专利名称：单个核细胞人白细胞抗原a或b检测移植病人免疫状态的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、免疫学检测方法，特别涉及单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法。
背景技术：
随着医学领域科学技术的进步，能够移植的脏器不断增加，随之进行脏器移植的病人越来越多。脏器移植病人的免疫状态决定移植的成功与否及合并症是否发生，当病人出现排斥反应时应能及时处理，否则易导致移植失败，药物用量过小不能达到控制排斥反应的目的，如果药物用量过大，则易使免疫抑制过度，细菌病毒感染，肿瘤发生。而目前尚未有能够准确检测脏器移植病人免疫状态的任何方法，因此，脏器移植的病人所有抗免疫抗排斥的用药量，均是根据估值或经验确定，无法根据病人的自身情况准确确定用药量。在目前这种状态下，直接影响脏器移植的成功率、移植后病人的寿命及病人身体的健康状况等。
发明内容
本发明的目的是提供一种单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，它可以通过检测脏器移植病人的外周血单个核细胞人白细胞抗原A或B的信使核糖核酸表达强度，以达到根据该强度的高低，确定病人用药量，以此提高脏器移植的成功率及病人的身体健康状况等。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案来实现单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，对人白细胞抗原A或人白细胞抗原B特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CTACCCTGCGGAGATCAC-3’，下游引物5’-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3’，或人白细胞抗原B的上游引物5’-CACACTGACCTGGCAGCGGGAT-3’；下游引物5’-AGAGCCCTGGGCACTGTCGCT-3’，进行一步法—管扩增体系，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系20-30ul，其中逆转录酶0.2-1.5ul，耐热扩增酶0.1-0.4ul，脱氧核苷酸0.1-0.5ul，氯化镁1-4ul，缓冲液1-6ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水，目的片段人白细胞抗原A的上下游引物或人白细胞抗原B的上下游引物各0.4-2ul，以β-肌动蛋白作为内参照，上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各0.1-1ul，模板核糖核酸4-20ul，多聚酶链反应仪反应参数为40-42℃ 20-40min，90-96℃ 2-5min，90-96℃ 0.5-3min，52-60℃ 0.5-3min，70-75℃ 0.5-3min，3-10个循环；90-96℃ 5-30sec，60-65℃ 10-60sec，30-45个循环，70-75℃ 3-15min，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原A或人白细胞抗原B信使核糖核酸表达强度的高低。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其一步法—管扩增体系中各参数可以是，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系25ul，其中逆转录酶1ul、耐热扩增酶0.2ul，脱氧核苷酸0.2ul，氯化镁2.5ul，缓冲液2.5ul，其余是去核糖核酸酶的双蒸水，多聚酶链反应仪反应参数为42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，57℃1min，72℃ 1min，5个循环；94℃ 10sec，62℃ 30sec，33个循环，72℃ 5min。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-AGAACCAGGCCAGCAATG-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-ACCAGGCCAGCAATGATG-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3’，下游引物5’-TCACGGCAGCGACCACAG-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CCCATCTCTGACCATGAG-3’，下游引物5’-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出入白细胞抗原B的上游引物5’-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3’，下游引物5’-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3’，下游引物5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’。
所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3’，下游引物5’-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3’。
本发明的积极效果在于为脏器移植病人免疫状态的强弱提供了一种准确的检测方法，使医生可以根据脏器移植病人自身的免疫状态确定抗排斥的药量，从而避免了因用药量过大或过小产生的移植失败、细菌病毒感染、肿瘤发生等严重后果。采用本发明的检测方法，能够准确掌握脏器移植病人免疫状态的强弱，提高脏器移植成功率及病人的身体健康状况。
具体实施例方式
本发明的检测方法如下首先取外周血淋巴细胞(PBL)进行分离无菌抽取移植病人外周血2ml，EDTA-K2防凝。3000rpm/min离心10min(普通离心机)，4小时内完成。
以无菌吸管仔细吸取白细胞层，稀释后缓慢加入盛有2ml淋巴细胞分离液的无菌管中，3000rpm/min离心25min(普通离心机)。
以无菌吸管小心吸取单个核细胞至一灭菌Ependoff管中，5000rpm/min离心4min(普通离心机)吸弃上清液(-80℃可长期保存)。
对淋巴细胞总模板核糖核酸(RNA)进行提取，(以下均为冰上操作，所有器材预先用去核糖核酸酶的双蒸水处理)取出冻存的淋巴细胞加入50ulTE溶解沉淀，然后加入150ul白细胞裂解液(深圳匹基生物公司生产)，反复吹打至细胞完全裂解。在裂解的细胞混合液中加入50ul氯仿抽提RNA，冰浴5-7min，15000rpm/min离心10min(高速冷冻离心机)。
离心后可见混合液分为三层，吸取最上层无色水相，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，-20℃放置20-60min，13000rpm/min离心10min(4℃，高速冷冻离心机)。
弃去上清液(注意离心方向)，加入300ul预致冷的75％乙醇(去核糖核酸酶的双蒸水配制)，13000rpm/min(4℃，高速冷冻离心机)离心10min去盐，轻弃上清(注意离心方向)，吸水纸上吸干。
13000rpm/min离心(高速冷冻离心机)10秒钟，将管壁残余液体甩至底部，以无菌吸头吸干残液，加入适量的去核糖核酸酶的双蒸水溶解RNA。
对外周血淋巴细胞总RNA进行鉴定提取的外周血淋巴细胞总RNA，在UA-2450紫外分光光度计上测定260nm和280nm波长下RNA的吸光度，将提取的RNA在1.5％低熔点琼脂糖凝胶变性电泳，可见5s，18s，28s三条清晰条带，表明所提RNA浓度较纯，且RNA完整无裂解，可用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
选取人白细胞抗原A(HLA-A)或人白细胞抗原B(HLA-B)特异性引物提取的RNA以不同的引物，即人白细胞抗原A上游引物5’-CTACCCTGCGGAGATCAC-3’，下游引物5’-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3’，这是本发明方法人白细胞抗原A较好的一对引物，以下各对引物均可等同使用，并可达到本发明所述的检测效果，上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-AGAACCAGGCCAGCAATG-3’。或上游引物5’-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3’，下游引物5’-TCACGGCAGCGACCACAG-3’。或上游引物5’-CCCATCTCTGACCATGAG-3’，下游引物5’-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3’。本发明人白细胞抗原B的特异性引物即上游引物5’-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3’，下游引物5’-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3’，这是本发明方法人白细胞抗原B中较好的一对引物，以下各对引物均可达到本发明所述检测效果。或上游引物5’-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3’，下游引物5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’，或上游引物5’-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3’，下游引物5’-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3’，组合置于RT-PCR反应体系中扩增，扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳，筛选与预期279bp片段相吻合的特异性引物。
采用一步法—管扩增体系以β-肌动蛋白作为内参照，反应体系25ul，其中逆转录酶1ul，耐热扩增酶0.2ul、脱氧核苷酸0.2ul、氯化镁2.5ul，缓冲液2.5ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水。
目的片段人白细胞抗原A或人白细胞抗原B的上下游引物各1ul，内参照以上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各0.3ulRNA10ul多聚酶链反应仪的反应参数42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，5个循环；94℃ 10sec，62℃ 30sec，33个循环，72℃ 5min。
或以β-肌动蛋白作为内参照，反应体系20ul，其中逆转录酶0.2ul，耐热扩增酶0.1ul、脱氧核苷酸0.1ul、氯化镁1ul，缓冲液1ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水。
目的片段人白细胞抗原A或人白细胞抗原B的上下游引物各0.4ul内参照以上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各1ulRNA10ul，多聚酶链反应仪的反应参数40℃ 20min，90℃ 2min，90℃ 0.5min，52℃ 0.5min，70℃ 0.5min，3个循环；90℃ 5sec，60℃ 10sec，30个循环，70℃ 3min。
或以β-肌动蛋白作为内参照，反应体系30ul，其中逆转录酶0.5ul，耐热扩增酶0.4ul、脱氧核苷酸1.5ul、氯化镁4ul，缓冲液6ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水。
目的片段人白细胞抗原A或人白细胞抗原B上下游引物各2ul，内参照上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各1ul，RNA20ul，多聚酶链反应仪的反应参数42℃ 40min，96℃ 5min，96℃3min，60℃ 3min，75℃ 3min，10个循环；96℃ 30sec，65℃60sec，45个循环，75℃ 15min。
将上述扩增产物进行电泳扫描及序列分析多聚酶链反应扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统上扫描分析。HLA-A或HLA-B互补脱氧核糖核酸在全自动测序抗原仪上测序，并用Blastn服务器对序列进行查询和比较。采用与本发明上述引物相对应的荧光探针检测HLA-A或HLA-B信使核糖核酸表达强度，这个强度的高低，与脏器移植病人免疫状态相对应，以此确定脏器移植病人免疫状态的强弱，为抗排斥用药量提供了准确的依据。
权利要求
1.单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，其特征在于对人白细胞抗原A或人白细胞抗原B特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CTACCCTGCGGAGATCAC-3’，下游引物5’-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3’，或人白细胞抗原B的上游引物5’-CACACTGACCTGGCAGCGGGAT-3’；下游引物5’-AGAGCCCTGGGCACTGTCGCT-3’，然后进行一步法一管扩增体系，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系20-30ul，其中逆转录酶0.2-1.5ul，耐热扩增酶0.1-0.4ul，脱氧核苷酸0.1-0.5ul，氯化镁1-4ul，缓冲液1-6ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水，目的片段人白细胞抗原A的上下游引物或人白细胞抗原B的上下游引物各0.4-2ul，内参照上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各01.-1ul，模板核糖核酸4-20ul，多聚酶链反应仪反应参数为40-42℃20-40min，90-96℃2-5min，90-96℃0.5-3min，52-60℃0.5-3min，70-75℃0.5-3min，3-10个循环；90-96℃5-30sec，60-65℃10-60sec，30-45个循环，70-75℃3-15min，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原A或人白细胞抗原B信使核糖核酸表达强度的高低。
2.根据权利要求1所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于一步法-管扩增体系中各参数是，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系25ul，其中逆转录酶1ul、耐热扩增酶0.2ul，脱氧核苷酸0.2ul，氯化镁2.5ul，缓冲液2.5ul，其余是去核糖核酸酶的双蒸水，多聚酶链反应仪反应参数为42℃30min，95℃3min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，5个循环；94℃10sec，62℃30sec，33个循环，72℃5min。
3.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-AGAACCAGGCCAGCAATG-3’。
4.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-ACCAGGCCAGCAATGATG-3’。
5.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3’，下游引物5’-TCACGGCAGCGACCACAG-3’。
6.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CCCATCTCTGACCATGAG-3’，下游引物5’-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3’。
7.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3’，下游引物5’-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3’。
8.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3’，下游引物5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’。
9.根据权利要求1或2所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其特征在于对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3’，下游引物5’-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3’。
全文摘要
本发明公开了一种单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，对人白细胞抗原A或人白细胞抗原B特异性引物进行筛选，然后进行一步法一管扩增体系，以上、下游引物作为内参照，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原A或人白细胞抗原B抗原表达强度的高低。它可以通过检测脏器移植病人的外周血单个核细胞人白细胞抗原A或B的抗原表达强度，以达到根据该强度的高低，确定病人用药量，以此提高脏器移植的成功率及病人的身体健康状况等。
文档编号G01N33/53GK1710423SQ20041007585
公开日2005年12月21日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者邹雄, 张义, 杨晓静, 秦绪珍, 庄学伟, 单宁宁, 王洪春 申请人:山东大学齐鲁医院