专利名称：一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液的利记博彩app
技术领域：
本发明属于一种显示髓过氧化物酶的工作液，更具体地说它是一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液。
背景技术：
髓过氧化物酶(MPO)染色对白血病的诊断和分型具有重要意义，应用广泛。FAB(France America Britian协作组)分型方案中，将髓过氧化物酶(MPO)阳性率＞3％作为诊断急性髓细胞性白血病(AML)的标准。目前MPO染色方法主要有Washburn联苯胺法及Pereira碘化钾(KI)法两种。
Washburn法MPO染色工作液由联苯胺溶液及稀H2O2溶液组成。因联苯胺具有潜在致癌作用，其方法已逐渐被淘汰。
Pereira原法中MPO染色工作液由缓冲溶液、碘化钾(KI)及显色剂Leishman’s染料组成，不加H2O2，但所用KI溶液需充分振摇使与空气充分接触，以获取足够的氧，因此所需的时间较长。
目前大多数学者采用改良的Pereira法，其MPO染色工作液由缓冲溶液、稀H2O2溶液、碘化钾(KI)溶液及显色剂组成。这种方法每次配制MPO染色工作液时需加H2O2，比较麻烦，操作步骤也复杂；同时若H2O2失效对MPO染色结果易产生影响。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术的不足之处而提供一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液。该工作液安全、稳定可靠、易于配制、操作简单、是理想的MPO染色工作液。
本发明的目的是通过如下措施来达到的一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，它由缓冲溶液、碘化钾溶液或含碘化钾的缓冲溶液、显色剂组成，所述显色剂是经人工预先氧化的显色剂。
在上述技术方案中，所述人工预先氧化的显色剂是经双氧水人工预先氧化成熟。
在上述技术方案中，所述的显色剂为吡啰红G(PyG)的甲醇溶液，吡啰红B(PyB)的甲醇溶液或乙醇溶液。
在上述技术方案中，所述显色剂可为下述物质中的一种①氧蒽酮染料类，特别是由氧蒽酮为母体的碱性染料；②灿烂甲酚蓝及其类似物；③以吩噻嗪为母体的碱性染料；④以吩嗪为母体的碱性染料；⑤三苯甲烷类碱性染料。
在上述技术方案中，所述显色剂可为亚甲蓝、罗丹明B、天青I、孔雀石绿、甲基绿、碘绿、乙基紫中的一种。
本发明具有如下优点(1)每次配制MPO染色工作液时不必再加H2O2，省去了需经常配制H2O2的麻烦，从而简化了操作步骤，(2)消除了因H2O2失效对MPO染色结果的影响，避免了假阴性结果的发生。(3)提高了试剂的稳定性及便于标准化，也增加了结果间的可比性。(4)试剂安全、稳定可靠、便于标准化、易于配制、操作简单、是理想的MPO染色方法。(5)成熟中性粒细胞染色时间为5～15秒即可，特别适合用于快速机检。
图1为正常骨髓涂片KI-PyB法MPO染色显微图，图2为急性髓细胞白血病外周血涂片KI-PyB法MPO染色显微图，图3、图4为急性髓细胞白血病骨髓涂片KI-PyB法MPO染色显微图，图5为正常骨髓涂片KI-PyG法MPO染色显微图，图6为急性髓细胞白血病外周血涂片KI-PyG法MPO染色显微图，图7、图8为急性髓细胞白血病骨髓涂片KI-PyG法MPO染色显微图，具体实施方式
经意外发现，在配制的0.5％PyB(50％乙醇为溶剂)溶液做MPO染色时出现过强阳性反应，经实验研究发现PyB是被自然氧化了。用此已自然氧化了的PyB溶液做MPO染色时，不需加H2O2。于是设想将适量H2O2加入到0.5％PyB(50％乙醇)溶液中，促使PyB溶液预先氧化而达到成熟。实验显示，只需一次性加入适量H2O2即可使PyB预先氧化成熟，其H2O2的量与正交试验所确定的最佳含量一致，而以后每次配制MPO工作液时都不必再加H2O2，也能很好的显示MPO。
进一步实验本组同时配制了加H2O2的PyG及PyB三种溶液，其溶剂分别为50％乙醇、50％甲醇及蒸馏水，以观察PyG及PyB的氧化成熟情况。1周后染色发现以50％甲醇为溶剂的PyG溶液被氧化成熟，达到了做MPO染色时不需加H2O2的目的，染色效果很满意；但以50％乙醇及蒸馏水为溶剂的PyG溶液却没有出现氧化，做MPO染色时仍需加H2O2。而以50％乙醇及50％甲醇为溶剂的PyB溶液均被氧化成熟，而以蒸馏水为溶剂的PyB溶液氧化较缓慢。因此配制PyG溶液必须以甲醇为溶剂，PyG才能被氧化；配制PyB溶液以乙醇及甲醇为溶剂为佳，也可用蒸馏水。甲醇、乙醇中的甲基、乙基或羟基可能参与了PyG及PyB溶液氧化成熟的反应过程或具有媒促反应的效果。
本KI-PyB法MPO染色阳性颗粒为鲜红色，KI-PyG法MPO染色阳性颗粒为棕黑色。所显示的MPO阳性反应，对比鲜明，易于判断，染色时间短，灵敏度高。试剂安全、稳定可靠、易于配制、操作简单，特别是不需加H2O2，消除了H2O2对染色结果的影响，避免了假阴性结果的发生。新鲜涂片通常染色30～60s即可达最佳，必要时可适当延长染色时间，但不必超过2min。成熟中性粒细胞染色时间为5～15s即可，特别适合用于快速机检。
经多次实验证明许多与PyG、PyB化学结构类似的化学物，特别是带有苯胺基结构的的化学物(试剂)，均可作为碘化钾法MPO染色的显色剂，这类化学物(试剂)主要是①氧蒽酮染料类，特别是由氧蒽酮为母体的碱性染料(例如罗丹明B及其类似物)；②灿烂甲酚蓝(煌焦油蓝)及其类似物；③以吩噻嗪为母体的碱性染料(如硫菫、亚甲蓝及其类似物、天青I、Wright-Giemsa染色液等)；④以吩嗪为母体的碱性染料(如中性红、藏红T及其类似物)；⑤三苯甲烷类碱性染料(如孔雀石绿、甲基绿、碘绿、结晶紫、乙基紫、新品红、碱性品红、副品红等，及其类似物)。
各类染料中的部分试剂也可用本法人工氧化的方法氧化成熟，作为本法MPO染色的显色剂。其中亚甲蓝、罗丹明B、天青I、孔雀石绿、甲基绿、碘绿、乙基紫等效果较好。
实施例一KI-PyB法一、试剂配制1、固定剂1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加无水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸盐缓冲溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化钾溶于50ml蒸馏水中。
4、PyB溶液250mg吡啰红B溶于50ml 50％乙醇中，待完全溶解后，加30％H2O225μl。
5、甲基绿溶液500mg甲基绿溶于50ml蒸馏水中。
6、MPO染色工作液配制(临用时现配)取磷酸盐缓冲溶液1ml，加KI溶液50μl、PyB溶液100μl(边滴边摇)，4小时内使用。
二、染色步骤1、干燥的血涂片或骨髓涂片，滴加固定剂布满血膜固定30-60s，流水冲洗，晾干或滤纸吸干。
2、滴加工作液于涂片上，染色1-2min后倾去(不用水冲洗)，滤纸吸干。
3、滴加甲基绿溶液于涂片上，染色5s后倾去(不用水冲洗)，滤纸吸干，镜检。
三、染色结果判断阳性产物呈红色至深红色颗粒状定位于胞浆中，强阳性时阳性颗粒充满整个胞浆，甚至覆盖细胞核。MPO阴性细胞的胞浆呈浅蓝色，无红色颗粒。细胞核呈浅绿色，核仁呈浅蓝色。(见图1、图2、图3、图4)，图1为正常骨髓涂片KI-PyB法MPO染色显微图，图2为急性髓细胞白血病外周血涂片KI-PyB法MPO染色显微图，图3、图4为急性髓细胞白血病骨髓涂片KI-PyB法MPO染色显微图。
实施例二KI-PyG法一、试剂配制1、固定剂1∶9甲醛乙醇液，即40％甲醛溶液10ml加无水乙醇90ml混合即得。
2、磷酸盐缓冲溶液0.067mol/L pH5.8。
3、KI溶液500mg碘化钾溶于50ml蒸馏水中。
4、PyG溶液250mg吡啰红G溶于50ml 50％乙醇中，待完全溶解后，加30％H2O225～50μl。
5、工作液配制(临用时现配)取磷酸盐缓冲溶液1ml，加KI溶液150μl、PyG溶液100μl混匀，4小时内使用。
二、染色步骤1、干燥的血涂片或骨髓涂片，滴加固定剂布满血膜固定30～60s，流水冲洗，晾干或滤纸吸干。
2、滴加工作液于涂片上，染色1-2min后倾去，滤纸吸干，镜检。
三、MPO染色结果判断阳性产物呈棕黑色颗粒状定位于胞浆中，强阳性时阳性颗粒充满整个胞浆，甚至覆盖细胞核，细胞核呈浅红色。MPO阴性细胞的胞浆呈浅红色，但较细胞核略深，无棕黑色颗粒。(见图5、图6、图7、图8)。图5为正常骨髓涂片KI-PyG法MPO染色显微图，图6为急性髓细胞白血病外周血涂片KI-PyG法MPO染色显微图，图7、图8为急性髓细胞白血病骨髓涂片KI-PyG法MPO染色显微图。
上述实施例一、实施例二染色结果采用急性淋巴细胞性白血病(ALL)9例、急性髓细胞性白血病(AML)33例、粒系反应性增12例及正常骨髓涂片5例，共计59例标本。各例分别按本实施例1、实施例2及Washburn法做MPO染色，每张涂片分类计200个有核细胞，记录MPO染色阳性细胞占有核细胞(ANC)的百分率；采用t检验进行统计分析。
附表50例骨髓涂片MPO染色阳性率(％，x±S)结果比较骨髓诊断例数实施例1 实施例2 Washburn法正常髓象5 58.6±3.3 63.0±6.8 65.0±7.9粒系增生12 71.8±6.0 72.4±6.5 73.3±6.1AML-M1 10 40.8±21.939.7±20.338.2±22.5AML-M2a 9 73.1±15.074.4±15.271.3±14.2AML-M2b 4 80.0±10.478.5±8.5 77.8±14.3AML-M3b 6 92.2±4.3 91.3±4.8 94.3±2.9AML-M4b 4 42.3±3.7 50.3±11.646.8±13.1总计50 65.3±21.366.3±20.565.8±21.9结果显示，9例ALL的白血病细胞，本法中的实施例1、实施例2与Washburn法MPO染色均为阴性，但涂片中的少量中性粒细胞MPO呈强阳性；另50例MPO染色阳性率(ANC)见附表，实施例1及实施例2与Washburn法MPO阳性率十分相近，平均值分别为65.3％、66.3％及65.8％，三者差异无显著性意义(P＞0.05)。
权利要求
1.一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，它由缓冲溶液、碘化钾溶液或含碘化钾的缓冲溶液、显色剂组成，其特征在于所述显色剂是经人工预先氧化的显色剂。
2.根据权利要求1所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述人工预先氧化的显色剂是经双氧水人工预先氧化成熟。
3.根据权利要求1或2所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述的人工预先氧化的显色剂为吡啰红G的甲醇溶液。
4.根据权利要求1或2所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述的人工预先氧化的显色剂为吡啰红B的甲醇溶液或乙醇溶液。
5.根据权利要求1或2所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述显色剂可为下述物质中的一种①氧蒽酮染料类，特别是由氧蒽酮为母体的碱性染料；②灿烂甲酚蓝及其类似物；③以吩噻嗪为母体的碱性染料；④以吩嗪为母体的碱性染料；⑤三苯甲烷类碱性染料。
6.根据权利要求1或2所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述显色剂可为亚甲蓝、罗丹明B、天青I、孔雀石绿、甲基绿、碘绿、乙基紫中的一种。
7.根据权利要求5所述的人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶的工作液，其特征在于所述显色剂可为亚甲蓝、罗丹明B、天青I、孔雀石绿、甲基绿、碘绿、乙基紫中的一种。
全文摘要
一种人工预先氧化显色剂显示髓过氧化物酶(MPO)的工作液，它由缓冲溶液、碘化钾溶液或含碘化钾的缓冲溶液、显色剂组成，所述显色剂是经人工预先氧化的显色剂。其优点在于每次配制MPO染色工作液时不必再加H
文档编号G01N1/30GK1546978SQ20031011151
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者陈万新 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院