gctgcgaagc cagttcca18<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶探针<400>15tccccacaga acacactggt acccg25<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BDNF正向引物<400>16cgggacggtc acagtccta 19<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>BDNF反向引物<400>17cacttggtct cgtagaaata ctgctt 26<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BDNF探针<400>18agaaagtccc ggtatccaaa ggccaac 2权利要求
1.分离的IMPA2蛋白在鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中所述化合物的特征在于它们能够增强神经元的可塑性。
2.按照权利要求1的用途，其中IMPA2蛋白选自；i.小鼠IMPA2(SEQ ID No4)、大鼠IMPA2(SEQ ID No6)、人IMPA2(SEQ ID No2)或其功能性片段，或者ii.编码IMPA2蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在其全长上与人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更加优选至少95％或最优选至少98％序列同一性。
3.编码IMPA2蛋白的分离的多核苷酸在鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中所述化合物的特征在于它们能够增强神经元的可塑性。
4.按照权利要求3的用途，其中在按照本发明的分析中，所述分离的多核苷酸编码IMPA2蛋白，其中所述IMPA2蛋白优选选自；i.编码小鼠(EMBLBC011093-SEQ ID No3)、大鼠(EMBLAY160191-SEQ ID No5)或人(EMBLBC011093-SEQ IDNo1)IMPA2酶的多核苷酸，或者ii.编码IMPA2蛋白的多核苷酸序列，其中所述氨基酸序列在其全长上与人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更加优选至少95％或最优选至少98％序列同一性。
5.鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦虑或抗抑郁化合物能够增强神经元的可塑性，所述方法包括步骤a)提供包含IMPA2蛋白的组合物；将b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物是抗焦虑或抗抑郁的化合物。
6.用于确定一种化合物是否能够增强神经元的可塑性的方法，所述方包括a)提供包含IMPA2蛋白的组合物；将b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物是增强神经元的可塑性的化合物。
7.按照权利要求5或6的方法，其中通过测量肌-肌醇1-磷酸盐水解产生肌醇和无机磷酸盐来评定IMPA2蛋白活性。
8.按照权利要求5-7的任何一项的方法，其中通过测定放射标记的肌醇形式的肌-肌醇单磷酸盐产物或者放射标记的32Pi形式的无机磷酸盐(Pi)的积累或者通过比色分析来评定IMPA2蛋白的活性。
9.按照权利要求5-8的任何一项的方法，其中包含IMPA2蛋白的组合物可以是表达按照本发明的IMPA2蛋白的细胞提取物、全细胞或生物体。
10.治疗与神经元适应性反应受损相关的症状的方法，包含给需要这种治疗的受试者施用有效量的IMPA2抑制剂的步骤。
11.按照权利要求9的方法，其中与神经元适应性反应受损相关的症状选自记忆功能障碍或者神经退行性疾病。
12.按照权利要求11的方法，其中神经退行性疾病选自老年性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、脑脊髓肾上腺脑白质营养不良、皮克病或威尔逊病。
13.治疗神经元损伤的方法，包含给需要这种治疗的受试者施用有效量的IMPA2抑制剂的步骤。
14.按照权利要求13的方法，其中神经元损伤选自中风、多发性梗塞痴呆、头部创伤、大脑缺血、大脑损伤和神经退行性疾病。
15.增强记忆力和学习能力的方法，包含给需要这种治疗的受试者施用有效量的IMPA2抑制剂的步骤。
16.按照权利要求1-9中任何一项的在分析中所鉴定的化合物的用途，用于制备治疗焦虑的药物或者用于制备促进神经元的可塑性的药物。
17.IMPA2敲除动物作为神经可塑性的模型的用途。
全文摘要
本发明涉及肌－肌醇单磷酸酶2(IMPA2)的功能表征，IMPA2是在磷脂酰肌醇信号路径中起作用的酶之一。特别地，本发明提供证据表明IMPA2与抑郁和焦虑引起的症状，特别是焦虑和情感紊乱相关。第一个方面，本发明提供IMPA2酶在用于鉴定抗焦虑或抗抑郁化合物的分析中的用途。特别是编码所述IMPA2蛋白的分离多核苷酸的用途，其中所述IMPA2蛋白优选选自编码小鼠、大鼠或人的IMPA2酶的多核苷酸。因此，本发明的目的在于提供用于鉴定抗焦虑或抗抑郁的化合物的方法，其中所述化合物能够增强神经元的可塑性，所述方法包括步骤a)提供包含IMPA2蛋白的组合物；b)将IMPA2蛋白与测试化合物接触；和c)测量IMPA2蛋白的活性，其中在存在测试化合物时，IMPA2活性下降指示测试化合物为一种抗焦虑或抗抑郁的化合物。在这些分析中，通过对肌－肌醇1－磷酸盐水解生成肌醇和无机磷酸盐进行测量，来评价IMPA2蛋白的活性，特别是通过测量放射标记的肌醇形式的肌－肌醇单磷酸酶产物或放射标记的
文档编号G01N33/573GK1791674SQ200480013358
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月13日 优先权日2003年5月16日
发明者W·M·A·巴勒曼斯, D·W·E·默查斯, T·H·W·施特克勒, K·克林斯 申请人:詹森药业有限公司