专利名称：谷物蛋白质含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种谷物蛋白质含量的检测方法，尤其是一种基于双缩脲法和计算机色度识别软件的谷物蛋白质含量的检测方法。
背景技术：
目前，谷物蛋白质含量是决定谷物食用品质与营养品质的重要指标，在我国2002年开始实施的NY/T 593-2002《食用稻品种品质》标准中，该参数被列为评定等级的指标之一。针对稻米蛋白质含量的测定，国家颁布了两个检测方法标准，GB 2905-82《谷类、豆类作物种子粗蛋白测定法》和GB5511-85《粮食、油料检验粗蛋白质测定法》，农业部在NY/T 593-2002《食用稻品种品质》标准中规定的检测方法NY/T 3-1982即为原GB 2905-82《谷类、豆类作物种子粗蛋白测定法》。这些方法的原理均为凯氏定氮原理，即待测样品加浓硫酸或消化液消化，使蛋白质和其他含氮物中的氮变成氨，同时与过量硫酸化合成硫酸铵，再加碱将氨蒸馏出来，用硼酸溶液吸收后，用中和滴定法测定总氮量，最后根据相应的系数换算为蛋白质含量。这种现行的蛋白质含量的测定方法步骤繁琐、操作复杂，需要配备较多的仪器与设备；且由于检测时间长，接触的药品试剂具有较高危险性，测定过程中亦会产生大量有毒气体，对测定环境的设置和操作人员的实验技能均有较高要求，限制了其在更广泛的场所得到方便的应用，只适合于在环境条件良好，技术装备精良的实验室中由专业实验技术人员完成。
双缩脲法是一种常见的蛋白质含量的测定方法，其原理为蛋白质的肽键(与缩二脲结构相似)在碱性溶液中与二价铜离子形成兰紫色的络合物，在一定范围内(1～15mg蛋白质)，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。利用双缩脲法测定蛋白质含量，操作快速简便、需用仪器设备少且对测定环境要求低；但目前主要用于液态样品(如乳制品)中蛋白质含量的测定，测定固体粉末状样品时，测量的结果精度较低，因而没有广泛的应用在固体粉末状样品的测定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提出一种谷物蛋白质含量的检测方法，测量精度高，操作快速简便，需用仪器设备少，成本低，对测定环境要求低，可适用于多类谷物蛋白质含量的检测，应用范围广。
本发明是通过如下的技术方案实现的本发明将现代色度学原理与双缩脲法有机结合，利用蛋白质与双缩脲试剂形成兰紫色的络合物，不同蛋白质含量的样品，在碱性条件下与双缩脲试剂生成深浅不同的兰紫色溶液，其色度值与蛋白质含量高度相关的原理，可以获得与通过分光光度计测定吸光度值，计算蛋白质含量的改良双缩脲法相同的检测精度。本发明具体的步骤如下步骤一配制显色反应所用的双缩脲试剂；步骤二分别称取已知蛋白质含量的大米标准样品与待测大米样品；步骤三制备标准样品和待测样品的显色液，具体过程为向大米标准样品与待测大米样品中分别加入0.05M的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、按步骤一方法制取的双缩脲试剂，其中，样品与氢氧化钾或氢氧化钠溶液、双缩脲试剂的用量比为0.5g10毫升40毫升，将混合后的溶液混匀，振荡后静置，使样品充分反应显色；其中加入的10毫升0.05M的氢氧化钾或氢氧化钠溶液主要为显色液提供一个碱性的反应环境，并促进米粉中蛋白的溶解。
步骤四将稳定显色后的标准样品显色液和待测样品显色液分别移取至位于图像采集器上的比色池中，采集原始图像信息；步骤五利用基于计算机色度识别的蛋白质含量测定软件系统，读出采集的原始图像信息，比较待测样品显色液与标准样品显色液色度值，得出待测样品的蛋白质含量。
在每1000毫升步骤一配制的双缩脲试剂中，含有0.01摩尔的氢氧化钾或氢氧化钠、5克酒石酸钾钠和1.2克五水硫酸铜。其中，酒石酸钾钠为稳定剂，用于使制得的双缩脲试剂性状稳定，其配制的具体过程为步骤11配制10M的氢氧化钾溶液、25％的酒石酸钾钠溶液和4％的CuSO4·5H2O溶液；步骤12在蒸馏水中以体积比为1∶2∶3的比例加入氢氧化钾溶液10毫升、酒石酸钾钠溶液20毫升、硫酸铜溶液30毫升；步骤13将溶液定量移至1000毫升容量瓶中，加蒸馏水定容，得到所需的双缩脲试剂。
所述的步骤二中待测样品的称取过程为先将待测样品粉碎；而后过100目筛，取筛下物作为待测样品。
为了消除某些类脂色素物质对显色的干扰，在所述的步骤三制备标准样品和待测样品的显色液过程中，在向标准样品和待测样品中加入氢氧化钾或氢氧化钠溶液和双缩脲试剂之前，加入1毫升四氯化碳。
所述的步骤四中显色液的具体移取过程为取充分显色完毕的显色液20-30毫升置入离心管，并安放到离心机上进行分离，取离心后的上清液3-6毫升，移取至位于图像采集器上的比色池中。
所述的步骤五的具体过程为步骤51计算机读取图像采集器采集到的原始图像信息，利用该信息，通过蛋白质含量测定软件系统创建图像的色度值表；步骤52输入标准样的蛋白质含量；步骤53蛋白质含量测定软件系统利用标准样品的色度值和蛋白质含量自动求解色度值与蛋白质含量关系的回归方程；步骤54蛋白质含量测定软件系统根据被测样品的色度值用回归方程计算出蛋白质含量；步骤55蛋白质含量测定软件系统输出蛋白质含量，并根据需要打印输出。
其中，步骤53中求解色度值与蛋白质含量关系的回归方程的方法为最小二乘法。
以上所述的图像采集器为扫描仪。
需要说明的是，双缩脲试剂的配制方法并不唯一，但总而言之，双缩脲试剂就是碱性硫酸铜，其碱性环境由碱液提供，常用的为氢氧化钾或氢氧化钠。针对不同的被测样品，双缩脲试剂中的成份含量略有不同。
本方法基于双缩脲反应原理，继承了传统双缩脲法操作简便快速、测定环境与条件要求低等优点；并由于改良了测定中标准曲线的制备使本发明在测定精度、测定时间、测定成本与操作步骤上得以进一步优化；利用普通的办公用计算机与扫描仪代替了实验室专用的精密仪器分光光度计，省去了双缩脲法中通过人工制作标准曲线和计算蛋白质含量的步骤，样品原始图像采集后信息参数的处理、蛋白质含量的计算以及结果的输出均由软件系统在计算机上自动完成，检测步骤大为简化，在保证检测精度的基础上又将测定的时间与成本进一步降低，尤其适用于稻米品质分级时的快速定级的实现。另外，与现行的标准方法繁琐复杂的操作步骤、造价较高的仪器设备、较为危险的操作环境及对测定环境和人员的高要求相比，本发明在秉承传统双缩脲法操作简便、成本低廉、测定安全的基础上，保证了检测精度，并进一步降低了检测在技术条件和环境条件方面的要求，使该指标的检测场所可以从现有的装备精良的实验室扩大到技术装备尚不够先进和完善的粮食检测场所，应用范围显著拓宽。针对于目前测定谷物蛋白质含量的标准方法均为基于凯氏定氮法的原理，本发明的测定原理同样适用于其他多类谷物中蛋白质含量的测定，对于谷物中蛋白质含量的测定提出了一种更加简便的方法。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明进行详细的说明。
首先，分别配制0.05M(摩尔浓度)的氢氧化钾溶液，10M的氢氧化钾溶液，25％的酒石酸钾钠溶液和4％的五水硫酸铜溶液；其次，配制双缩脲试剂，在约800毫升蒸馏水中加入10M氢氧化钾溶液10毫升和25％的酒石酸钾钠溶液20毫升，剧烈搅拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液约30毫升，将上述液体移入1000毫升容量瓶中，定容，即为双缩脲试剂。此试剂可长期使用，但应严密贮存，若有沉淀出现，则应重新配制。
然后，准确称取采用GB 2905-82标定的已知蛋白质含量的大米标准样0.5000±0.0002克大米标准样与若干个经粉碎过100目筛且干燥至恒重的待测样品0.5000±0.0002克，分别置于150毫升锥形瓶中。
而后，再分别向各瓶中加入1毫升四氯化碳和10毫升0.05M的氢氧化钾溶液，然后各加入40毫升双缩脲试剂，盖上瓶塞，在振荡器中震荡10分钟，再于室温下静置40分钟使之充分显色，得到标准样品和待测样品的显色液。
接下来，分别取标准样品和待测样品的适量显色液(约20毫升)倒入离心管中，在离心机上以3500转/分的速度离心10分钟，将完全澄清的上清液5毫升移入比色池中，依次置于扫描仪上，待液面平静后，启动扫描仪采集图像。
最后，在计算机中调用用于计算机色度识别的RQS1.0软件系统，读取所得原始图像的信息，处理所得图像，创建图像的色度值表；输入标准样品的蛋白质含量，软件系统利用标准样的色度值和蛋白质含量，用最小二乘法自动求解色度值与蛋白质含量关系的回归方程；然后，软件根据被测样品的色度值用回归方程计算蛋白质含量；软件系统输出蛋白质含量，并根据需要打印输出。
本发明所采用的测定蛋白质含量的软件系统RQS1.0还具有可同时完成垩白度、垩白粒率、整精米率、黄粒米、粒型及直链淀粉含量等指标检测的功能，使现行标准中彼此相对独立的多项指标的检测由一套系统一并完成。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤步骤一配制显色反应所用的双缩脲试剂；步骤二分别称取已知蛋白质含量的大米标准样品与待测大米样品；步骤三制备标准样品和待测样品的显色液，具体过程为向大米标准样品与待测大米样品中分别加入0.05M的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、按步骤一方法制取的双缩脲试剂，其中，样品与氢氧化钾或氢氧化钠溶液、双缩脲试剂的用量比为0.5g∶10毫升∶40毫升，将混合后的溶液混匀，振荡后静置，使样品充分反应显色；步骤四将稳定显色后的标准样品显色液和待测样品显色液分别移取至位于图像采集器上的比色池中，采集原始图像信息；步骤五利用基于计算机色度识别的蛋白质含量测定软件系统，读出采集的原始图像信息，比较待测样品显色液与标准样品显色液色度值，得出待测样品的蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于在每1000毫升所述的步骤一中的双缩脲试剂中，含有0.01摩尔的氢氧化钾或氢氧化钠、5克酒石酸钾钠和1.2克五水硫酸铜。
3.根据权利要求2所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的步骤一配制显色反应所用的双缩脲试剂的具体过程为步骤11配制10M的氢氧化钾溶液、25％的酒石酸钾钠溶液和4％的CuSO4·5H2O溶液；步骤12在蒸馏水中以体积比为1∶2∶3的比例加入氢氧化钾溶液10毫升、酒石酸钾钠溶液20毫升、硫酸铜溶液30毫升；步骤13将溶液定量移至1000毫升容量瓶中，加蒸馏水定容，得到所需的双缩脲试剂。
4.根据权利要求1所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的步骤二中待测样品的称取过程为先将待测样品粉碎；而后过100目筛，取筛下物作为待测样品。
5.根据权利要求1所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的步骤三制备标准样品和待测样品的显色液过程中，在向标准样品和待测样品中加入氢氧化钾或氢氧化钠溶液和双缩脲试剂之前，加入1毫升四氯化碳。
6.根据权利要求1所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的步骤四中显色液的具体移取过程为取充分显色完毕的显色液20-30毫升置入离心管，并安放到离心机上进行分离，取离心后的上清液3-6毫升，移取至位于图像采集器上的比色池中。
7.根据权利要求1所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的步骤五的具体过程为步骤51计算机读取图像采集器采集到的原始图像信息，利用该信息，通过蛋白质含量测定软件系统创建图像的色度值表；步骤52输入标准样的蛋白质含量；步骤53蛋白质含量测定软件系统利用标准样品的色度值和蛋白质含量自动求解色度值与蛋白质含量关系的回归方程；步骤54蛋白质含量测定软件系统根据被测样品的色度值用回归方程计算出蛋白质含量；步骤55蛋白质含量测定软件系统输出蛋白质含量，并根据需要打印输出。
8.根据权利要求6所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述步骤53中求解色度值与蛋白质含量关系的回归方程的方法为最小二乘法。
9.根据权利要求1或6或7或8所述的谷物蛋白质含量的检测方法，其特征在于所述的图像采集器为扫描仪。
全文摘要
本发明公开了一种谷物蛋白质含量的检测方法，包括配制显色反应所用的双缩脲试剂；称取已知蛋白质含量的大米标准样品与待测大米样品；制备标准样品和待测样品的显色液；将稳定显色后的标准样品显色液和待测样品显色液分别移取至位于图像采集器上的比色池中，采集原始图像信息；利用基于计算机色度识别的蛋白质含量测定软件系统，读出采集的原始图像信息，比较待测样品显色液与标准样品显色液色度值，得出待测样品的蛋白质含量。本发明测量精度高，操作快速简便，需用仪器设备少，成本低，对测定环境要求低，可适用于多类谷物蛋白质含量的检测，应用范围广。
文档编号G01N21/31GK1715883SQ20041004824
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月14日 优先权日2004年6月14日
发明者侯彩云, 孙建平, 常国华, 周小丰, 岳冉 申请人:中国农业大学