专利名称：甾体类激素-碱性磷酸酶结合物制备方法
技术领域：
本发明是一种针对甾体类激素-碱性磷酸酶结合物制备方法，适合于以碱性磷酸酶标记的甾体类激素小分子物质在化学发光免疫分析技术中的应用。
背景技术：
甾体类激素是一组具有环戊烷多氢菲基本结构的化合物。脂溶性很强，在水中溶解性极微。碱性磷酸酶是一种MW100Ka的蛋白质，在有机溶剂中易失活。甾体类激素-碱性磷酸酶结合物是研发化学发光免疫分析试剂盒中的重要组分。关于其制造工艺国内外尚未有报道。
发明内容
作者依照甾体类激素及碱性磷酸酶两种结合物的理化特性，研发出一种简便易行的合成工艺。
实施实例一、聚赖氨酸的有机合成和分离1、取聚赖氨酸3mg溶于500μl生理盐水(pH6.5)中，另取EDC 5mg(300μl)滴加至赖氨酸溶液中，磁力搅拌下室温反应5-6h，移至4℃冰箱过夜。
2、将反应液冷冻干燥，加150μl双蒸水溶解。离心5000r/min 20分钟。取上清液在10×20cm微晶纤维素薄板上(自制厚度1～1.2mm)，在板的左1/4处点10μl反应液，采用上行层析在层析筒中展开，展开剂为正丁醇-冰乙酸-水系统。待展层液展至上端2cm处，取出放室温下干燥。
3、用相同大小的玻板将点样处覆盖，向左1/4处喷1mg/ml茚三酮液，放50℃干燥箱30分钟，可见3-4个相同色的斑点，根据预先测得赖氨酸的Rf值，刮去赖氨酸单体，将其余斑点刮下至离心管中，用适量双蒸水洗3次，洗脱液合并，冷冻干燥，产物为二聚体和三聚体，产率为40％。
二、甾体类激素-聚赖氨酸衍生物制备1、取甾体类激素羧甲基肟(睾酮、雌二醇、雌三醇、孕酮)300μg溶于100μl 50％吡啶中，另取EDC 2mg溶于100μl双蒸水中，两液混合室温反应1.5h，为“A”液。取聚赖氨酸600μg溶于100μl双蒸水中，为“B”液。
2、A液置磁力搅拌器上，将B液滴加至A液中，反应4-6h，4℃冰箱过夜。
3、将反应液冷冻干燥，加40％的乙醇100μl溶解。充分振荡后离心去沉淀，上清液用划线法点在硅胶板GF254 10×20cm板上，展开液为氯仿-甲醇-水系统。在254mm反射光紫外光检测仪显示两条区带。样品参照位经茚三酮呈色显出两条斑点。将相对应经鉴定具有茚三酮显色又在254nm紫外光下显出区带刮下，洗脱并干燥后即为产物。
三、甾体类激素-碱性磷酸酶结合物制备1、取甾体激素-聚赖氨酸衍生物约150μg溶于40％乙醇100μl中，为“A”液。另取经透析的碱性磷酸酶1mg(SIGMA公司产品，活性3870u/mg)，补加生理盐水至400μl为B液。
2、将A液置磁力搅拌器上，取B液缓缓滴加至A液中。此时应完全透明。
即刻加入1％戊二醛30μl，放室温暗处反应3h。
反应液装入8mm直径透析袋，4℃搅拌对PBS48h，再移至50mmol/L pH7.6Tris-HCl缓冲液24h。离心10000r/min 20分钟，上清液加等量AR级丙三醇及适量优级BSA。分装50μl/支，4℃保存。
权利要求
1.一种甾体类激素-碱性磷酸酶结合物的制备方法，其特征在于脂溶性的甾体类激素经过聚赖氨酸衍生物联接降低其脂溶性，在微量的有机溶剂中完全溶解，当和碱性磷酸酶联结时不降低其活性，采用戊二醛法联结，形成甾体类激素-碱性磷酸酶结合物。
2.按权利要求1所述的结合物的制备方法，其特征在于甾体类激素-赖氨酸合成工艺。
3.按权利要求1所述的结合物的制备方法，其特征在于甾体类激素-碱性磷酸酶结合物合成材料分子比。
全文摘要
化学发光免疫分析技术是当代最流行的一类超灵敏度检测手段，广泛应用于生物医学基础研究和临床疾病的诊疗。对于甾体类激素的检测其标记物是碱性磷酸酶和甾体类激素的结合物。甾体类激素是一类脂溶性较强的物质，而碱性磷酸酶在一些低浓度的有机溶剂中即可变性失活，故制备这种标记物均为国外某些高科技生物制剂机构所垄断。本研究工艺简便易行、成本低廉，为开发此类试剂盒替代国外商品创造了条件。
文档编号G01N33/531GK1540347SQ03110098
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月23日 优先权日2003年4月23日
发明者李振甲 申请人:北京北免东雅生物技术研究所