焦磷酸检测传感器、核酸的检测方法以及碱基种类的判断方法

专利名称：焦磷酸检测传感器、核酸的检测方法以及碱基种类的判断方法
技术领域：
本发明涉及简便而且高敏感度地检测试样中焦磷酸的传感器，以及使用这种传感器的核酸检测方法以及碱基种类的判断方法。
背景技术：
已知焦磷酸与细胞内的酶反应有着很深的关联。比如在合成蛋白质的过程中，氨基酸经由氨酰基腺苷酸形成氨酰tRNA的反应中生成焦磷酸。而在比如植物等中观察到的淀粉合成的过程中，葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成ADP-葡萄糖时，就生成焦磷酸。除此以外，在各种酶反应中涉及到焦磷酸也是已知的。因此，定量检测焦磷酸的技术，在解析细胞状态或者上述酶反应时是很重要的技术。
现有的焦磷酸的测量方法，已知有Grindley等的化学方法(参照G.B.Grindley和C.A.Nichel，Anal.Biochem.第33卷，p.114(1970))。但是，由于在此方法中要使用浓硫酸，非常危险。
在特开昭61-12300号公报中公开了不用浓硫酸等危险药品，而利用酶测定焦磷酸的三种方法，下面说明这些方法。
第一种方法是在磷酸烯醇丙酮酸和腺苷一磷酸存在下，用丙酮酸正磷酸盐二激酶作用于焦磷酸的方法。由于通过此反应生成丙酮酸，可通过测定丙酮酸的量算出焦磷酸的量。而测定丙酮酸的量，提出了两种方法。其一是利用乳酸脱氢酶的催化作用，在用NADH还原丙酮酸时，比色定量NADH的减少的方法。另一个是用丙酮酸氧化酶作用于生成的丙酮酸，把生成的过氧化氢导入到色素进行比色定量的方法。
第二种方法是在胞苷二磷甘油存在下，让甘油-3-磷酸酯胞苷转移酶作用于焦磷酸的方法。通过此反应生成甘油三磷酸。从而，通过测定甘油三磷酸的生成量可算出焦磷酸的量。对于测定甘油三磷酸，提出了两种方法。一种是利用甘油-3-磷酸脱氢酶的催化作用，用NAD(P)氧化甘油三磷酸时，对NAD(P)H的增加进行比色定量的方法。另一个是让甘油-3-磷酸酯氧化酶作用于生成的甘油三磷酸，把生成的过氧化氢导入到色素，对此进行比色定量的方法。
第三种方法是在胞苷二磷酸核糖醇存在下，让焦磷酸与核糖醇-5-磷酸酯胞苷转移酶相作用的方法。由于通过此反应生成D-核糖醇-5-磷酸，测定其生成量就能够测定焦磷酸的量。D-核糖醇-5-磷酸的测定方法，提出过在NAD(或NADP)存在下，与核糖醇-5-磷酸脱氢酶作用，对NADH(或NADPH)的增加进行比色定量的方法。
此外，在特开2002-369698号公报中公开了一种方法，在此方法中，通过焦磷酸酶使焦磷酸加水分解成磷酸，然后由嘌呤核苷酸磷酸化酶使肌苷或黄苷与磷酸反应，生成次黄嘌呤，再通过黄嘌呤氧化酶将其氧化为黄嘌呤，再氧化生成尿酸，将此通过黄嘌呤氧化酶进行的氧化过程中生成的过氧化氢，利用过氧化酶使发色剂发色。
另外，核酸的延伸反应也是涉及到焦磷酸的一种重要的生体反应。
近年来，涉及基因信息的技术得到广泛的开发。在医疗领域中，通过对疾病相关基因的解析，使得能够在分子水平上治疗疾病。而通过基因诊断，使得能够根据不同的患者个人进行特定的治疗。在制药领域中，使用基因信息使特定的抗体或激素等蛋白质分子作为药品加以利用。在农业和食品等领域，也制造出了许多利用基因信息的制品。
在这些基因信息中，基因的多态性是特别重要的。正如我们每个人有各式各样的面部和体型，各个人的基因信息有相当一部分是不同的。在这些不同遗传信息中，碱基序列的变化以人口1％以上的频率存在，这称为基因的多态性。这样的基因多态性不仅表现在各个人的脸面上，也成为各种基因疾病的原因，据说与体质、药物的应答性、药物的副作用等都有关，现在，研究者们正在快速研究基因的多态性和疾病等的关联。
在此基因的多态性当中，近年来特别引人注目的是SNP(单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism))。SNP指的是在基因信息的碱基序列中只有一个碱基不同的基因多态性。据说人的染色体DNA内的SNP有2～3百万之多，很容易利用基因的多态性作为标志，期望在临床上得到应用。现在，作为SNP的相关技术，在研究染色体中SNP的确定位置以及SNP与疾病的关联性等的同时，判别SNP部位的碱基的SNP分类定型技术也在进行开发当中。
SNP分类定型技术有利用杂交的技术、利用限制酶的技术、利用连接酶的技术等各种技术。在这些技术中，最简便的技术是利用引物延伸(primer extension)反应的技术。在这种技术中，通过判断是否发生引物延伸反应，来进行SNP的分类定型。
在利用引物延伸反应的SNP分类定型技术的检测中，除了使用荧光色素检测实际DNA扩增产物的方法，以及使用固定探针的方法以外，也想出了由DNA聚合酶检测核酸合成副产物焦磷酸的方法。在此方法中，为了检测延伸反应进行的差别，使用了将伴随着引物延伸反应的进行生成的焦磷酸转变为ATP，之后利用荧光素酶反应测定焦磷酸的方法(参照J.Immunological Method，156，55～60，1992)。
但是，在通过上述方法测定焦磷酸的方法中，在引物延伸反应中使用dATP的情况下，dATP成为与ATP相同的荧光素酶反应基质。因此，不能正确地判别SNP部位的碱基种类。从而，就有了有必要用特殊的dATP类似物(作为DNA聚合酶的基质发生作用、而不作为荧光素酶反应基质)来代替dATP的课题。
另外，在其它的焦磷酸测定技术中，也存在需要多种酶和试剂等、增加成本、工序复杂等缺点。在这些方法中，由于上述的原因致使难以实现作为套件和小型传感器的装置，这也成为一个课题。
并且，由于这些方法几乎都是光学检测法，测定装置庞大也成为问题。

发明内容
为了解决如上所述的课题，本发明的目的是提供一种能够简便而且高敏感度地检测焦磷酸，并且结构简单的焦磷酸检测传感器，以及使用此传感器检测核酸的方法和判别盐基种类的方法。
为了实现此目的，本发明是一种用来检测试样液体中焦磷酸的焦磷酸检测传感器，该传感器具备容纳上述试样液体的试样液体容纳部、含有H+-焦磷酸酶的H+难透过性膜、用来固定上述H+难透过性膜的固定层、测定伴随着上述固定层中氢离子浓度变化发生的电化学变化的测定机构，上述H+-焦磷酸酶使上述液体试样中的焦磷酸水解，伴随着此反应引起固定层的氢离子浓度的变化。在这样的结构中，由于通过H+-焦磷酸酶引起氢离子浓度变化的固定层还具有固定H+难透过性膜的功能，可使焦磷酸检测传感器的结构很简单。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构是上述固定层在其上面或内部固定H+难透过性膜。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构是上述H+难透过性膜是一个膜小胞，上述固定层将上述H+难透过性膜固定在其内部。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构是其上述测定机构具备与上述固定层相连接的氢离子敏感电极，和在容纳上述液体试样的状态下与上述液体试样接触的参比电极。而上述测定机构的结构优选为，能够测定上述氢离子敏感电极与上述参比电极的电位差变化。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，上述固定层由高分子凝胶或自组织单分子膜(下面称SAM膜)构成。高分子凝胶通过其持水力固定上述H+难透过性膜。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构具备上述固定层含有根据氢离子浓度的变化能发生氧化还原反应的材料，上述测定机构具备与上述固定层接触的可极化电极，和在容纳上述液体试样的状态下与上述液体试样接触的参比电极。而上述测定机构的结构优选为能够测定上述可极化电极与上述参比电极之间的电流变化。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构是，上述固定层由含有根据氢离子浓度的变化能发生氧化还原反应的介质的高分子凝胶或自组织单分子膜所构成，在其上面固定有上述H+难透过性膜。
作为上述焦磷酸检测传感器的一个形态，其结构是上述固定层由根据氢离子浓度的变化能发生氧化还原反应的电解聚合材料构成。
另外，本发明是使用上述焦磷酸检测传感器检测具有特定碱基序列的核酸的方法，该方法包括(a)配制含有试样、引物(具有碱基序列，该碱基序列含有与上述核酸互补结合的互补结合区)和核苷酸的液体试样的工序；(b)在上述液体试样与上述引物发生延伸反应的条件下发生上述延伸反应时，生成焦磷酸的工序；(c)在上述焦磷酸检测传感器的上述液体试样容纳部，使上述液体试样处于容纳状态的工序；(d)由上述焦磷酸检测传感器的上述测定机构，测定伴随着上述固定层的氢离子浓度变化所发生的电化学变化的工序；(e)基于工序(d)的测定结果检测上述延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)的检测结果检测上述核酸的工序。
另外，本发明是使用上述焦磷酸检测传感器判别核酸的碱基序列中碱基种类的方法，包括(a)配制含有核酸、引物(具有碱基序列，该碱基序列含有与上述核酸互补结合的互补结合区)和核苷酸的液体试样的工序；(b)在上述液体试样与上述引物发生延伸反应的条件下发生上述延伸反应时，生成焦磷酸的工序；(c)在上述焦磷酸检测传感器的上述液体试样容纳部，使上述液体试样处于容纳状态的工序；(d)由上述焦磷酸检测传感器的测定机构测定伴随着上述固定层氢离子浓度变化发生的电化学变化的工序；(e)基于工序(d)的测定结果检测上述延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)的检测结果判别上述核酸的碱基序列中碱基种类的工序。
下面参照附图详细说明具体实施方式
，由此本发明的的上述目的、其它目的、特征以及优点将更加明了。


图1是表示处于植物液胞膜内部状态的H+-焦磷酸酶的示意图；图2是示意性地表示第一个实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图；图3是示意性地表示第二个实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图；图4是示意性地表示第三个实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图；图5是示意性地表示第四个实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图；图6是示意性地表示第五个实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图；图7是示意性地表示焦磷酸检测传感器结构1的断面图；图8是示意性地表示焦磷酸检测传感器结构2的断面图；图9是示意性地表示焦磷酸检测传感器结构3的断面图；
图10是示意性地表示焦磷酸检测传感器结构4的断面图；图11是表示以检测为目的的DNA和DNA探针中SNP部位一致时反应体系的图；图12是表示以检测为目的的DNA和DNA探针中SNP部位不一致时反应体系的图；图13A是表示与λDNA的特定碱基序列完全杂交得到的两种引物C和引物D的图；图13B是表示PCR(聚合酶链式反应)反应液G和H组成表的图；图13C是表示进行PCR反应的反应温度条件的流程图；图14A是表示野生型λDNA、变异型λDNA和分类定型引物的图；图14B是表示PCR反应液I和J组成表的图；图14C是表示进行PCR反应的反应温度条件的流程图。
具体实施例方式
下面参照

本发明的实施方式。
首先用图1说明本发明的反应原理。在本发明中，为了定性或定量检测焦磷酸，使用了H+-焦磷酸酶。图1是表示处于植物液胞膜内部状态的H+-焦磷酸酶的示意图。如图1所示，H+-焦磷酸酶11通常是植物等的液胞膜13内存在的膜蛋白质，具有伴随着由一个分子焦磷酸10生成两个分子磷酸12的水解反应，从不能或难以通过氢离子的液胞膜13的外侧(表面13a一侧)向液胞膜13的内侧(里面13b一侧)输送氢离子的性能。因此，通过H+-焦磷酸酶的酶反应，使液胞膜13内部的氢离子浓度增大，液胞膜13外部的氢离子浓度减小。
各个实施方式中的焦磷酸检测传感器中，利用H+-焦磷酸酶的上述性能和作为膜蛋白质的形态来进行焦磷酸的检测。即，在持有H+-焦磷酸酶的膜上分离一部分区域，通过测定至少是任何一边的氢离子浓度的变化，可检测H+-焦磷酸酶促进了水解的焦磷酸的量。如此，各个实施方式中的焦磷酸检测传感器中，通过检测与H+-焦磷酸酶的作用直接相关的氢离子的浓度变化，进行焦磷酸的检测，因此能够进行简便而且高敏感度的检测。而为了进行上述检测，将氢离子输送源的区域和氢离子输送目的地的区域进行分离就成为必要的条件，由于H+-焦磷酸酶是膜蛋白质，能够将其形态利用于区域分离。这有助于简化焦磷酸检测传感器的结构。
在使用各个实施方式的焦磷酸检测传感器的检测工序中，使含有焦磷酸的液体试样，与从植物细胞中离析的液胞膜13等的处于H+难透过性膜的内部状态的H+-焦磷酸酶接触。
之后，测定H+难透过性膜内侧或H+难透过性膜外侧的氢离子浓度的变化。由此测定液体试样中有无焦磷酸或焦磷酸的量，进行焦磷酸的定性或定量检测。
(实施方式1)本实施方式涉及焦磷酸检测传感器。图2是示意性地表示本实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图。焦磷酸检测传感器31具备绝缘基板22、固定在绝缘基板22上的由持液部件25形成的持液部分32和测定机构。持液部分32由在基板22上形成的固定层51、固定在上述固定层51上面的H+难透过性膜21、和没有构成这些区域的液体试样容纳部33所构成。测定机构具备配置在基板22的上面与固定层51接触的氢离子敏感电极23，和配置成在试样液体容纳部33中充满试样液体26的状态下与试样液体26接触的参比电极27。
H+难透过性膜21具有H+-焦磷酸酶11。H+难透过性膜21在H+-焦磷酸酶11以外的部分由难以透过氢离子的膜构成，比如可以利用天然的液胞膜或人工的脂质双层膜等。在H+难透过性膜21中，使H+-焦磷酸酶11的焦磷酸水解的活性部位，在液体试样容纳部33一侧露出。
固定层51由能够充分透过氢离子并保持水分的材料所制造。而固定层51由在其上面能够固定H+难透过性膜的材料所形成。固定层51可由利用其持水力能将H+难透过性膜21固定在其上面的凝胶，或由利用交联反应将H+难透过性膜21固定在其上面的SAM膜所形成。作为这样的材料，可以使用琼脂糖凝胶等的高分子凝胶、含有球壳状碳分子形状化合物的材料等。
作为氢离子敏感电极23，只要具有通常的pH值传感器功能即可，可以利用玻璃电极、ISFET电极(ion sensitive FET(离子敏感场效应晶体管)，在口部使用离子敏感膜的离子敏感FET)、LAPS(Light-Addressable Potentiometric Sensor光寻址电位传感器)等。
参比电极27可以利用标准氢电极、银/氯化银电极和饱和甘汞电极等。
绝缘基板22和持液部件25，只要是由不影响焦磷酸水解反应的材料制造即可，能够由玻璃、硅、塑料等制造。
下面说明使用焦磷酸检测传感器31检测液体试样26中含有的焦磷酸的方法及其原理。首先，在液体试样容纳部33中装满液体试样26。液体试样26中含有焦磷酸时，由于H+-焦磷酸酶11的活性，使焦磷酸水解为磷酸，伴随着这个过程固定层51内的氢离子浓度上升。通过使用氢离子敏感电极23测定此氢离子浓度的升高，就能够检测测定液26中的焦磷酸浓度。具体来说，通过测定氢离子敏感电极23与参比电极27之间电位差的变化，测定出固定层51内氢离子浓度的变化，基于此测定的结果，检测出测定液26中焦磷酸的浓度。
另外，H+难透过性膜21也可以包括，水解焦磷酸的活性部位向固定层51一侧(内部)露出的H+-焦磷酸酶。但是，使用H+难透过性膜21(H+难透过性膜含有，水解焦磷酸的活性部位向内部露出的H+-焦磷酸酶)时，固定层51的焦磷酸浓度优选低于液体试样26的焦磷酸浓度，在固定层51中最优选不含有焦磷酸。由此，减少或终止了从固定层51向液体试样26输送氢离子，使从液体试样26向固定层51的氢离子输送变成优势，固定层51的氢离子浓度的变化大体上就限定在由液体试样26中所含焦磷酸造成的变化。从而，就能够正确地估计出在液体试样26中所含的焦磷酸的量。
由于焦磷酸检测传感器31的结构没有用H+难透过性膜21覆盖与固定层51的液体试样容纳部33的整个界面，在液体试样26和固定层51之间的氢离子能够从H+难透过性膜没有覆盖的界面部分移动，氢离子从应该保持平衡的这个部分进行扩散，但由于扩散造成的氢离子的移动比由于H+-焦磷酸酶11的活性造成的氢离子的移动要慢，由氢离子敏感电极23测定的氢离子浓度变化大致就是由H+-焦磷酸酶11的活性造成的氢离子浓度的变化。
(第二实施方式)本实施方式涉及焦磷酸检测传感器。图3是示意性地表示本实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图。本实施方式的焦磷酸检测传感器34与第一实施方式的焦磷酸检测传感器31的不同之处只是在绝缘基板22上面的整个区域形成固定层51，在固定层51和液体试样容纳部33的整个区域都配置有H+难透过性膜21。其它结构与第一实施方式的焦磷酸检测传感器31相同，省略说明。
(第三实施方式)本实施方式涉及焦磷酸检测传感器。图4是示意性地表示本实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图。与第一实施方式不同之处在于，由膜小胞71形成H+难透过性膜，以及作为H+难透过性膜的膜小胞71的固定位置。下面只说明与第一实施方式的不同之处。
膜小胞71具有H+-焦磷酸酶11，固定在固定层51内。固定层51由能够通过，比如凝胶持水力，将膜小胞71固定在内部的材料构成。作为膜小胞71，可以使用从细胞中离析的液胞调制的材料。另外，作为膜小胞71，也可以使用在人工制造的脂质双层膜或LB膜等不能通过氢离子或者难以通过氢离子的膜内，使内部存在离析或精制的H+-焦磷酸酶的重新构筑的结构。
膜小胞71的膜也可以含有H+-焦磷酸酶以外的蛋白质。但是，这些蛋白质优选是不与焦磷酸反应，或者反应性很低的蛋白质。这是由于焦磷酸与膜小胞71中存在的H+-焦磷酸酶以外的蛋白质反应时，使与H+-焦磷酸酶反应的焦磷酸的量减少，与此同时，使氢离子的输送量减少。另外，膜小胞71的膜中含有不与焦磷酸发生反应，而通过与焦磷酸以外的物质反应来输送氢离子的蛋白质时，优选在液体试样26中要几乎不含有与这种蛋白质发生反应的物质。具体说比如，膜小胞71的膜中含有几乎不与焦磷酸发生反应，而通过与ATP的反应来输送氢离子的蛋白质ATP酶时，液体试样26中优选几乎不含有ATP。
下面说明使用焦磷酸检测传感器35检测液体试样26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先液体试样容纳部33中装满液体试样26。液体试样26中含有焦磷酸时，焦磷酸向固定层51扩散。之后，扩散到固定层51中的焦磷酸，由于H+-焦磷酸酶11的活性水解为磷酸，与此同时，膜小胞71的内部液体24的氢离子浓度上升，H+-焦磷酸酶11的周边的氢离子浓度降低。当在氢离子敏感电极23的很近处存在有H+-焦磷酸酶时，氢离子敏感电极23就测定出氢离子浓度的降低，就能够测定出液体试样26中的焦磷酸浓度。
(第四实施方式)本实施方式涉及焦磷酸检测传感器。图5是示意性地表示本实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图。焦磷酸检测传感器36与第二实施方式的不同之处只是固定层的结构和测定电极的结构。下面说明这些不同点。
测定电极由绝缘基板22上形成的可极化电极81构成。可极化电极81可由金、铂、碳等通常的可用于电化学测定的电极构成。可极化电极81，可以利用结构非常简单的电极。这有助于焦磷酸检测传感器整体结构的简单化。并且，本实施方式中，作为参比电极27，除了标准氢电极、银/氯化银电极、饱和甘汞电极以外，也可以利用金、铂、碳等电极，这样有助于焦磷酸检测传感器整体结构的进一步简单化。
可极化电极81的表面，形成含有介质82的固定层83。作为固定层83，可以利用比如一端具有硫醇基的直链碳的SAM膜(self-assembled monolayer，自组织单分子膜)。但是，作为形成固定层83的材料，只要能够固定H+难透过性膜21就不限于此，也可以使用通过其持水力来固定H+难透过性膜21的凝胶。作为介质82，可以使用氢离子敏感性的氧化体。在如此形成的固定层83上固定含有H+-焦磷酸酶的H+难透过性膜21。利用上述SAM膜形成固定层83时，可通过硫醇基团的交联反应将H+难透过性膜21固定在固定层83上。H+难透过性膜21是脂质膜时，固定层83与脂质膜的疏水部分相对着，由脂质膜的亲水部分形成膜表面。H+-焦磷酸酶11被固定在由固定层83和脂质膜的疏水部分形成的膜的内部，而此时，H+-焦磷酸酶11的水解焦磷酸的活性部位就暴露在H+难透过性膜21的外部。
下面说明使用焦磷酸检测传感器36检测液体试样26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液体试样容纳部33中装满液体试样26。液体试样26中含有焦磷酸时，由于H+-焦磷酸酶11的活性使焦磷酸水解为磷酸，伴随着此过程，固定层83内的氢离子浓度上升。此时，在氢离子敏感性介质82的氧化体的存在下，通过氧化还原反应生成介质82的还原体。通过在可极化电极81上施加比介质82的氧化还原电位高得多的电位，可测定出与介质82的还原物质浓度相应的电流，由此就能够检测出液体试样26中焦磷酸的浓度。
(第五实施方式)本实施方式涉及焦磷酸检测传感器。图6是示意性地表示本实施方式的焦磷酸检测传感器结构的断面图。本实施方式的焦磷酸检测传感器37与第四实施方式的不同之处在于由膜小胞71形成H+难透过性膜、作为膜小胞71的H+难透过性膜的固定位置，固定层的结构。下面说明这些与第四实施方式的不同点。
膜小胞71含有H+-焦磷酸酶11，被固定在固定层91内。固定层91由电解聚合膜构成。由电解聚合膜固定膜小胞的方法是，例如，可以通过混合聚合前的单体和膜小胞，再施加预定的电压来形成。作为制造电解聚合膜的电解聚合材料，可以选择具有电化学活性的物质，比如可以使用聚苯胺、聚邻苯二胺、聚N-甲基苯胺、聚吡咯、聚N-甲基吡咯、聚噻吩等。
下面说明使用焦磷酸检测传感器37检测液体试样26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液体试样容纳部33中装满液体试样26。液体试样26中含有焦磷酸时，焦磷酸向固定层91扩散，由于H+-焦磷酸酶11的活性使焦磷酸水解为磷酸。伴随着焦磷酸的水解，内部液体24的氢离子浓度上升，H+-焦磷酸酶11周边的氢离子浓度减少。由于此氢离子浓度的变化，作为固定层91的电解聚合膜发生氧化还原反应，通过可极化电极81测定其电子移动，就能够测定出液体试样26中焦磷酸的浓度。
本发明涉及的焦磷酸检测传感器中，正如从使用图1所说明的反应原理中所看到的，在含有H+-焦磷酸酶的H+难透过性膜与测定电极(氢离子敏感电极23、可极化电极81)之间，氢离子或氢离子敏感性介质的氧化体必须以离子状态存在。作为这样的情况，也可以使用自由水溶液(bulk aqueous solution)。但是，为了使H+难透过性膜与测定电极之间存在有自由的水溶液，如在特开平6-90736号公报中所显示，必须经过非常复杂的工序来制造传感器。特别是，在如此制造的传感器中，一旦制造完毕，就只能保存在水溶液中，例如焦磷酸检测传感器作为DNA检测传感器使用时，其操作方法和保存方法都极为特殊，再考虑到制造方法的复杂性，其不适合例如在任意形式的临床检查等当中使用。另外，在第一～第五实施方式的焦磷酸检测传感器中，上述氢离子或氢离子敏感性介质的氧化体，在以离子状态存在时，都由固定层构成。这样的固定层可由比如SAM膜或电解聚合膜形成，能够以比较简单的方法制造传感器。而在以高分子凝胶作为固定层的传感器中，由于能够在保持水分子的状态下保存，操作和保存都极为方便。即使是用其它材料形成固定层的情况，与使用自由水溶液的上述情况相比较，操作和保存也都极为方便。从而，可构成适用于例如任意形式的临床检查等。特别是，通过尽可能地减少固定层的厚度，可提高氢离子浓度的变化率，提高敏感度。
下面表示使用H+-焦磷酸酶的焦磷酸检测传感器的另外结构的例子。
<焦磷酸检测传感器结构例1>
图7是示意性地表示焦磷酸检测传感器的一个结构例的断面图。与第一实施方式的不同之处在于用内部液体24充满氢离子敏感电极23的周围这一点，和在绝缘基板22上固定H+难透过性膜21使之覆盖住氢离子敏感电极23这一点。下面只说明与第一实施方式不同之处。
至于H+难透过性膜21的固定方法，只要H+难透过性膜21覆盖整个氢离子敏感电极23的表面，任何方法都可以，例如可以使用利用脂质体转录在SAM膜上的方法以及LB法。在被H+难透过性膜21分离的溶液保持部分32内区域中包含了氢离子敏感电极23的区域内，充满了内部液体24。
下面说明使用焦磷酸检测传感器38检测液体试样26中所含焦磷酸的方法及其原理。首先，液体试样容纳部33中装满液体试样26。液体试样26中含有焦磷酸时，由于H+-焦磷酸酶11的活性，使焦磷酸水解为磷酸，伴随着此过程，内部液体24中的氢离子浓度上升。通过使用氢离子敏感电极23测定此上升的情况，就能够检测液体试样26中焦磷酸的浓度。
对于内部液体24没有特别的限制，但在H+难透过性膜21中，含有焦磷酸活性部位暴露到氢离子敏感电极23一侧(内侧)区域中的'-焦磷酸酶时，内部液体24的焦磷酸浓度优选低于试样液体26的焦磷酸浓度，最优选内部液体24中不含焦磷酸。由此，就减少或终止了从内部液体24向试样液体26的氢离子输送，使从试样液体26向内部液体24的氢离子输送成为优势，使内部液体24的氢离子浓度的变化，大致被限定在由试样液体26中所含的焦磷酸所造成的浓度变化。从而，就能够正确地估计液体试样26所含的焦磷酸的量。
<焦磷酸检测传感器结构例2>
图8是示意性地表示焦磷酸检测传感器的一个结构例的断面图。只在H+难透过性膜21的固定方法上与上述结构例1不同。下面只说明与结构例1的不同之处。
本结构例的焦磷酸检测传感器39，其H+难透过性膜21通过链状的碳化物31被固定在绝缘基板22上。
<焦磷酸检测传感器结构例3>
图9是示意性地表示焦磷酸检测传感器的一个结构例的断面图。与上述结构例1的不同之处只是H+难透过性膜21的固定方法。下面只说明与结构例1的不同之处。
本结构例的焦磷酸检测传感器40，其H+难透过性膜21的两端被固定在持液部件25上。
<焦磷酸检测传感器结构例4>
图10是示意性地表示焦磷酸检测传感器一个结构例的断面图。本结构例的焦磷酸检测传感器41中，H+难透过性膜21被固定在绝缘基板22上形成的贯通孔上。H+难透过性膜21的内侧具备氢离子敏感电极23，外侧具备参比电极27。氢离子敏感电极23和参比电极27也可以在绝缘基板22上形成。内部液体24和液体试样26能够分别接触氢离子敏感电极23和参比电极27，而且都与H+难透过性膜21接触。H+-焦磷酸酶的方向性与第一实施方式相同。H+难透过性膜21固定在贯通孔上的方法，可以根据例如运用Langmuir-Blodgette法的公知方法进行(参照吉冈书店，冈田泰伸编《新パツチクランプ实验技术法》，p.214)。而在绝缘基板22上形成贯通孔或穴，以及在绝缘基板22上形成电极的方法，可通过例如，在硅基板上进行刻蚀的方法进行(参照特开2004-12215号公报)。
试样液体26中焦磷酸的检测方法及其原理与结构例1相同，省略说明。
(第六实施方式)
第六实施方式是使用本发明涉及的焦磷酸检测传感器检测具有特定序列的DNA的方法。
本实施方式中，首先，向含具有与目的DNA的序列互补序列的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核苷酸的反应体系中，供给试样。在此，所谓“反应体系”指的是如下所说明的实施一系列核酸延伸反应和此类反应的场所。在“反应体系”中存在着实施一系列反应所必需的成分。“反应体系”通常能够以在适当的溶剂(比如Tris-HCl缓冲液、通常在核酸延伸反应或核酸扩增反应中能够使用的任一缓冲液(包括市售的配套的缓冲液))中溶解上述成分形成的溶液的形式提供。DNA聚合酶可以是市售的，或者是可由专业人员配制的任意DNA聚合酶。优选使用Taq聚合酶，但并不限于此。脱氧核苷酸可以是各种脱氧核苷三磷酸(也称dNTP包括脱氧胞嘧啶三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧腺嘌呤三磷酸以及脱氧胸苷三磷酸)，通常是可作为DNA合成的直接初级粒子使用的物质。由此使DNA探针伸长，在此伴随着DNA探针的延伸反应生成焦磷酸。使用化学反应式1来说明此反应。
当此DNA探针与目的DNA进行杂交时，由于在反应体系中存在的DNA聚合酶，从反应体系中取出一个脱氧核苷酸(化学反应式1中的dNTP)进行伸长，生成一个焦磷酸分子。
DNA(n)+dNTP<＝>DNA(n+1)+PPi化学反应式1中，注脚n+1表示n个碱基的DNA探针延长为n+1个碱基。使用如上所述各个实施方式中的焦磷酸检测传感器检测如此生成的焦磷酸，就能够检测出液体试样中的具有特定序列的DNA。
具体说来，经过如上所述的(c)在上述任一焦磷酸检测传感器的液体试样容纳部33，使液体试样处于容纳状态的工序；(d)由焦磷酸检测传感器的测定机构对固定层的氢离子浓度变化进行电化学测定的工序；(e)基于工序(d)的测定结果检测DNA延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)的检测结果检测上述DNA的工序等各个工序，就能够检测具有特定序列的DNA。
在本实施方式中使用的DNA探针，设计成具有检测目的的DNA序列的互补序列。此DNA探针，当与作为检测目的的DNA序列杂交时，作为该DNA探针延长时的引物起作用。从而，DNA探针的长度要足够使其起着作为延伸反应的引物的作用。比如，可以是最少10个碱基，最少12个碱基，最少15个碱基，最少20个碱基和最少30个碱基的长度。考虑到能够充分进行杂交和引物延长，而且容易调制，优选20～25个碱基的长度。本发明中使用的DNA探针，只要能够与检测目的的DNA进行特异性杂交，并且起着使该DNA探针延长的引物的作用，可以是任意长度。
由于DNA探针与液体试样中的目的DNA进行特异性杂交，而且起着引物的作用，在已知被检测序列时，可以设计与此序列完全互补的序列，即，具有与序列中的碱基正确对应的序列(A-T或C-G对)。液体试样中不存在具有目的特定序列的DNA时，当然不会发生与DNA探针的杂交。因此，由于使用了本反应体系，无论要检测的序列是已知还是未知，都能够检测与此DNA探针完全互补的序列的存在与否。
杂交和延伸反应，可在进行DNA的杂交、由DNA聚合酶作用通过引物和脱氧核苷酸的延伸反应的任意条件下实施。DNA探针与目的DNA的杂交，例如，可以根据Sambrook等人在(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，第1～3卷，Cold Spring HarborLaboratory等实验说明书中所述的方法进行，本方法是本领域技术人员公知的。
反应体系中所含的DNA探针、聚合酶和脱氧核苷酸的量可以由专业人员适当地决定。
另外，如化学反应式1中所示，由于脱氧核苷酸一次延长就生成一个焦磷酸，如果具有目的特定序列的DNA和DNA探针两者的长度(碱基)是已知的，就能够定量地检测出具有目的特定序列的DNA。
并且，通过将化学反应式1的反应置换为PCR等核酸扩增反应，能够使试样中具有目的特定序列的DNA的量迅速增加。PCR扩增的方法，在该领域中是众所周知的(PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification，HA Erlich编，Freeman Press，NewYork，NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis，Gelfland，Snisky和White编，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Mattila等(1991)Nucleic Asids Res.194967；Eckert，K.A.和Kunkel，T.A.(1991)PCR Methods and Applications 117；PCR，McPherson，Quirkes和Taylor，IRL Press，Oxford)。通过使用PCR等核酸扩增反应，就能够检测出极微量的DNA。
(第七实施方式)本发明的第七实施方式是使用本发明涉及的焦磷酸检测传感器判别测定体系的DNA碱基种类的方法，更具体说是对SNP进行高速分类定型的方法。
用图11和图12来说明第七实施方式。图11表示，把检测作为目的的DNA和DNA探针中SNP部位一致时的反应体系；图12表示，把检测作为目的的DNA和DNA探针中SNP部位不一致时的反应体系。图11和图12中，1表示DNA探针、2表示具有目的特定序列的DNA、3a表示一致的SNP部位、3b表示不一致的SNP部位、4表示DNA聚合酶、5表示dNTP。
本实施方式中，首先向含有具有与目的DNA的序列互补的序列，而且3’终端是SNP部位的DNA探针1、DNA聚合酶4和脱氧核苷酸5的反应体系中供给试样。由此使DNA探针伸长，此时伴随着此DNA探针1的延伸反应，在这里生成焦磷酸。
本实施方式中使用的DNA探针1，可以设计成与目的序列互补，而且3’终端是SNP部位。本实施方式中，DNA探针1除了3’终端是SNP部位以外，可以设计成与上述第六实施方式相同。本实施方式中使用的DNA聚合酶4和脱氧核苷酸5，都可以与上述第六实施方式相同。本实施方式中的杂交和延长条件，也可以与上述第六实施方式相同。而本实施方式中的DNA探针，只要是能够对在SNP部位的碱基种类进行分类定型即可，并不限于如上所设计的探针。
液体试样中的目的DNA2和DNA探针1的碱基序列，当包括SNP部位完全互补时，该DNA探针1与目的DNA2就会杂交，而且作为该探针1进行进一步延长的引物起作用。此时，如图11中所示，由于反应体系中存在的DNA聚合酶，DNA探针上伸长1个脱氧核苷酸5，生成1个焦磷酸。另一方面，液体试样中目的DNA2和DNA探针1的碱基序列，在SNP部位不互补时(即使比如在其它部位是互补的)，DNA探针1能够与目的DNA进行杂交，但由于DNA探针1的3’终端不匹配，不能作为该探针1进行延长的引物起作用。此时，如图12中所示，即使在反应体系中存在有DNA聚合酶4和必要的脱氧核苷酸5，也不能发生化学反应式1的反应，不能生成焦磷酸。
由此，通过使用上述各实施方式中的焦磷酸检测传感器，检测液体试样中DNA延伸反应以后的焦磷酸，就能够对试样中具有目的特定序列的DNA2和DNA探针1，作出包括SNP部位完全一致的判断。如果在SNP部位使用最多4种探针1，就能够对试样中具有特定序列的DNA2的SNP，针对4种碱基进行分类定型。
不用说，已知SNP部位的碱基种类时，其分类定型就没有必要用4种探针。
使用上述各实施方式的焦磷酸检测传感器，检测DNA延伸反应以后液体试样中的焦磷酸，从而给SNP进行分类定型的方法，更具体说，包括(c)在上述各种焦磷酸检测传感器的液体试样容纳部33装满含有焦磷酸的上述液体试样的工序；(d)由焦磷酸检测传感器的测定机构对固定层的氢离子浓度变化进行电化学测量的工序；(e)基于工序(d)中的测定结果检测出DNA的上述延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)中的检测结果判别DNA碱基序列中的SNP部位的碱基种类。
本发明中使用的所谓“液体试样”指的是可以含有焦磷酸的各种液体试样。在第六和第七实施方式中，是可含有通过延伸反应可生成焦磷酸的DNA的液体试样。特别是涉及DNA检测的方法(第六或第七实施方式)中，“液体试样”可以来自含有目的DNA的任意被分析物。目的DNA与疾病相关时，这样的被分析物可以是罹患疾病的细胞、组织、器官或血液。当然，本发明的方法并不限定于临床用途，在所有的领域中都能够应用，因此，这样的被分析物可以是发现或确认有目的DNA存在的细胞、组织、器官或血液。DNA可以使用苯酚萃取法以及乙醇沉淀法等常用的方法从这些被分析物中取得。DNA的纯度对反应的效率会产生影响，DNA的精制程序也是本领域的技术人员公知的。
正如以上所说明的，按照本发明，提供了能够以高的敏感度、高速、且定量地测定焦磷酸的焦磷酸检测传感器，以及使用这种传感器的扩散检测方法和碱基种类的判别方法。
另外，按照本发明，能够通过测量伴随着DNA延伸反应所生成的焦磷酸，即使没有对试样中的目的DNA进行标识，也能够定量地测定有无目的核酸。特别是，能够以高的敏感度而且高速地测定目的SNP的分类定型。
(实施例1)本实施例制造涉及第四实施方式的焦磷酸检测传感器。
首先，按照Shizuo Yoshida等的方法(Masayoshi Maeshima andShizuo Yoshida.(1989)，J.Biol.Chem.264(33)，20068～20073)，在由来自绿豆的液胞膜13构成的膜小胞溶解于Tris/Mes缓冲液(浓度5mM，pH值7.0)、山梨糖醇(浓度0.25M)、DTT(浓度2mM)组成的溶液中，作为由含有H+-焦磷酸酶的液胞膜13构成的膜小胞悬浮液。
另外，将金电极(可极化电极81)浸入1mM正辛硫醇/乙醇溶液中，在室温下放置4h，在金电极表面上形成辛硫醇的SAM膜(固定层83)。然后，将辛硫醇修饰的电极浸入10mM的硫堇水溶液中，在室温下静置1h，将硫堇(介质82)固定在SAM膜之间。
在如此制造的硫堇/辛硫醇修饰电极上，通过滴下含有H+-焦磷酸酶的膜小胞悬浮液，在固定层83的表面固定H+-焦磷酸酶，构成H+-焦磷酸酶电极。为使各个焦磷酸钠的最终浓度为20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，将焦磷酸钠溶液与H+-焦磷酸酶接触，开始了由H+-焦磷酸酶进行的焦磷酸的加水分解反应。
得到的结果是，试样液体中焦磷酸钠的浓度与，使用银/氯化银电极作为参比电极27，施加200mV电位时金电极指示的电流值，几乎呈直线的关系。由此可知，按照本方法能够测定焦磷酸的量。
(实施例2)本实施例制造涉及第一实施方式的焦磷酸检测传感器。
首先，按照Masasuke Yoshida等的方法(MasaH.Sato，MasahikoKasahara，Noriyuki Ishii，Haruo Homareda，Hideo Matsui and MassasukeYoshida.(1994)J.Biol.Chem.269(9)，6725～6728)，从南瓜籽进行液胞膜H+-焦磷酸酶的精制。
另一方面，将0.1g聚乙烯醇缩丁醛树脂和1g己二胺溶解于二氯甲烷，在室温下搅拌溶液30min，滴在ISFET的栅电极(氢离子敏感电极)上，然后浸入5％的戊二醛中，在室温下放置24h。如此在ISFET电极上形成固定层51。然后，将形成了固定层51的ISFET电极(修饰ISFET电极)浸入5mg/mL的H+-焦磷酸酶溶液中，在4℃下静置24h，将H+-焦磷酸酶固定在ISFET栅电极上。对于这些H+-焦磷酸酶固定ISFET电极，为使各个焦磷酸钠最终浓度为20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，添加磷酸钠溶液，开始了由H+-焦磷酸酶进行的焦磷酸的加水分解反应。
得到的结果是，试样液体中焦磷酸钠的浓度与，使用银/氯化银电极作为参比电极27、在固定了H+-焦磷酸酶的ISFET电极的源-漏间施加4.0V的电压、保持源-漏间的电流为400μA时的栅电压值，几乎呈直线的关系。由此可知，按照本方法能够测定焦磷酸的量。
(实施例3)本实施例制造第五实施方式的焦磷酸检测传感器。
首先，与上述实施例2一样，精制来自南瓜籽的液胞膜H+-焦磷酸酶。
然后，将50mg/mL的上述液胞膜H+-焦磷酸酶、0.1M的吡咯、1M的氯化钾混合，得到电解聚合用混合液。将作为可极化电极81的铂电极和作为参比电极27的银/氯化银电极浸入此电解聚合用混合液中，在铂电极上施加+1V的恒电压6min，通过电解聚合得到H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修饰电极。对于如此得到的H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修饰电极，为使各个浓度为20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，添加焦磷酸钠溶液，开始了由H+-焦磷酸酶进行的加水分解反应。
得到的结果是，焦磷酸钠的浓度与，使用银/氯化银电极作为参比电极27、施加300mV电位时H+-焦磷酸酶固定化聚吡咯膜修饰电极显示的电流，几乎呈直线的关系。由此可知，按照本方法能够测定焦磷酸的量。
(实施例4)在本实施例中，进行试样中λDNA(λDNA的全碱基序列参照GenBan数据库的Accession No.V00636、J02459、M17233、X00906)的检测。
首先，准备以10ng/μL的浓度将λDNA(宝酒造(株)制造)溶解在蒸馏水中的液体试样26A，以及只由蒸馏水组成的液体试样26B。另外，再准备如图13A中所示的，与λDNA的特定碱基序列完全杂交得到的两种引物C(序列号1)和引物D(序列号2)分别溶解于蒸馏水得到的引物溶液E和F(各自都是20μM)。
在上述液体试样26A和26B中分别添加TaKaRa La Taq(5U/μL，宝酒造(株)制造)、TaKaRa La Taq的专用缓冲液2×GC缓冲液I(宝酒造(株)制造)、dNTP混合物(各浓度2.5mM，宝酒造(株)制造)，同时添加引物溶液E和F，配制出组成如图13B所示的PCR反应液G和H。
然后，分别对PCR反应液G和H，在图13C所示的反应温度条件下进行PCR反应。
PCR反应结束之后，用上述实施例1中所述的H+-焦磷酸酶电极，用与实施例1相同的银/氯化银电极作为参比电极，对PCR反应液G和H分别测定施加200mV电位时的电流，此时，PCR反应液G的电流值明显地大于PCR反应液H的电流值。即，可知在PCR反应液G中进行了引物的延伸反应。从而可知，按照本方法能够检测目的核酸。
(实施例5)在本实施例中，讨论将λDNA的碱基序列中的某个碱基人为地置换为其它的碱基制作成变异λDNA时，能不能判断出通常的λDNA和变异的λDNA。
首先，用λDNA(宝酒造(株)制造)(序列号3)制造变异型λDNA(序列号4)。变异型λDNA是用本领域技术人员公知的方法将λDNA(下面将通常的λDNA记为野生型λDNA)的两根λDNA序列中存在的GC碱基对(图中的区域R1)人为地置换为AT碱基对(图中的区域R2)。
然后，分别将野生型λDNA和变异型λDNA溶解于蒸馏水，使得最终浓度为10ng/μL，成为野生型λDNA液和变异型λDNA液。
然后，为了判断上述碱基的不同，准备如图14A所示的分类定型引物(序列号5)。接着，将分类定型引物溶解于蒸馏水使其最终浓度为20μM，调制出分类定型引物溶液。
在图14A中所示的分类定型引物与野生型λDNA的下段中记述的单链λDNA完全杂交。但是，此分类定型引物，其终端3’的G与变异λDNA的下段中记述的单链λDNA不能杂交。因此，在使用这样的分类定型引物进行引物的延伸反应时，在野生型λDNA的情况下能够进行良好的反应，但在变异型λDNA的情况下就不怎么进行反应。
此外，再准备上述实施例4中使用的引物溶液F。
然后，对野生型λDNA液和变异型λDNA液，分别使用TaKaRaTaq(5U/μL，宝酒造(株)制造)、TaKaRa Taq专用的10×PCR缓冲液(宝酒造(株)制造)、dNTP混合物(各浓度2.5mM，宝酒造(株)制造)以及分类定型引物溶液和引物溶液F，调制出如图14B中所示组成的PCR反应液I和J。
然后，在PCR反应液I和J中，分别在如图14C中所示的反应温度条件下进行PCR反应。
PCR反应结束后，将各PCR反应液导入固定H+-焦磷酸酶的修饰的ISFET电极中。修饰的ISFET电极与在上述实施例2中使用的是同样的。
使用此修饰ISFET电极，与实施例2同样用银/氯化银电极作为参比电极，在H+-焦磷酸酶固定的ISFET电极的源-漏之间施加4.0V的电压，测定保持源-漏间电流值400μA时的栅电压，其结果，PCR反应液I的电压值明显大于PCR反应液J的电压值。即，可知在PCR反应液I中进行了引物延伸反应。这可以认为是在反应液J中没有发生延伸反应，但在含有变异型λDNA的延伸反应液I中，由dATP引起了一个碱基的延伸反应，结果，生成的焦磷酸与修饰ISFET电极上的H+-焦磷酸酶反应，将氢离子输送到修饰ISFET电极处。
由此可知按照本实施例能够辨别出DNA特定碱基序列中一个碱基对的不同。这就是说，本实施例表明本发明的方法对于判断SNP部位的碱基种类、由突变产生的一个碱基对的变异等、判别特定碱基序列都非常有效。
通过上面的说明，本领域的技术人员可以明了对本发明的许多改良或其它的实施方式。因此，上面的说明都只是作为例子进行的解释，目的是向本领域技术人员显示出本发明的具体实施方式
。只要不偏离本发明的精神，可对其结构和/或功能的细节进行实质性的变更。
产业上的可利用性本发明涉及的焦磷酸检测传感器，可用来判别比如SNP部位的碱基种类，因此可用于基于SNP分类定型进行给药的特制医疗。而涉及本发明的焦磷酸检测传感器，可用于DNA碱基序列中突变的解析，能够将相关解析的结果用于药物研发和临床。
特别是，本发明涉及的焦磷酸检测传感器可用于检测具有特定碱基序列的核酸，而核酸的检测，在遗传病的诊断、检查被细菌或病毒等污染的食品，以及检查对人体的感染等方面都是有用的。
序列号1的<223>引物序列号2的<223>引物序列号3的<223>双链DNA序列号4的<223>双链DNA序列号5的<223>引物序列表<110>松下电器产业株式会社<120>焦磷酸检测传感器、核酸的检测方法以及碱基种类的判断方法<130>04P540WO<150>JP2003-190121<151>2003-07-02<160>5<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1gatgagttcg tgtccgtaca actgg 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaatcacggt atccggctgc gctga 25<210>3<211>24<212>DNA<213>λ噬菌体<220>
<223>双链DNA<400>3
gatgagttcg tgtccgtaca actg24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221)突变<222>24<223>双链DNA<400>4gatgagttcg tgtccgtaca acta24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gatgagttcg tgtccgtaca actg2权利要求
1.一种检测试样液体中的焦磷酸的焦磷酸检测传感器，其特征在于，具备容纳所述试样液体的试样液体容纳部；具有H+-焦磷酸酶的H+难透过性膜；固定所述H+难透过性膜的固定层；测定伴随着所述固定层中的氢离子浓度变化的电化学变化的测定机构，所述H+-焦磷酸酶被配置成使所述液体试样中的焦磷酸水解，并伴随着此反应引起固定层的氢离子浓度的变化。
2.如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述固定层将H+难透过性膜固定在其上面或内部。
3.如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述H+难透过性膜是一种膜小胞，所述固定层将所述H+难透过性膜固定在其内部。
4.如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述测定机构具有，与所述固定层接触的氢离子敏感电极，和配置成在容纳所述液体试样的状态下与所述液体试样接触的参比电极。
5.如权利要求4所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述测定机构测定所述氢离子敏感电极与所述参比电极之间的电位差的变化。
6.如权利要求4所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述固定层由高分子凝胶或自组织单分子膜构成。
7.如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述固定层含有因氢离子浓度的变化发生氧化还原反应的材料；所述测定机构具有，与所述固定层接触的可极化电极，和配置成在容纳所述液体试样的状态下与所述液体试样接触的参比电极。
8.如权利要求7所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述测定机构测定所述可极化电极与所述参比电极之间的电流的变化。
9.如权利要求7所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述固定层由含有因氢离子浓度的变化发生氧化还原反应的介质的高分子凝胶或自组织单分子膜构成，所述H+难透过性膜就固定在其上面。
10.如权利要求7所述的焦磷酸检测传感器，其特征在于所述固定层由因氢离子浓度的变化发生氧化还原反应的电解聚合材料构成。
11.使用如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器检测具有特定碱基序列的核酸的检测方法，该方法包括如下工序(a)调制含有试样、具有包括与所述核酸互补结合的互补结合区的碱基序列的引物、和核苷酸的液体试样的工序；(b)把所述液体试样置于发生所述引物的延伸反应的条件下，发生所述延伸反应时生成焦磷酸的工序；(c)在所述焦磷酸检测传感器的所述液体试样容纳部使所述液体试样处于被容纳状态的工序；(d)由所述焦磷酸检测传感器的所述测定机构，测定伴随着所述固定层的氢离子浓度变化所发生的电化学变化的工序；(e)基于工序(d)的测定结果检测所述延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)的检测结果检测所述核酸的工序。
12.使用如权利要求1所述的焦磷酸检测传感器判别核酸的碱基序列中的碱基种类的方法，该方法包括如下工序(a)调制含有核酸、具有包括与所述核酸互补结合的互补结合区的碱基序列的引物和、核苷酸的液体试样的工序；(b)把所述液体试样置于发生所述引物的延伸反应的条件下，发生所述延伸反应时生成焦磷酸的工序；(c)在所述焦磷酸检测传感器的所述液体试样容纳部使所述液体试样处于被容纳状态的工序；(d)由所述焦磷酸检测传感器的所述测定机构，测定伴随着所述固定层的氢离子浓度变化所发生的电化学变化的工序；(e)基于工序(d)的测定结果检测所述延伸反应的工序；以及(f)基于工序(e)的检测结果判别所述核酸的碱基序列中的碱基种类的工序。
全文摘要
本发明是一种检测液体试样中焦磷酸的焦磷酸检测传感器，该传感器的结构具备容纳所述试样液体的试样液体容纳部、具有H
文档编号G01N27/403GK1705878SQ20048000134
公开日2005年12月7日 申请日期2004年7月2日 优先权日2003年7月2日
发明者行政哲男, 夜久英信, 冈弘章, 池田信, 中南贵裕 申请人:松下电器产业株式会社