专利名称：马铃薯pvx、pvy、plrv、pvs病毒诊断试剂制作工艺方法
技术领域：
本发明涉及试剂，属于马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法。
背景技术：
马铃薯是我国主要的粮、菜作物和食品加工原料，全国栽培面积460万公顷，居世界首位。但产量水平较低(11吨/公顷)不仅低于世界单产(15.5吨/公顷)，更不及世界发达国家(30-50吨/公顷)。影响我国马铃薯产量的主要因素，是病毒病害，植物病毒为专性寄生物，只能在其寄主的活细胞内复制，马铃薯为营养体繁殖，病毒随马铃薯繁殖而逐年积累，导致马铃薯种性退化，研究证明马铃薯病毒引起马铃薯减产在30-35％。目前，在马铃薯作物上已经发现并报导的病毒和病毒病有25种以上，所幸只有少数病毒对马铃薯危害较重，通常复合侵染比某一种病毒单独侵染严重，马铃薯生产田中多数为复合侵染。本发明针对马铃薯生产中危害较重的病毒PVX、PVY、PVS和PLRV进行研究。
目前国际上对马铃薯病毒防治最佳办法是利用免疫血清技术汰除病株，结合茎尖脱毒、组织培养，生产脱毒马铃薯种薯。酶联(DAS-ELISA)法检测马铃薯病毒，因其具有快速、准确、灵敏的特点而为国际、国内普遍采用。
随着我国加入WTO，国产脱毒马铃薯生产受到威胁，植物检疫和病毒检测必须与国际接轨，全国马铃薯栽培面积460万公顷，种薯田30.7万公顷，按标准化生产要求1公顷检测200个样品计算，全国共检样6000万个，年需试剂盒60万个。进入WTO后，加之我国西部大开发战略的实施，因此急需大批量的高质量，低价格的国产马铃薯病毒抗血清。病毒血清是酶联检测中的关键内容，国际上利用免疫技术制备马铃薯病毒高效价血清检测试剂盒已有数年历史，但能够批量生产高质量马铃薯病毒血清的只有少数国家，所以价格较高，例如全球最大植物病害诊断试剂生产商——美国agdia公司每病毒500反应孔4200元；德国Loewe生化技术公司每病毒500反应孔4000元……我国早在20世纪80年代就开始了相关技术的研究，但存在试剂特异性差，检测流程复杂，种类不全等诸多问题，一直没能进行批量生产开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低廉，抗马铃薯病毒效果显著的马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法。本发明的目的是这样实现的病毒抗血清的制备如下实施路线(1)马铃薯病毒的指示植物是
表1 马铃薯主要病毒繁育植物
(2)毒源采集采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。
(3)马铃薯主要病毒的分离、繁殖将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。
将分离纯化的马铃薯病毒一部分低温贮存，作为日后试剂盒制备的病毒毒源繁殖病毒以供提纯用。
病毒分离PVX汁液摩擦接种，千日红——白花刺果曼陀罗——指尖椒——千日红——黄苗榆烟PVY汁液摩擦接种或蚜虫非持久性接种，洋酸浆——黄苗榆烟PVS蚜虫非持久性接种，千日红——毛曼陀罗——苋色藜——德伯尼烟PLRV蚜虫持久性接种，洋酸浆——白花刺果曼陀罗(4)马铃薯主要病毒的提纯以差速离心为基础，根据不同病毒特征，采用相应方法进行提纯。
1)几种病毒提纯路线PVX病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，离心3,000-4,000rpm，20min
↓ ↓弃沉淀上清，离心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓弃上清沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌60min，离心10,000rpm，20min↓ ↓上清4℃静止60min，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀↓ ↓弃上清 沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌120min，离心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓上清+提取液4℃过夜，离心10,000-12,000rpm，20min 弃沉淀↓ ↓上清40,000rpm离心90min弃沉淀↓↓弃上清 沉淀+提取缓冲液过夜↓纯病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液，三层纱布过滤，离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓弃沉淀 上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振荡离心7,800-8,000rpm，20min↓↓上清中加入4％PEG缓冲液，4℃振荡60min，弃沉淀室温下抚育60min，离心7,800-8,000rpm，20min↓↓沉淀用0.02M磷酸缓冲液悬浮，加入1％Triton X-100， 弃上清4℃过夜，离心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖垫层离心72，530rpm，150min 弃沉淀↓ ↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，0.01MEDTA，弃上清4℃螯合240min，离心5,100rpm，10min↓ ↓弃沉淀上清与氯化色混合密度梯度，离心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒带加入等体积磷酸缓冲液(含0.01MEDTA)↓↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液液氮研磨，室温下振荡过夜↓三层纱布过滤，滤液与氯仿(1∶1)乳化5分钟，离心9,600-12,000rpm，25min↓↓弃沉淀 上清中加入8％PEG缓冲液，室温下搅拌120min离心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸缓冲液，4℃过夜，离心6,200rpm，15min弃上清↓↓弃沉淀 上清离心11,290rpm，20min
↓ ↓上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min 弃沉淀↓ ↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心7,840rpm，10min 弃上清↓ ↓弃沉淀 上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min↓ ↓沉淀+磷酸缓冲液，4℃过夜，离心5,000rpm，10min弃上清↓↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心164,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓弃沉淀蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PVS 病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，三层纱布过滤，滤液离心5,000-6,000rpm，20min↓ ↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振荡 弃沉淀60min离心50,000rpm，10min↓ ↓弃上清 0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心10,000rpm，20min↓上清蔗糖垫层离心160,000rpm，180min↓↓弃上清0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心5,100rpm，15min↓↓蔗糖密度梯度，离心100,000rpm，60min弃沉淀↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心5,100rpm，15min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min↓ ↓弃上清 沉淀磷酸缓冲液悬浮，离心5,100rpm，10min↓↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓纯病毒2)病毒浓度测定取各病毒提纯液用紫外分光光度计测得各病毒纯度，具体情况如下表。
紫外分光光度计测病毒量
(5)免疫家兔取各病度稀释后，用福氏佐剂与抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量为2ml，2ml，3ml。3周后每周耳颈脉取血20～30ml，测抗体浓度，抗体浓度降到最高峰一半时进行第二次注射。
1)注射试fruend’adguent+生理盐水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料离心管中倾斜30度角放置，室温下静止过夜(或60～120分钟，或冰浴30分钟)，用巴士德吸管从边缘剥离并取出析出血清(离心除去白细胞、红细胞、获得病毒抗血清)，血清用几个玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制备1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水饱和硫酸铵，混匀，室温静置30～45分钟，4℃条件下，8000转/秒，离心20分钟，弃上清，留沉淀，用1ml 0.5×PBS缓冲液回溶。4℃0.5×PBS缓冲液500～1000ml中透析，2小时换一次透析液，共换4次。
2)病毒球蛋白IgG浓度测定取球蛋白稀释200倍280nm下测吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml时OD280＝1.4[IgG]＝OD280×200/1.4
(7)免疫球蛋白IgG酶标记1)酶标记免疫球蛋白IgG-AP制备标记物碱性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG浓度1mg/ml。
1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混匀，室温放置2小时，4℃透析，透析步骤同上。
2)酶标记免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液体加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年。
(8)免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP质量测定
1)用已知成品免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP作对照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度的测定酶联法测定免疫球蛋白和酶标免疫球蛋白工作浓度，IgG用包被缓冲液稀释1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶标缓冲液稀释1/500，1/1000，DAS-ELISA法测定。确定IgG和IgG-AP的相应工作浓度。
本发明的试剂已应用于“农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨)”2003年和2004年农业部田间普查任务，以及一些地方农技推广中心及种子生产单位的病毒检测。因此，利用免疫技术制备马铃薯病毒抗血清检测试剂，具有深远的社会价值和巨大的经济价值，同时，对于完善我国马铃薯生产质量监控体系，开展病毒监督，提高我国马铃薯产量和质量，赢得国际市场，具有重大意义。
图1为本发明病毒抗血清的制备工艺流程图。
具体实施例方式病毒抗血清的制备如下病毒抗血清的制备如下实施路线(1)马铃薯病毒的指示植物是表1马铃薯主要病毒繁育植物
(2)毒源采集采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。
(3)马铃薯主要病毒的分离、繁殖将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。
将分离纯化的马铃薯病毒一部分低温贮存，作为日后试剂盒制备的病毒毒源繁殖病毒以供提纯用。
病毒分离PVX汁液摩擦接种，千日红——白花刺果曼陀罗——指尖椒——千日红——黄苗榆烟。
PVY汁液摩擦接种或蚜虫非持久性接种，洋酸浆——黄苗榆烟。
PVS蚜虫非持久性接种，千日红——毛曼陀罗——苋色藜——德伯尼烟。
PLRV蚜虫持久性接种，洋酸浆——白花刺果曼陀罗。
(4)马铃薯主要病毒的提纯以差速离心为基础，根据不同病毒特征，采用相应方法进行提纯。
1)几种病毒提纯路线PVX病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，离心3,000-4,000rpm，20min↓ ↓弃沉淀 上清，离心10,000-12,000rpm，20min↓↓弃上清沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌60min，离心10,000rpm，20min↓↓上清4℃静止60min，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀↓ ↓弃上清 沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌120min，离心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓上清+提取液4℃过夜，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀↓ ↓上清40,000rpm离心90min 弃沉淀↓↓
弃上清 沉淀+提取缓冲液过夜↓纯病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液，三层纱布过滤，离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓弃沉淀上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振荡离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓上清中加入4％PEG缓冲液，4℃振荡60min， 弃沉淀室温下抚育60min，离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓沉淀用0.02M磷酸缓冲液悬浮，加入1％Triton X-100， 弃上清4℃过夜，离心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖垫层离心72,530rpm，150min 弃沉淀↓ ↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，0.01MEDTA， 弃上清4℃螯合240min，离心5,100rpm，10min↓ ↓弃沉淀 上清与氯化色混合密度梯度，离心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒带加入等体积磷酸缓冲液(含0.01MEDTA)↓↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓
弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液液氮研磨，室温下振荡过夜↓三层纱布过滤，滤液与氯仿(1∶1)乳化5分钟，离心9,600-12,000rpm，25min↓ ↓弃沉淀 上清中加入8％PEG缓冲液，室温下搅拌120min离心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸缓冲液，4℃过夜，离心6,200rpm，15min 弃上清↓ ↓弃沉淀 上清离心11,290rpm，20min↓ ↓上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min 弃沉淀↓ ↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心7,840rpm，10min 弃上清↓ ↓弃沉淀 上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min↓↓沉淀+磷酸缓冲液，4℃过夜，离心5,000rpm，10min 弃上清↓ ↓弃沉淀蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心164,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓
弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，三层纱布过滤，滤液离心5,000-6,000rpm，20min↓↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振荡 弃沉淀60min离心50,000rpm，10min↓ ↓弃上清 0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心10,000rpm，20min↓上清蔗糖垫层离心160,000rpm，180min↓ ↓弃上清 0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心5,100rpm，15min↓↓蔗糖密度梯度，离心100,000rpm，60min 弃沉淀↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心5,100rpm，15min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min
↓ ↓弃上清 沉淀磷酸缓冲液悬浮，离心5,100rpm，10min↓↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓纯病毒2)病毒浓度测定取各病毒提纯液用紫外分光光度计测得各病毒纯度，具体情况如下表。
紫外分光光度计测病毒量
(5)免疫家兔取各病度稀释后，用福氏佐剂与抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量为2ml，2ml，3ml。3周后每周耳颈脉取血20～30ml，测抗体浓度，抗体浓度降到最高峰一半时进行第二次注射。
1)注射试fruend’adguent+生理盐水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料离心管中倾斜30度角放置，室温下静止过夜(或60～120分钟，或冰浴30分钟)，用巴士德吸管从边缘剥离并取出析出血清(离心除去白细胞、红细胞、获得病毒抗血清)，血清用几个玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。
(6)免疫球蛋白IgG制备1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水饱和硫酸铵，混匀，室温静置30～45分钟，4℃条件下，8000转/秒，离心20分钟，弃上清，留沉淀，用1ml 0.5×PBS缓冲液回溶。4℃0.5×PBS缓冲液500～1000ml中透析，2小时换一次透析液，共换4次。
2)病毒球蛋白IgG浓度测定取球蛋白稀释200倍280nm下测吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml时OD280＝1.4。
＝OD280×200/1.4
(7)免疫球蛋白IgG酶标记1)酶标记免疫球蛋白IgG-AP制备标记物碱性磷酸酶(AP)。
免疫球蛋白IgG浓度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混匀，室温放置2小时，4℃透析，透析步骤同上。
2)酶标记免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液体加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年。
(8)免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP质量测定1)用已知成品免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP作对照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度的测定酶联法测定免疫球蛋白和酶标免疫球蛋白工作浓度，IgG用包被缓冲液稀释1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶标缓冲液稀释1/500，1/1000，DAS-ELISA法测定。确定IgG和IgG-AP的相应工作浓度。
权利要求
1.一种马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法，其特征是病毒抗血清的制备如下第一步搜集病毒分离用的指示植物；第二步采集病毒毒源，鉴定病毒种类；第三步指示植物分离并纯化病毒；第四步指示植物病毒扩繁；第五步马铃薯主要病毒的提纯；第六步病毒提纯液免疫家兔获得抗血清；第七步抗血清免疫球蛋白(IgG)的提取与浓度测定；第八步抗血清免疫球蛋的酶标记；第九步马铃薯病毒检测灵敏度测试；第十步免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度测定；实施路线(1)马铃薯病毒的指示植物是表1 马铃薯主要病毒繁育植物
(2)毒源采集采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。(3)马铃薯主要病毒的分离、繁殖将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。将分离纯化的马铃薯病毒一部分低温贮存，作为日后试剂盒制备的病毒毒源繁殖病毒以供提纯用。病毒分离PVX汁液摩擦接种，千日红——白花刺果曼陀罗——指尖椒——千日红——黄苗榆烟PVY汁液摩擦接种或蚜虫非持久性接种，洋酸浆——黄苗榆烟PVS蚜虫非持久性接种，千日红——毛曼陀罗——苋色藜——德伯尼烟PLRV蚜虫持久性接种，洋酸浆——白花刺果曼陀罗(4)马铃薯主要病毒的提纯以差速离心为基础，根据不同病毒特征，采用相应方法进行提纯。1)几种病毒提纯路线PVX病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，离心3,000-4,000rpm，20min↓ ↓弃沉淀 上清，离心10,000-12,000rpm，20min↓ ↓弃上清 沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌60min，离心10,000rpm，20min↓↓上清4℃静止60min，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀↓ ↓弃上清沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌120min，离心10,000-12,000rpm，20min↓↓上清+提取液4℃过夜，离心10,000-12,000rpm，20min 弃沉淀↓ ↓上清40,000rpm离心90min 弃沉淀↓ ↓弃上清 沉淀+提取缓冲液过夜↓纯病毒pvy病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液，三层纱布过滤，离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓弃沉淀上清中加入1％Triton X-100，4℃，120min振荡离心7,800-8,000rpm，20min↓ ↓上清中加入4％PEG缓冲液，4℃振荡60min，弃沉淀室温下抚育60min，离心7,800-8,000rpm，20min↓↓沉淀用0.02M磷酸缓冲液悬浮，加入1％Triton X-100， 弃上清4℃过夜，离心5,100rpm，10min↓ ↓上清30％蔗糖垫层离心72,530rpm，150min 弃沉淀↓↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，0.01MEDTA， 弃上清4℃螯合240min，离心5,100rpm，10min↓ ↓弃沉淀 上清与氯化色混合密度梯度，离心128,000rpm，180min↓ ↓分布收集病毒带加入等体积磷酸缓冲液(含0.01MEDTA)↓↓弃上清磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PLRV病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液液氮研磨，室温下振荡过夜↓三层纱布过滤，滤液与氯仿(1∶1)乳化5分钟，离心9,600-12,000rpm，25min↓ ↓弃沉淀 上清中加入8％PEG缓冲液，室温下搅拌120min离心9,600-12,000rpm，45min↓ ↓沉淀中+0.01M磷酸缓冲液，4℃过夜，离心6,200rpm，15min 弃上清↓ ↓弃沉淀上清离心11,290rpm，20min↓ ↓上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min 弃沉淀↓ ↓磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心7,840rpm，10min 弃上清↓↓弃沉淀 上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min↓↓沉淀+磷酸缓冲液，4℃过夜，离心5,000rpm，10min 弃上清↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心164,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜↓纯病毒PVS病毒↓寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，三层纱布过滤，滤液离心5,000-6,000rpm，20min↓ ↓上清+4％PEG和1％Triton X-100，4℃振荡弃沉淀
60min离心50,000rpm，10min↓ ↓弃上清 0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心10,000rpm，20min↓上清蔗糖垫层离心160,000rpm，180min↓↓弃上清 0.05m磷酸缓冲液悬浮沉淀，离心5,100rpm，15min↓ ↓蔗糖密度梯度，离心100,000rpm，60min 弃沉淀↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min↓ ↓弃上清 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心5,100rpm，15min↓ ↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心102,700rpm，60min↓ ↓弃上清 沉淀磷酸缓冲液悬浮，离心5,100rpm，10min↓↓弃沉淀 蔗糖密度梯度，离心128,500rpm，40min↓纯病毒2)病毒浓度测定取各病毒提纯液用紫外分光光度计测得各病毒纯度，具体情况如下表。紫外分光光度计测病毒量
(5)免疫家兔取各病度稀释后，用福氏佐剂与抗原1∶1混合乳化免疫家兔，每周注射一次，共注射3次，注射量为2ml，2ml，3ml。3周后每周耳颈脉取血20～30ml，测抗体浓度，抗体浓度降到最高峰一半时进行第二次注射。1)注射试fruend’adguent+生理盐水+1mg/ml抗原2)提取血清取出的家兔粗血清塑料离心管中倾斜30度角放置，室温下静止过夜(或60～120分钟，或冰浴30分钟)，用巴士德吸管从边缘剥离并取出析出血清(离心除去白细胞、红细胞、获得病毒抗血清)，血清用几个玻璃管存放。一次取血可得病毒抗血清50ml左右。(6)免疫球蛋白IgG制备1)免疫球蛋白IgG提取1ml血清加9ml水加10ml水饱和硫酸铵，混匀，室温静置30～45分钟，4℃条件下，8000转/秒，离心20分钟，弃上清，留沉淀，用1ml0.5×PBS缓冲液回溶。4℃0.5×PBS缓冲液500～1000ml中透析，2小时换一次透析液，共换4次。2)病毒球蛋白IgG浓度测定取球蛋白稀释200倍280nm下测吸收值病毒球蛋白IgG1mg/ml时OD280＝1.4[IgG]＝OD280×200/1.4
(7)免疫球蛋白IgG酶标记1)酶标记免疫球蛋白IgG-AP制备标记物碱性磷酸酶(AP)免疫球蛋白IgG浓度1mg/ml1mg/ml IgG+24ml AP+2.6ul 25％戊二醛溶液混匀，室温放置2小时，4℃透析，透析步骤同上2)酶标记免疫球蛋白IgG-AP保存透析后液体加5mg牛血清白蛋白(BSA)，混合后放置4℃或-20℃保存半年～1年(8)免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP质量测定1)用已知成品免疫球蛋白IgG与酶标记免疫球蛋白IgG-AP作对照，IgGOK＝1∶1000，IgG-APOK＝1∶5002)免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度的测定酶联法测定免疫球蛋白和酶标免疫球蛋白工作浓度，IgG用包被缓冲液稀释1/500，1/1000，1/1500，1/2000；IgG-AP用酶标缓冲液稀释1/500，1/1000，DAS-ELISA法测定。确定IgG和IgG-AP的相应工作浓度。
全文摘要
本发明涉及试剂，属于马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法，其特点是采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。
文档编号G01N1/34GK1869698SQ200410044129
公开日2006年11月29日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者李学湛, 白艳菊, 吕典秋, 何云霞, 胡林双, 于德才, 张儒喜, 马纪 申请人:黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所