皮肤处理的利记博彩app

专利名称：皮肤处理的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种等位基因鉴定方法。更具体地说，本发明涉及一种鉴定存在于个体基因组中的纤丝聚集蛋白原(profilaggrin)等位基因的方法，所得信息可用于确定该个体对皮肤状况(skin conditions)的倾向。
背景技术：
在表皮分化期间，角质化细胞进行一系列意义明确的形态学及生物化学变化，其间，活跃增殖的基底细胞逐步由棘层和颗粒细胞层分化并最终形成无核的鳞屑，成为皮肤表面保护性的表皮角质层的特征(presland等(1992)J.Biol.Chem，267(33)，23772-23781)。每个表皮层以表达特异生化标记为特征，其中，角蛋白中间丝蛋白质，k5/k14和k1/k10，分别是基层和棘层的主要标记(presland等(1992)J.Biol.Chem，267(33)，23772-23781)。
颗粒细胞以表达纤丝聚集蛋白原为特征。纤丝聚集蛋白原基因编码高分子量磷酸化的多蛋白，这种多蛋白包含大量相关但并非完全相同的纤丝聚集蛋白(filaggrin)重复单元。肽图谱和序列研究已表明将纤丝聚集蛋白单元由短接头肽彼此分隔开，这些短接头肽在蛋白水解过程中被去除(Presland等(1992)J Biol Chem，267(33)，23772-23781)。与啮齿动物中的相应序列类似，人纤丝聚集蛋白原基因编码区的重复区域内不含内含子。
磷酸化的纤丝聚集蛋白原是非功能性的，它和F-角质透明蛋白颗粒一样在表皮分化后期积累(Gan等(1990)Biochemistry，29，9432-9440)。在由颗粒状向最终分化形成的角质化细胞转变的过程中，纤丝聚集蛋白原经过脱磷酸化、以及蛋白水解加工形成纤丝聚集蛋白单体。纤丝聚集蛋白参与角蛋白中间丝聚集成具有角质层特征的稠密巨原纤维的过程(Presland等(1992)J Biol Chem，267(33)，23772-23781)。纤丝聚集蛋白原还可能通过由纤丝聚集蛋白降解为自由氨基酸影响表皮水合作用(Presland等(1992)J Biol Chem，267(33)，23772-23781)。上述自由氨基酸形成角质层天然保湿因子(NMF)的一部分。NMF通过保持皮肤的水合作用维护皮肤状态。
纤丝聚集蛋白原基因定位于染色体1q21，是已知的表皮分化复合物(EDC)基因簇的一部分(Mishke等(1996)SID 106(5)989-992)。据认为这些基因中有很多编码对角质层的结构和功能起作用的产物。有报道称由于等位基因在定位于外显子3的纤丝聚集蛋白重复单元数量方面存在差异导致纤丝聚集蛋白原基因大小呈现多形态性(Gan等(1990)Biochemistry，29，9432-9440)。已在人群中鉴定出3种纤丝聚集蛋白原基因的长度变异体，它们所编码的多聚体分别具有10，11或12个重复单元。研究表明纤丝聚集蛋白原等位基因表达水平大致相同，即纤丝聚集蛋白原基因的表达是双等位的(Nirunsuksiri等(1998)Journal of Investigative Dermatology，110(6)，854-861)。
将受寻常性鱼鳞癣(IV)(一种显性遗传的起鳞皮肤病)影响的个体中纤丝聚集蛋白原基因的等位基因差异与不受该影响的，相关的或年龄和性别相符的正常对照进行了比较(Nirunsuksiri等(1998)Journal ofInvestigative Dermatology，110(6)，854-861)。利用在完整编码区两侧的EcoRV限制酶切位点对上述重复单元的数量和大小进行了评估。在IV和对照个体中纤丝聚集蛋白结构域的数量在10到12个之间变化，在这两组间没有发现明显的等位基因分布差异(Nirunsuksiri等(1998)Journal of Investigative Dermatology，110(6)，854-861)，这表明个体的纤丝聚集蛋白原基因型对该个体的皮肤状况没有影响。这种观点还得到Gan等(1990，Biochemistry，29，9432-9440)的支持，他们注意到正常终极分化的人表皮看来并非严格依赖于由前体基因产生的功能性纤丝聚集蛋白的精确数量。
在这种背景下，发现有关纤丝聚集蛋白重复单元数量与干燥皮肤倾向之间存在关联是令人惊讶的。我们研究表明纤丝聚集蛋白原基因型和皮肤对表面活性剂耐受能力(即，表面活性剂诱导的红斑的倾向)间有关联。已有研究表明纤丝聚集蛋白重复单元数量与NMF的生产间直接相关。个体产生NMF的能力和/或皮肤状况(如干燥皮肤、头皮屑和/或表面活性剂诱导的红斑)倾向可通过鉴定存在于他们基因组中的纤丝聚集蛋白原的等位基因来确定。在临床试验中可根据纤丝聚集蛋白原基因型将待检个体分组。可以根据纤丝聚集蛋白原基因型为受试个体配以合适的化妆品。
发明概述本发明提供一种确定个体对皮肤状况的倾向的方法，该方法包括对取自该个体体内样品基因组中的纤丝聚集蛋白原的等位基因进行鉴定。
本发明提供还一种确定个体对皮肤状况的倾向的系统，该系统包括对取自该个体样品基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因进行鉴定的工具。
本发明还提供一种提高NMF产量和/或处理或预防皮肤干燥和/或头皮屑的方法，该方法包括施用包含纤丝聚集蛋白原序列的多肽、或其变异体或片段，或施用编码上述多肽、变异体或其片段的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该方法用于处理或预防洗涤剂诱发的红斑。优选地所述的多肽包含具有12个纤丝聚集蛋白重复单元的纤丝聚集蛋白原等位基因的序列。
本发明还提供用于医药的包含纤丝聚集蛋白原等位基因的序列的多肽，其变异体或片段，以及编码上述多肽、变异体或其片段的多核苷酸。优选地所述的多肽包含具有12个纤丝聚集蛋白重复单元的纤丝聚集蛋白原等位基因的序列。
本发明还提供包含纤丝聚集蛋白原等位基因的序列的多肽或其变异体或片段，或编码上述多肽、变异体或其片段的多核苷酸在制备处理皮肤状况的组合物(例如，化妆品组合物或药物)中的应用。优选地所述的多肽包含具有12个纤丝聚集蛋白重复单元的纤丝聚集蛋白原等位基因。
本发明还提供包含序列5＇GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3＇或5＇GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3＇的多核苷酸。本发明还提供上述的多核苷酸在确定个体对皮肤状况的倾向中的应用。
本发明还提供一种鉴定适合个体应用的个人护理产品的方法，该方法包括鉴定个体的纤丝聚集蛋白原基因型、并选择已知适合于这样鉴定的纤丝聚集蛋白原基因型的个人护理产品。
本发明还提供一种诊断试剂盒，其包括用于鉴定由个体获得的样品基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因的工具。
发明详述本发明提出需要确定个体的皮肤对下述情况的反应，所述情况例如为环境条件；与个人护理产品，如皮肤护理产品、化妆品、清洗产品或毛发护理产品的接触；与家用产品，如织物洗涤剂、织物柔软剂、洗盘洗涤剂的接触等等。皮肤护理产品的例子包括但不限于保湿霜(moisturisers)、褐色伪装制剂(fake tanning preparations)、晒黑液(sun tan lotions)、按摩油、浴油、香水、香脂、乳霜、面膜(facepacks)、修面泡沫以及凝胶。化妆品的例子包括但不限于口红、粉底(foundation)、眼影、眼线膏、腮红以及遮盖用化妆品(concealer)。洗涤产品的例子包括但不限于洗发香波(尤其是去头屑洗发剂)、肥皂、个人洗涤产品包括淋浴凝胶和泡沫浴剂以及织物洗涤剂和洗盘洗涤剂。毛发护理产品的例子包括但不限于毛发定型摩丝、毛发定型喷雾剂、毛发定型凝胶、护发素或染发剂。
通过对个体纤丝聚集蛋白原基因型的评估可以确定该个体对皮肤状况的倾向。″纤丝聚集蛋白原基因型″是指在个体基因组中纤丝聚集蛋白原等位基因的身份。通过本发明的方法测试的个体典型地是哺乳动物。在一个实施方案中所述的哺乳动物可以是啮齿动物。在另一个实施方案中所述的哺乳动物可以是人。因而通过本发明的方法测试的个体是二倍体，所以在他们的基因组中包含两个拷贝的纤丝聚集蛋白原基因。如果某个体具有两个相同拷贝的一种纤丝聚集蛋白原基因，那么它们对该等位基因而言是纯合的。如果一个体具有两个不同拷贝的一种纤丝聚集蛋白原基因，即一个拷贝对另一个拷贝而言是多态的，则对该等位基因而言这一个体是杂合的。″倾向″是指在某个体的基因组中单个的纤丝聚集蛋白原等位基因的存在，或者与存在于某个体的基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因的组合相关于或预示着某种皮肤状况。
此处所用的术语″皮肤状况″涵盖皮肤包括头皮的全部物理参数，如保水性、物质的产生或屏障的形成。在一个实施方案中，术语″皮肤状况″指皮肤维持健康的NMF生产水平的能力。由此，本发明提供一种确定个体维持健康状态的NMF生产水平倾向的方法。换句话说，本发明提供一种确定个体对与NMF生产异常相关的状况的敏感度的方法。典型地，由NMF生产异常所引起或加剧的皮肤状况起因于NMF生产少于健康皮肤。与异常的纤丝聚集蛋白和NMF生产相关的状况包括寻常性鱼鳞癣。在另一个实施方案中术语″皮肤状况″指干燥皮肤。干燥皮肤状况包括老年或绝经后干燥病、表面活性剂诱发的干燥病、冬季干燥病、晒伤。在另一个实施方案中术语″皮肤状况″指头皮状况，如头皮屑。在另一个实施方案中术语″皮肤状况″指红斑，如洗涤剂-诱发的红斑。
因此，本发明的方法提供了一种通过皮肤特征将个体进行分类的工具。这可应用于治疗或非治疗性用途。在一个实施方案中本发明的方法用于治疗性用途。在另一个实施方案中本发明的方法用于非治疗性用途，如应用于化妆品。
本发明的方法的治疗性用途包括诊断医学的皮肤状况的工具。因此，能够使治疗医学的皮肤状况的方法可专门适合于与该个体的表型结合。本发明的方法的治疗性用途还包括确定某个体的皮肤是否会对药物制剂如局部施用的药物制剂发生不利反应。这种情况下可为该个体配以特定的药物制剂，以便提供最大限度的治疗效益同时避免对该个体皮肤的任何不期望的影响或使其最小化。
本发明的方法的非治疗性应用包括为测试制剂，如化妆品或任何引入体内的其他形式的制剂的目的将个体分组的手段。这可用于解释由这些实验所得的结果，例如不同个体的皮肤在测试期间反应不一致的试验。将受试个体按他们的皮肤状况倾向分组或分级后这种反应的不均一性可能会更清楚地表现出来。熟练的技术人员可以理解使用这种方法可以开发出适合于一些个体而不适合于另外一些个体的制剂。由此可建立制剂的小组，这种小组包括适用于不同个体的不同制剂。根据所述试验，希望使用所述制剂的个体可以根据自己的皮肤状况倾向，利用本发明的方法确定哪种制剂最适用。因此，本发明的方法可使个体与如上述列出的个人护理产物相匹配。
鉴定个体纤丝聚集蛋白原基因型的方法是在该个体的生物材料上进行的。优选地，所述生物材料是在进行所述鉴定方法前从所述个体取出的。换句话说，典型地，所述生物材料是来源于体内的。在实施所述方法之前，来自体内的材料可进一步在体外培养。
来自体内的样品可以包括来源于身体任意部分的组织或细胞。优选的来自体内的样品包括，来自循环系统的材料或来自体腔，如口腔的材料。特别优选的来自体内的样品是唾液样品。可通过自唾液样品利用本领域已知的方法确定存在于个体中的等位基因，所述的方法参见Schie和Wilson(1997，Journal of Immunological Methods，208，91-101)。
因此可以在无需专门的收集设备的情况下，由个体提供来自其体内的样品。例如，在试验前可简单地由所述个体提供唾液样品或口腔的拭子。
纤丝聚集蛋白原基因和蛋白质是本领域所公知的，在上述文献中和Gan等的(1990，Biochemistry，29，9432-9440)也有描述。许多纤丝聚集蛋白原序列已经在公共数据库中公开。
纤丝聚集蛋白原基因包含多个纤丝聚集蛋白重复单元，通常有10、11或12个重复单元。纤丝聚集蛋白重复单元典型地是同样长度(在人中是972bp、324个氨基酸)，但在相应mRNA的5＇和3＇末端这种纤丝聚集蛋白重复单元不十分典型。纤丝聚集蛋白重复单元可以呈现相当大的序列变异，典型地是在相同的及不同的等位基因中的重复单元存在0-50％，更典型地是2-30％，更典型地的是10-15％的变异。通常变异是由于单一碱基的改变，但是也可能涉及电荷的变化(Gan等(1990)Biochemistry，29，9432-9440)。人纤丝聚集蛋白重复单元的共有氨基酸序列图谱是已知的(Gan等(1990)Biochemistry，29，9432-9440)，优选地，纤丝聚集蛋白重复单元与如Gan等(1990，Biochemistry，29，9432-9440)所示的共有序列或所述共有序列的变异体具有至少50％，更优选具有至少75％，更优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性。通常编码氨基和羧基末端的氨基酸序列以及该基因编码区两侧5＇和3＇端的DNA序列更保守(presland等(1992)J Biol Chem 267(33)、23772-23781)。
个体基因组中存在的不同的纤丝聚集蛋白原等位基因可通过本领域已知的区分具有不同结构的大分子的方法鉴定。本文所用的有关纤丝聚集蛋白原的术语″等位基因″指包含多态性的任何纤丝聚集蛋白原基因。在一个优选的实施方案中，有关纤丝聚集蛋白原的术语″等位基因″指可由其编码的纤丝聚集蛋白重复单元的数量鉴定的纤丝聚集蛋白原基因。然而，熟练的技术人员可以理解还可能有许多其他的纤丝聚集蛋白原基因的多态性，所有的纤丝聚集蛋白原等位基因都包括在本发明的范围内。例如在具有纤丝聚集蛋白原等位基因的个体间观察到的表现型差异可能是在纤丝聚集蛋白生产方面差异的直接结果，其中所述的纤丝聚集蛋白原等位基因编码具有10、11或12纤丝聚集蛋白重复单元的纤丝聚集蛋白原。然而本熟练的技术人员可以理解，反过来，纤丝聚集蛋白重复单元的数量可以当作不同纤丝聚集蛋白原等位基因中的某些其他序列多态性、或表皮分化复合物中另一基因的“标记”。因此，所述的表现型也可能不与存在的纤丝聚集蛋白重复单元数目直接相关。因此，可以理解为本文所述的方法将适于鉴定任何纤丝聚集蛋白原等位基因间的差异，由此本发明并非仅局限于纤丝聚集蛋白重复单元数目的多态性。
登录号M60494指示了人纤丝聚集蛋白原基因3＇末端(是在Gan等公开的纤丝聚集蛋白原的氨基末端序列(1990，Biochemistry，29，9432-9440))并且包括两个EF-手、内含子2、N-末端、截短的重复单元和终止于接头2的第一个完整的纤丝聚集蛋白重复单元。
登录号LO1089指示了人的纤丝聚集蛋白原基因的外显子2-3，(是Presland等公开的纤丝聚集蛋白原的氨基末端序列((1992)J BiolChem，267(33)，23772-23781))。它包括EF-手2(EF-手1位于外显子1 L01088中)，截短的重复单元，第一个接头和大约第一个完整的纤丝聚集蛋白重复单元的一半。
登录号AH003056指示了纤丝聚集蛋白原的羧基末端序列，(它结合了M60501.1，M60502.1和M60503.1，由Gan等公开(1990，Biochemistry，29 9432-9440))包括最后一个完整的纤丝聚集蛋白重复单元，截短的重复单元和C-末端以及poly A尾。
典型地，可在多核苷酸水平，如通过分析基因组DNA或mRNA来鉴定等位基因。熟练的技术人员非常了解确定不同的多核苷酸存在与否的方法。已知用于确定特定的RNA序列存在与否的方法包括Northern印迹、反转录和PCR(RT-PCR)和核酸酶保护试验(Sambrook和Russell，(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual.3rdedition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，USA)。已知的用于确定特定的DNA序列存在与否的方法包括，测序、Southern印迹，基因组DNA的PCR扩增和限制性片段长度多态性分析(RFLPs)。参见(Sambrook和Russell(2001，Molecular CloningA LaboratoryManual.3rd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NewYork，USA)，Innis等，(1995，PCR Strategies，Academic Press，Inc.NY)；Dieffenbach等(1995，PCR PrimerA Laboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Press)。也可以通过检测在存在或不存在变性剂的情况下DNA片段在凝胶中的电泳迁移率的变化来分析DNA序列。还可以通过高分辨率凝胶电泳观察、或根据DNA序列的熔点差异来区分存在的差异。参见，例如Myers等(1982，Science，230，1242)。检测特异序列存在的方法包括检测技术，例如荧光检测方法，免疫试验，如RIA，抗体染色，如Western印迹分析或利用适当标记的探针进行原位杂交。
可用于构建适用于检测感兴趣的序列存在的探针的序列包括，任何通过Blast比对得出与已知的纤丝聚集蛋白原基因或片段具有至少约50％、优选至少70％、更优选至少80％或更高序列同一性或同源性的核酸序列。在需要获得最大序列同一性百分比且不认为任何保守取代是序列同一性的一部分的条件下，“序列同一性百分数(％)”或“序列同源性百分数(％)”是在进行了序列比对并引入间隙(gap)后根据备选序列与感兴趣的序列中相同的核酸残基的百分比来定义的。进行序列比对和确定序列同一性的方法是本领域已知的，无需过多的实验，例如可通过可商购的计算机程序，如WU-BLAST-2(Altschul等1996，Methods in Enzymology 266，460-480)来计算同一性的百分数数值。可选择性地利用计算机软件程序中设定的缺省参数来进行比对(Blastsearch，MacVector and Vector NTI)。根据特定等位基因的限制性酶切图谱，利用与可识别感兴趣的序列的探针杂交进行Southern印迹时，可预测带型图。所应用的杂交的严谨性水平可以根据所需的灵敏程度、特定的探针特性，如探针的长度和/或退火温度，或者探针序列和所感兴趣的序列间的同源性程度而有所不同。因此，根据对灵敏度和特异性的考虑来确定试验所需的杂交严谨性。
杂交反应的″严谨性″是本领域的普通技术人员所易于确定的，通常根据探针长度、洗膜温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的适当的退火温度，而较短的探针需要相对低的温度。当互补链存在于低于它们的解链温度的环境中时，杂交通常依赖于变性DNA的重退火能力。预期的探针和可杂交序列间的同源性越高，可用的相对温度越高。有关杂交反应严谨性的详细信息和解释参见Ausubel等(1995，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Publishers)或Protocols Online(URLwww.protocol-online.net/molbio/index.htm)。
本文中所定义的″严谨条件″或″高度严谨″可等同于(1)在低离子强度和高温下洗膜，例如0.1×SSC，0.2％SDS，于65-70℃下进行。
″中度严谨条件″可等同于如Sambrook和Russell(2001，MolecularCloningA Laboratory Manual，3rdedition)中所述的，包括所用的洗膜溶液和杂交条件(如，温度、离子强度和％SDS)低于上述的严谨性。举例来说，中度严谨条件是在0.2×SSC，0.1％SDS、58-65℃下进行。本领域的技术人员知道必要时如何调整温度、离子强度等以适应如探针长度、探针和靶位点之间的同源性程度等因素。因此，除感兴趣的序列外，因所感兴趣的序列而异的额外的或供选择的探针序列也可考虑用于筛选所感兴趣的序列。
在优选的实施方案中，纤丝聚集蛋白原等位基因由存在的纤丝聚集蛋白重复单元数量来鉴定。典型的鉴定存在于个体基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因的方法包括，确定所述的等位基因是否存在10，11或12个纤丝聚集蛋白重复单元。
在一个优选的实施方案中利用PCR进行等位基因的鉴定。利用本领域中已知的技术制备正向和反向的引物，所述的引物分别包含与编码多态性纤丝聚集蛋白重复单元的纤丝聚集蛋白原基因编码序列相关的上游区域和下游区域的序列。优选地，选择用于设计引物的上游和下游区域在不同的等位基因间基本上是保守的。″基本上保守″意味着序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或100％的序列同一性。因此，可将引物设计为与类似的但非同一的序列相结合，例如利用简并引物或为了互补性的目的使引物中包含具有特异性减弱的核苷酸，如肌苷。优选正向和反向的引物中一个、或更优选两个与各纤丝聚集蛋白原等位基因的上游和/或下游区域100％相同。
上游和下游的引物可以由公共序列数据库获得。例如在下述实施例中应用的一个引物即是根据由登录号为LO1089所鉴定的序列中的第3112-3132位碱基设计的(等同于登录号M60494的序列中所鉴定的第1530-1551位碱基)，而另一个引物是根据登录号AH003056所鉴定的序列中第3341-3361位碱基设计的。
用这些引物对纤丝聚集蛋白原等位基因进行扩增，可得到因所编码的纤丝聚集蛋白重复单元的数量而异的不同大小的产物。可以想见，具有10个重复单元的等位基因应当得到11,610bp的片段，而具有11个重复单元的等位基因应当获得12,582bp的片段，具有12个重复单元的等位基因应当得到13,554bp的片段。因此，优选的用于设计正向引物的上游区域至少是编码纤丝聚集蛋白原基因氨基末端的一部分或是所述基因编码区上游的5＇DNA序列。优选地，正向引物的序列为5＇GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3＇。
优选的用于设计反向引物的下游区域至少是编码纤丝聚集蛋白原基因羧基末端的一部分或是所述基因编码区下游的3＇DNA序列。优选地，反向引物的序列为5＇GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3＇。
进行PCR反应以扩增得自所述个体的样品的生物材料中的DNA。在一个实施方案中，所述的DNA是由生物材料中抽提出的基因组DNA。在另一个实施方案中，所述的DNA是cDNA，它是由生物材料中抽提出的RNA、特别是mRNA反转录而得的。抽提基因组DNA的方法，抽提RNA的方法，抽提mRNA的方法和进行反转录的方法都是本领域中已知的，例如参见Sambrook和Russell(2001，MolecularCloningA Laboratory Manual.3rd edition，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，USA)。
在优选的实施方案中，所述的DNA是基因组DNA，所述的样品是唾液样品或口腔拭子。由唾液样品或口腔拭子中抽提DNA的方法是本领域已知的(Schie and Wilson(1997)Journal of Immunological Methods，208，91-101)。
PCR反应可在本领域所熟知的条件下进行，或根据可商购的PCR试剂盒中制造商建议的条件进行。例如，可应用0.1到30μg/ml DNA底物进行扩增。所述的扩增可利用2μM到2mM dNTPs进行。所述的扩增可利用2μM到2mM正向和反向引物进行。所述的扩增可利用17μM到170mM Mg进行。在优选的实施方案中，所述的扩增应用约200μM dNTPs进行。在优选的实施方案中，所述的扩增应用约200μM正向和反向引物进行。在优选的实施方案中，所述的扩增应用约1.7mM Mg2+进行。所谓“约”指所用浓度与所述浓度相差不超过50％，25％，10％或5％。最优选的PCR反应基本上是按照下述示例中所述的方法进行的。
然后可用任何适宜的方法对PCR产物进行分析。典型地，将所述PCR产物用大小分级分离的方法分析，通常是利用本领域已知的方法通过凝胶电泳进行，参见(Sambrook and Russell(2001)MolecularCloningA Laboratory Manual.3rd edition，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York，USA)。最优选地，所述PCR产物的分析是基本上是按照下述示例中所述的方法进行的。
其他适合于鉴定存在于个体基因组中纤丝聚集蛋白原等位基因的方法包括等位基因特异性杂交、等位基因特异性寡核苷酸杂交和引物特异性延伸。
等位基因特异性杂交利用覆盖至少一个纤丝聚集蛋白原等位基因区域的在多态性区域周围具有约5，10，20，25或30个核苷酸的探针进行。在一个优选的实施方案中，将几个可与其他纤丝聚集蛋白等位基因特异性杂交的探针固定于固相支持物如″芯片″(其可固定约250,000个寡核苷酸)上。可应用多种方法将寡核苷酸固定到固相支持物上，包括平板印刷术。利用这些又称为″DNA探针阵列″的包含寡核苷酸的芯片进行突变检测分析被描述在Cronin等(1996，Human Mutation 7，244)中。在一个实施方案中，所述的芯片包含纤丝聚集蛋白原基因中至少一个多态区域的所有等位基因变异体。然后将所述的固相支持物与待测试的核酸相接触，检测其与特异探针之间的杂交。因此，在一个简单的杂交实验中可以鉴定一个或多个基因的多种等位基因变异体的身份。
这些技术还包括在进行分析前所进行的核酸扩增的步骤。扩增技术是本领域技术人员所公知的，其包括但不限于克隆，聚合酶链式反应(PCR)，特异等位基因的聚合酶链式反应(ASA)，连接酶链式反应(LCR)，嵌套聚合酶链式反应，自持续序列复制(Guatelli等(1990)ProcNatl Acad Sci USA 87，1874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等(1989)ProcNatl Acad Sci USA 86，1173-1177)，和Q-Beta复制酶(Lizardi(1988)Bio/Technology 6，1197)。
扩增产物可通过多种方式进行分析，这包括大小分析，大小分析后的限制酶消化，检测反应产物中的特异标记的寡核苷酸引物，等位基因特异性的寡核苷酸(ASO)杂交，等位基因特异性的5＇外切核酸酶检测，测序，杂交等。
在仅作为示例性的实施方案中，鉴定纤丝聚集蛋白原等位基因的方法包括下述步骤(i)由来自个体的样品的细胞中分离核酸(如，基因组，RNA或两者)；(ii)在可使所述等位基因多态性区域的杂交和扩增进行的条件下，使所述核酸样品与一个或多个可与纤丝聚集蛋白原等位基因中的至少一个多态区的5＇和3＇特异杂交的引物相接触；和(iii)检测扩增产物。这些检测方案对检测存在量很低的核酸分子特别有用。
可以通过限制酶裂解方式的改变鉴定纤丝聚集蛋白原等位基因。例如，分离、扩增(任选地)样品和对照DNA，再用一种或多种限制性内切酶消化，通过，例如凝胶电泳确定片段长度大小。
在另一个实施方案中，本领域中已知多种中的任何一种测序反应均可用于上述等位基因的序列测定。示例性的测序反应包括基于Maxim和Gilbert(1997，Proc Natl Acad Sci USA 74，560)或Sanger等(1977，Proc Nat Acad Sci USA 74，5463)开发的技术。还应当考虑到的是，任何自动化测序方法均可用于上述测序实验。(参见，例如Biotechniques(1995)19，448)，包括利用质谱分析法进行测序(例如WO 94/16101；Cohen等(1996)Adv Chromatogr 36，127-162；和Griffin等(1993)ApplBiochem Biotechnol 38，147-159)。对本领域的技术人员而言，显然对于某些实施方案仅需在测序反应中确定一个、两个或三个核酸碱基。举例来说，仅检测一个核苷酸的情况可应用A-track等。
可以利用裂解剂(如核酸酶，羟胺或四氧化锇和哌啶)检测在RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA异源双链中的错配碱基来鉴定纤丝聚集蛋白原等位基因(Myers等(1985)Science 230，1242)。通常，本领域中“错配切割”技术是从通过把含有野生型等位基因的RNA或DNA与某种样品杂交(标记的)形成异源双链开始的。用某种可以切割双螺旋中单链区域的制剂处理所述的双链螺旋，所述的双螺旋中单链区域可能是由于对照和样品链之间的碱基对错配造成的。举例来说，可以用RNA酶处理RNA/DNA双螺旋，用S1核酸酶处理DNA/DNA杂合体以酶解错配的区域。在另一实施方案中，可以用羟胺或四氧化锇和哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双螺旋以酶解错配区域。在消化了错配区域后，将所得的材料通过例如利用变性聚丙烯酰胺凝胶按大小分离确定突变位点。参见，例如Cotton等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85，4397；和Saleeba等(1992)Methods Enzymol 217，286-295.在一个优选的实施方案中，可将对照DNA或RNA标记后用来进行检测。
在又一个实施方案中，所述的错配裂解反应是利用一种或多种可识别双链DNA中错配碱基对的蛋白(所谓的″DNA错配修复″酶)进行的。例如，大肠杆菌的mutY酶在G/A错配处切割A，来自HeLa细胞的胸腺嘧啶脱氧核苷DNA糖基化酶在G/T错配处切割T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 15，1657-1662)。在一个示例性的实施方案中，基于选择出的纤丝聚集蛋白原等位基因的探针与cDNA或来自受试细胞的其他DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理所述的双螺旋，裂解产物(如果有的话)可通过电泳等方式检测出来。参见，例如美国专利5,459,039。
其他用于检测等位基因的技术包括但不限于选择性的寡核苷酸杂交或选择性的引物延伸。例如，在制备寡核苷酸引物时将已知的突变或差异(例如在等位基因变异体中)置于引物序列的中间，然后使其在只有完全匹配时才可进行杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等(1986)Nature 324，163；Saiki等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86，6230).这种等位基因特异性寡核苷酸杂交技术当寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA杂交时可用于检测每个反应中的一个突变区域或多态性区域；或者在所述的寡核苷酸附着于杂交膜上与经标记的靶DNA杂交时可用于检测多个不同的突变区域或多态性区域。
在另一个实施方案中，可利用寡核苷酸连接试验(OLA)来鉴定纤丝聚集蛋白原等位基因，如美国专利4,998,617和Landegren等(1988，Science 241，1077-1080)所述。所述的OLA方案利用两个设计为可与靶分子单链中的邻接序列杂交的寡核苷酸进行。一个寡核苷酸与分离的标记物例如生物素酰化的标记物相连，另一个是可检测的标记物。如果在靶分子中发现了精确互补的序列，所述的寡核苷酸即可与之杂交由此使它们的末端相靠近而形成连接底物。连接可使经标记的寡核苷酸通过抗生物素蛋白或别的生物素配体回收。Nickerson等描述了一种结合PCR和OLA特征的核酸检测的实验(Nickerson等(1990)Proc NatlAcad Sci USA 87，8923-27)。该方法中，利用PCR完成靶DNA的指数扩增，然后再利用OLA进行检测。
目前已开发出了几种基于OLA的方法用于检测纤丝聚集蛋白原等位基因。例如美国专利5,593,826公开了一种OLA，其利用具有3＇-氨基的寡核苷酸和5＇-磷酸化的寡核苷酸形成具有氨基磷酸酯键的共轭物。Tobe等在(1997，Nucleic Acids Res 24，3728)中描述了另一种OLA变异的形式，其中OLA与PCR结合使得可在一个微滴定孔中对两个等位基因进行定型。通过用独特的半抗原如地高辛和荧光素标记每一个等位基因特异的引物，各OLA反应可利用用不同的酶报道分子如碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的半抗原特异性抗体来进行检测。这一系统允许采用高通量形式形成两种不同颜色产物来检测两个等位基因。
一旦确定了个体的纤丝聚集蛋白原的基因型，该个体即可按照其对皮肤状况的倾向的高低加以归类。因此本发明的方法可用于鉴定个体的纤丝聚集蛋白原的基因型，从而确定该个体对皮肤状况的倾向。据此本发明提供一种确定个体对皮肤状况的倾向的系统，该系统包括鉴定来自该个体样品基因组中存在的纤丝聚集蛋白原等位基因的工具。
在一个实施方案中，本发明提供一种多核苷酸，其包含用于扩增包含多态性的纤丝聚集蛋白原基因的区域的引物序列。在一个优选的实施方案中所述的引物是5＇GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3＇或5＇GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3＇。
本发明还提供本发明的引物在确定个体对上述皮肤状况的倾向的方法中的应用。本发明的又一方面提供包含PCR引物和上述用于杂交的寡核苷酸的试剂盒和实验组分。
本发明的引物试剂盒可应用于通过聚合酶链式反应鉴定纤丝聚集蛋白原等位基因。所述的试剂盒包含成对单链DNA引物，该引物对可与相关染色体上的多态性区域两侧的序列，以及纤丝聚集蛋白原基因内部或周围的序列退火以引导基因本身扩增合成DNA。整套引物可引导所有的纤丝聚集蛋白原等位基因编码序列的核苷酸，即外显子的合成，或引导几乎全部编码区的合成。由于纤丝聚集蛋白原等位基因变异形式也可能出现在基因的内含子中，因此这套引物优选使外显子和内含子序列均合成出来。本试剂盒还可以包括DNA聚合酶、优选嗜热的DNA聚合酶、更优选Taq聚合酶，还更优选地Elongase(GIBCOBRLLife Technologies)和适当的反应缓冲液。这些组分都是本领域已知的。
为便于后续扩增序列的克隆，在引物的5＇末端附加了限制酶切位点。因此，除了形成限制酶切位点所需的少数核苷酸外，所有的引物核苷酸均来源于纤丝聚集蛋白原基因序列或该基因邻近的序列。这些酶和位点都是本领域已知的。引物本身可利用本领域已知的技术合成。通常引物可利用可商购的合成仪制备。如果给定本领域公知的纤丝聚集蛋白原等位变异体的序列，则设计特定的引物是本领域的技术人员可以做到的。
可选择地，本发明的试剂盒可进一步包含个人护理产品，如上述的化妆品，该化妆品适合应用于具有特定纤丝聚集蛋白原基因型的个体。
本发明试剂盒的一个实例可以包括分离核酸的工具，如QIAampDNA Blood Midi试剂盒或Epicentre BuccalAmp试剂盒，以及辅助设备如离心机、DNA定量设备如分光光度计，进行PCR反应的工具，如热循环仪和PCR产物分析工具，如凝胶电泳试剂盒。但许多或者所有这些项目均易于在分子生物学实验室中找到。因此，本发明的试剂盒可包含适于稀释到终浓度200μM的dNTPs，一对寡核苷酸引物如5＇GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3＇和5＇GA CAG GAA AAGATA ACT TCC C 3＇适于稀释到Mg2+终浓度为1.7mM的氯化镁溶液和热稳定的DNA聚合酶如Elongase(GIBCOBRL Life Technologies)。该试剂盒可以进一步包含如何应用其所包含组分的指导，可包含进行PCR循环操作的指导如下加热到94℃维持5分钟加入Elongase反应混合物至1/50稀释(HOT START)程序开始94℃下5min一个循环 4℃下浸泡本发明的试剂盒还可以进一步包含具有已知大小的多核苷酸，用于与PCR产物相比较并测定其大小。这样的多核苷酸可以是，例如延伸梯标记(extension ladder marker)(如GIBCO-BRL的产品)或含有已预先鉴定出的变异体的参考基因组DNA。
本发明还涉及化妆品处理方法，该方法包括通过本发明的上述方法确定个体的纤丝聚集蛋白原基因型，以确定具有该纤丝聚集蛋白原基因型的个体适合于应用化妆品制剂，并将如此确定的化妆品制剂应用于该个体。所述化妆品制剂的施用包括以正常的方式使用。典型地包括通过皮肤或头皮局部施用。本化妆品制剂可以是如上所述的任何制剂。
本发明还涉及一种通过影响个体的表皮中的纤丝聚集蛋白原等位基因的类型和/或有效性来处理皮肤状况的方法。上述方法可通过施用含纤丝聚集蛋白原等位基因序列或其变异体或片段的多肽进行。上述方法也可通过施用含编码纤丝聚集蛋白原等位基因或其变异体或片段的多核苷酸进行。因此，本发明涉及改变，优选提高个体表皮中NMF产量的方法。本发明还涉及处理干燥皮肤或洗涤剂-诱发的红斑的方法。本发明还涉及处理头皮屑的方法。本发明的多肽或多核苷酸可与化妆品制剂一起配制以提高化妆品的有益效果或改善化妆品的不良效果。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法能提高纤丝聚集蛋白原产生。
优选地，所产生的纤丝聚集蛋白原等位基因具有12个纤丝聚集蛋白重复单元。
″片段″和″变异体″其意义包括可用于制备能特异地与纤丝聚集蛋白原或其突变体结合的抗体的多肽。已知在纤丝聚集蛋白重复单元中存在序列偏差(Gan等(1990)Biochemistry，29 9432-9440)。
纤丝聚集蛋白原的″变异体″其意义包括在一个或多个位置存在保守的或非保守的氨基酸插入、缺失或取代的多肽，条件是这种改变使蛋白质的基本性质，例如结合活性(类型和亲和力)、热稳定性、在给定pH-范围内的活性(pH-稳定性)没有显著的改变。本文中所述的″显著的″是指对本领域的技术人员而言，所述变异体的性质与起始蛋白相比发生了改变而且并不是非显而易见的。“保守取代”指组合，如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；以及Phe，Tyr。
″片段″指小于100％整体多肽的多肽。例如至少是整体纤丝聚集蛋白原蛋白质的99％、98％、95％、90％、80％、60％、40％、30％、25％或20％。
本领域的技术人员将会认识到本发明的多肽可通过已知的多肽修饰技术修饰。这些技术包括，1981年11月24日颁发给Stevens的美国专利4,302,386中公开的，在此引入作为参考。这种修饰可以改变，优选提高抗原的免疫原性，也可以对免疫原性不起作用。例如可以改变几个氨基酸残基。
另外，相应于多肽的抗原部分的小多肽可通过本领域已知的化学方法合成。这包括1981年颁布授予Goldberg的美国专利4,290,944中所公开的内容，所述文献在此引入作为参考。
因此，用于本发明方法的多肽包括一类经修饰的多肽，包括合成得到的多肽以及起始多肽的片段，它们具有相同来源的共有序列、结构和和免疫原性，都属于本发明的范围。
用于本发明方法的分离的多核苷酸可以包括上述编码纤丝聚集蛋白原基因或其变异体或片段的序列。此处所用的术语″分离的″指所述的基因已至少从其所存在的大部分人染色体上分离出来，换句话说，不要求该基因是以其固有形式存在。因此，本发明的基因包括克隆到细菌载体，如质粒上，或克隆到病毒载体，如噬菌体上的那些基团，条件是这些克隆已从构成相关染色体的DNA文库中分离出来。
″基因″可以包括启动子和/或其他在正常状态下控制表达的表达调控序列，它可以包括内含子，也可以仅由编码序列组成，如cDNA序列。
另外反义多核苷酸也可用于本发明的方法中。反义多核苷酸是单链的的核酸，其可特异地与互补的核酸序列结合。通过与适当的靶序列相结合形成RNA-RNA，DNA-DNA，或RNA-DNA双螺旋。由于这些核酸与基因的有义或编码链互补，所以通常将它们称作“反义”。最近，已证明多核苷酸也可能和DNA双链体形成三股螺旋。已经发现多核苷酸可以识别DNA双螺旋大沟中的序列。由此形成三股螺旋。这表明可以合成能通过识别大沟的氢结合位点而特异地与双链DNA结合的序列特异性分子。
通过与纤丝聚集蛋白原靶核酸结合，上述的多核苷酸可以抑制靶核酸的功能。由此可以，例如阻断转录、加工、poly(A)添加、复制、翻译或促进细胞抑制机制，例如促进RNA降解。
反义多核苷酸可以先在实验室中制备然后导入细胞，例如通过微注射或从细胞培养基中吸收到细胞内，或者在通过质粒、反转录病毒或其他带有反义基因的载体转染到细胞内后表达。反义多核苷酸最初被发现可抑制病毒复制或抑制劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus)、I型单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)、猿猴病毒(simian virus)和流感病毒(influenza virus)在细胞培养物中的复制。此后，反义多核苷酸抑制mRNA翻译在无细胞体系，包括兔网织红细胞溶胞产物和小麦胚芽提取物中已经进行了广泛地研究。利用与AIDS HIV反转录病毒RNA互补的多核苷酸已经证明了在体外反义多核苷酸对病毒具有抑制功能。(Goodchild，J.1988″Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by AntisenseOligodeoxynucleotides″，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究结果表明与poly(A)信号互补的多核苷酸最有效；那些靶到RNA 5＇末端，特别是处于引物结合部位或靠近引物结合部位的帽子区及5＇非翻译区的也有效。处于反转录病毒RNA末端重复区(R区)的帽子区，5’非翻译区，和poly(A)信号区和与这些序列互补的多核苷酸可与所述的RNA结合两次。
典型地，反义多核苷酸有15到35个碱基长。例如，已表明20-mer的多核苷酸可抑制表皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等，Breast Cancer Res Treat 5341-50(1999))，25-mer的多核苷酸可使促肾上腺皮质激素的表达减少90％以上(Frankel等，J Neurosurg91261-7(1999))。然而，可以理解也有可能需要使用长度超出这一范围的多核苷酸，例如10、11、12、13或14个碱基，或者36、37、38、39或40个碱基。
上述的多肽和多核苷酸或其制剂可通过任意的常规方法施用，包括局部施用于皮肤状况的部位，口服或通过非肠道(如皮下的或肌肉的)注射)的方式。该处理可以由单一剂量或在一段时间内的多次剂量组成。
多核苷酸也可以全身施用。另外，可通过下述方式提高以碱基配对为特征的多核苷酸固有的结合特异性，即限制多核苷酸在体内预定位点的利用率，使用低剂量、使系统效应最小化。由此可进行局部施用来实现所需的效果。多核苷酸在所需位点的浓度远高于所述多核苷酸全身施用的情况，由此可通过显著低的总剂量达到治疗效果。局部的高浓度多核苷酸增强了靶细胞的穿透率，可有效地阻断靶核酸序列的翻译。
可通过任何适用于局部用药的方式将所述多核苷酸递送到所需位点。例如可将多核苷酸溶液直接注射到指定位点，或者通过输液泵将所述多核苷酸注入。还可以本多核苷酸装入一种可植入装置中，当把该装置放在临近所需位点的位置时，能使所述多核苷酸释放到所需位点周围。
该多核苷酸也可以通过水凝胶材料施用。所述的水凝胶是非炎症性的并且是生物可降解的。现在已知有很多这样的材料，包括天然材料及合成的聚合物。在一个优选的实施方案中，本发明的方法所应用的水凝胶在低于体温时是液体，在体温或接近体温时形成可保持形状的半固体水凝胶。优选的水凝胶是环氧乙烷-环氧丙烷重复单元的聚合体。所述聚合体的性质取决于聚合体的分子量和聚环氧乙烷和聚环氧丙烷在聚合体中的相对百分含量。优选的水凝胶包含约10％到约80％(重量比)的环氧乙烷和约20％到约90％(重量比)的环氧丙烷。特别优选的水凝胶包含约70％的聚环氧乙烷和30％的聚环氧丙烷。所用的水凝胶，可从例如BASF Corp.Parsippany，N.J.以商品名为PluronicR得到。
在这一实施方案中，将所述的水凝胶冷却成液态，将所述的寡核苷酸与水凝胶液体混合到液体中，达到约1mg多核苷酸/每g水凝胶的浓度。然后将所得的混合物施用于待处理的表面，例如在进行外科手术期间通过喷雾或涂布，或通过导管或内窥镜法施用。当所述的聚合物温热时，它固化形成凝胶，其中的多核苷酸在由凝胶的确切成分确定的时间段中，从凝胶中扩散出来进入周围的细胞中。
所述的多核苷酸可以通过其他可商购的、或描述于科学文献中的植入物来施用，所述的植入物包括脂质体，微胶囊和可植入的装置。例如，可利用由生物可降解的物质或不能生物降解的物质制备的植入物来局部递送多核苷酸，所述的可生物降解的物质例如为聚酐，聚原酸酯(polyorthoesters)，聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物，胶原和蛋白质聚合物，所述的不能生物降解的物质例如为乙烯-乙酸乙烯酯(EVAc)、聚乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇及其衍生物。可以利用熔化或溶剂蒸发的技术使所述的多核苷酸在物质聚合或固化时掺入所述物质中，或者通过机械方式将多核苷酸与所述物质混合。在一个实施方案中，所述的多核苷酸混合到或涂布到可植入装置中或该装置的涂层上，所述的可植入装置例如为包被有右旋糖酐的硅石珠，移植片固定模或导管。
多核苷酸的剂量取决于该多核苷酸的大小和施用目的。通常，根据待处理的组织的表面积来计算。多核苷酸的有效剂量在一定程度上取决于该多核苷酸的长度和化学成分，但通常是在每平方厘米组织表面积为约30到3000μg的范围内。
该多核苷酸可作为美容、治疗和预防的目的全身施用。可通过任何有效的方法施用所述的多核苷酸，例如非肠道地(如静脉内地，皮下地，肌内地)或经口、鼻服用，或其他任何可使寡核苷酸进入并循环于患者血液中的方法。除了局部施用多核苷酸外，还优选全身施用多核苷酸，但在没有局部施用多核苷酸的情况下全身施用也有用途。对于该目的，施用于成人的有效剂量范围在约0.1到约10克。
可以理解反义制剂也包括与所述纤丝聚集蛋白原mRNA或基因结合的大分子，它可基本上阻止所述纤丝聚集蛋白原mRNA或基因的表达，并基本上阻止所述纤丝聚集蛋白原蛋白质表达。由此，基本上互补于所述纤丝聚集蛋白原mRNA的反义分子的表达也被看作是本发明的一部分。
上述的大分子可由下述的任何适当的遗传的构建体表达并递送到患者。典型地，表达反义分子的遗传构建体至少包含一部分纤丝聚集蛋白原cDNA或以可操作方式与能够在细胞内表达反义分子的启动子相连的基因。
虽然所述的用于递送多核苷酸的遗传构建体可以是DNA或RNA，但优选是DNA。
优选地，所述的遗传构建体适于向人细胞递送。
将一种遗传的构建体引入动物体的细胞的工具或方法是本领域已知的。例如，可通过任何便利的方法将本发明的构建体引入细胞，例如应用反转录病毒的方法，其可将所述构建体插入到细胞的基因组中。例如在Kuriyama等(1991)Cell Struc.and Func.16，503-510中施用纯化的反转录病毒。可利用本领域已知的方法制备包含上述多核苷酸的反转录病毒DNA构建体。为了从所述的构建体生产活性的反转录病毒通常利用在含10％胎牛血清(FCS)的经修饰的Dulbecco＇伊格尔培养基(DMEM)中生产的ecotropic psi2包装细胞系。可方便地利用磷酸钙共同沉淀进行细胞系转染，加入终浓度为1mg/ml的G418(假定该反转录病毒构建体包含neo基因)来筛选稳定的转化子。分离独立的克隆、展开，去除培养物上清液，经0.45μm孔径-过滤器过滤后于-70℃下贮存。为将反转录病毒引入肿瘤细胞，可方便地将添加了10μg/ml聚凝胺(Polybrene)的反转录病毒上清液直接地注射到肿瘤细胞中。对于直径超过10毫米的肿瘤，适于注射0.1ml到1ml的反转录病毒上清液，优选0.5ml。
另外，如Culver等(1992)Science 256，1550-1552中所述，也可以注射产生反转录病毒的细胞。如此引入的产生反转录病毒的细胞是经工程化以活跃地产生反转录病毒载体颗粒的细胞，由此可在肿瘤团块内原位地不断出现上述的载体。因此，与生产反转录病毒载体的细胞混合后，增殖中的表皮细胞可在体内进行成功的转导。
被靶定的反转录病毒也可应用于本发明；例如可将赋予特异性结合亲和力的序列引入到预先存在的病毒env基因中(参见Miller &Vile(1995)Faseb J.9，190-199的有关综述，并可参考其他用于基因治疗的靶定载体)。
其他的方法涉及简单地将所述构建体递送到细胞中，在那里表达有限的时间，或者使所述构建体整合到基因组中后表达更长的时间。在后的方法包括脂质体法(Nssander等(1992)Caneer Res.52，646-653)。
有关免疫-脂质体的制备可按Martin & Papahadjopoulos所述的方法合成MPB-PE(N-[4-(对马来酰亚胺基苯基]丁酰基]-磷脂酰乙醇胺[(1982)J.Biol.Chem.257，286-288]。MPB-PE整合到脂质双分子层使抗体或其片段共价偶联到脂质体表面。所述的脂质体可方便地负载本发明的DNA或其他遗传构建体，将其递送到靶细胞，例如在DNA或其他的遗传构建体溶液中形成所述的脂质体，接下来在氮气压力达0.8MPa的条件下依次挤出穿过0.6微米和0.2微米孔径大小的聚碳酸酯膜过滤器。在挤出后，通过以80000×g超速离心45min使捕获的DNA构建体与游离的DNA构建体分离。在除氧缓冲液中把新鲜制备的MPB-PE-脂质体与新鲜制备的抗体(或其片段)相混合，在4℃、氮气气氛下恒定地颠倒旋转过夜来进行偶合反应。经80000×g超速离心45min将免疫脂质体与未偶联的抗体分离。免疫脂质体可经腹膜内地或直接地注射到肿瘤中。
其他的递送方法包括携带外部的DNA的腺病毒通过抗体-聚赖氨酸桥递送(参见Curiel Prog.Med.Virol.40，1-18)以及以转铁蛋白-聚阳离子共轭物作为载体递送(Wagner等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，3410-3414)。在第一种方法中，使用本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成聚阳离子-抗体复合物，其中，所述的抗体对于野生型的腺病毒或者引入了与抗体结合的新表位的腺病毒变异体是特异性的。聚阳离子部分通过与磷酸盐主链之间的静电相互作用与DNA相结合。由于包含不变的微丝和五邻体蛋白质，所述的腺病毒进入细胞内部并将本发明的DNA构建体也带入细胞。优选地，所述聚阳离子是聚赖氨酸。
所述的DNA也可被腺病毒递送，此时，DNA存在于腺病毒颗粒内部，例如如下所述的。
在一种可替代的方法中使用了运用受体-介导的胞吞作用将DNA大分子传送到细胞中的高效率核酸递送系统。这是通过将铁-转运蛋白—转铁蛋白与结合了核酸的聚阳离子偶联而完成的。人转铁蛋白或鸡同系物—伴清蛋白，或其组合通过二硫键共价连接到与小DNA-结合的蛋白鱼精蛋白或不同大小的聚赖氨酸上。这些经修饰的转铁蛋白分子保留了它们与相关受体结合的能力，并有效地介导铁向细胞内的运输。转铁蛋白-聚阳离子分子与本发明的DNA构建体或其他遗传构建体形成与核酸大小无关的(从短的寡核苷酸到21kb的DNA)电泳稳定的配合物。当将转铁蛋白-聚阳离子和本发明的DNA构建体或与其他遗传构建体组成的配合物应用到肿瘤细胞后，预期所述构建体可在细胞中高水平地表达。
也可以应用高效受体介导的递送本发明的DNA构建体或其他遗传构建体，这是利用由下述方法产生的缺失或以化学方法灭活的腺病毒粒子的核内体-分裂活性进行的Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6094-6098。该方法似乎是根据下述事实进行的，即腺病毒适合于在不通过溶酶体的情况下将它们的DNA从核内体中释放出来，当存在例如，与本发明的DNA构建体或其他遗传构建体相连的转铁蛋白时，细胞以与上述的腺病毒颗粒相同的路线将上述的构建体也吸收到细胞内。
这种方法的好处在于无需使用复杂的反转录病毒构建体；也不存在由于反转录病毒感染造成的永久性修饰；靶定的表达系统与靶定的递送系统相偶联从而减少了对其他细胞类型的毒性。
可以理解“裸DNA”和与阳离子及中性配合的DNA均可用于将本发明的DNA引入待治疗的个体。非病毒基因治疗方法描述在Ledley(1995)的Human Gene Therapy 6，1129-1144。
已知的其他靶向递送系统如WO 94/10323中所述的经修饰的腺病毒系统，其中，典型地，所述DNA在腺病毒或腺病毒样颗粒内运载。Michael等(1995)Gene Therapy 2，660-668描述了对腺病毒进行修饰，用以向纤维蛋白质中引入细胞选择性的基元。如Bischoff等(1996)Science 274，373-376中所述，可选择性地在p53-缺陷的人肿瘤细胞中复制的腺病毒突变体，也可以用于向细胞中递送本发明的遗传构建体。因此、可以理解本发明的又一方面是提供包含本发明的遗传构建体的病毒或病毒样颗粒。其他适合的病毒或病毒样颗粒包括HSV，AAV，牛痘和细小病毒。
本发明的遗传构建体可利用本领域中已知的方法制备。
尽管多肽或多核苷酸可单独施用，但优选将其与一种或多种可接受的载体制成药物制剂。所述的载体必须是“可接受的”是指其适合于本发明的化合物并且对施用受体无害。典型地，所述载体是无菌无热源的水或盐水。
下面参照附图和实施例对本发明进行更详细的描述，其中

图1显示利用PCR确定纤丝聚集蛋白重复单元数目的方法鉴定个体基因组中纤丝聚集蛋白原的等位基因。
图2显示每个染色体对上的纤丝聚集蛋白重复单元数目与角质层NMF水平的关系。Spearman相关性R＝0.47；p＝0.036；n＝20。
图3显示每个染色体对上的纤丝聚集蛋白重复单元数目与角质层NMF水平，包括头皮病史的关系。具有1或12个以上重复单元等位基因的头皮屑％＝67％以上；无12重复单元等位基因的头皮屑％＝17％
图4显示用1％SLS贴(patching)48小时后红斑值与纤丝聚集蛋白原等位基因型之间的关系。Mann-Whitney Rank Sum试验贴24小时后的红斑值无12个重复单元等位基因的一组人员和具有1个或12以上重复单元等位基因的一组人员(panellists)n＝43)之间存在显著差异(a)没有12重复等位基因的个体的SLS贴(patch)恢复；(b)具有1或12以上重复单元等位基因的个体的SLS贴恢复。
图5显示有或者没有12个重复单元等位基因的组员患自我察觉干燥的比例。Fisher’s Exact试验在存在或不存在12个重复单元等位基因与干燥的皮肤的频率(n＝89)之间存在统计上显著的关联(p＝0.0237)。
图6显示有或者没有11个重复单元等位基因的组员患可自我察觉的腿部皮肤干燥的比例。Fisher’s Exact试验在存在11个重复等位基因具有可见的皮肤干燥的组员的比例(n＝113)的之间存在统计上显著的关联(p＝0.099)。
图7显示在用1％SLS贴后4到48小时间，有或者没有12个重复等位基因的组员显示红斑减弱的比例。Fisher’s Exact试验在存在12个重复等位基因与贴后红斑减弱之间在统计上有显著的关联(p＝0.0587)实施例利用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(Qiagen)分离DNA，如Schie和Wilson(1997，Journal of immunological Methods，208，91 101)所述该方法适于唾液标本。将5ml唾液用5PBS(Sigma)稀释，在3000g下离心5mins。弃上清，将颗粒重悬于10ml PBS。将经重悬的颗粒在3000g下离心5mins，弃上清，将颗粒重悬于750μl的PBS中。依照试剂盒中的说明添加1ml试剂盒裂解缓冲液和100μl试剂盒蛋白酶。添加5μlRNA酶(7units/μl)然后混合，在70℃下温育20mins。添加1ml无水乙醇然后按试剂盒中的说明纯化DNA。用300μl试剂盒中的洗脱缓冲液将最终所得的制剂洗脱，然后所得的洗脱液再过一次柱以浓缩所得制剂。将洗脱液分小份保存在-20℃下。
通过分光光度测定对1/10稀释物进行DNA进行定量(Sambrookand Russell，(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual.3rdedition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，USA)。
在50μl体积中以下述条件进行PCR反应150ng基因组DNA样品；终浓度200μM dNTPs；200μM终浓度的正向引物(5＇GGA TGAAGC CTA TGA CACCAC 3＇)和反向引物(5＇GA CAG GAA AAG ATAACT TCC C 3＇)；终浓度1.7mM的Mg2+。对50μl Elongase(GIBCOBRL Life Technologies)反应，使用3μl缓冲液A+7μl缓冲液B。PCR反应按下述条件进行加热反应到94℃维持5min添加Elongase反应混合物稀释至1/50(HOT START)开始程序94℃ 5min 1个循环 4℃浸泡利用本领域已知的技术通过凝胶电泳分析PCR产物(Sambrookand Russell，(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual.3rdedition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，USA)。向一小份PCR产物中添加载样缓冲液GIBCO-BRL至lx终浓度。在0.6％琼脂糖凝胶(1*TBE Sigma)上在30V电压下进行凝胶电泳使20μl PCR产物按大小分级分离(用Life Technologies的延伸梯标记)。
实施例1一组43名随机选择的女性提供了用于DNA分析的唾液样品和有关皮肤状况史的信息。给小组成员贴1％SLS(十二烷基硫酸钠)24小时，记录贴4，24和48小时后红斑的程度。在一个独立的研究中，20名随机选择的不同性别的个体提供了用于DNA分析的唾液样品，用于NMF分析的氰基丙烯酸酯biposies(Marks(1972)British journal ofDermatology 8620-26)以及皮肤和头皮病史信息。从唾液样品中提取基因组DNA，通过PCR分析确定每一个体的纤丝聚集蛋白原基因型(图1)。用标准的TNBS试验确定角质层的NMF含量(Hazra等1984Analytical Biochemistry 137437-443)并归一化到总蛋白。
以下述频率鉴定了全部三种变异体10个重复单元(18％)，11个重复单元(60％)，和12个重复单元(22％)。
每对染色体上纤丝聚集蛋白重复单元数与角质层NMF水平的关系图揭示出这两种参数间的直接关系(图2)。具有高重复单元数的个体具有高NMF水平。皮肤和头皮病史揭示出声称有头皮屑的个体带有1或1个以上拷贝的12个重复单元的等位基因(图3)。这些结果提示在个体基因组中12个重复单元等位基因的存在与个体对头皮屑的敏感度相关。
贴SLS后的红斑值曲线图揭示出带有1或1个以上12个重复单元等位基因的个体在接受刺激48小时后具有低的红斑值。这些结果表明12重复单元的基因存在与洗涤剂刺激后皮肤屏障的恢复相关。
实施例2由随机选择的140人组成一组，组中成员提供了进行DNA分析的唾液样品和有关皮肤状况史的信息。根据小组成员对问卷所作的回答将他们分成可自我察觉的经常性干燥皮肤的‘经常性组’(包括总是，每日的和每周)，和“非经常性组”(每月的或较少发生)。连续5天对未进行治疗的小组成员腿部皮肤进行目测评估，然后将小组成员归为“无皮肤干燥组”(3次或3次以上评定没有可见的干燥)或“皮肤干燥组”(2次以上发现可见的干燥)。小组成员经贴1％SLS(十二烷基硫酸钠)24小时，记录接触4，24和48小时后红斑的程度。从唾液样品中提取基因组DNA，通过PCR分析确定每一个体的纤丝聚集蛋白原的基因型(图1)。
以下述频率对全部三个变异体进行鉴定10个重复单元(24％)，11个重复单元(56％)，和12个重复单元(20％)。
自称经常患干燥皮肤的成员中，具有至少12个重复单元等位基因的成员的比例仅占6％，而无12个重复单元等位基因的成员的比例占27％(图5)。这些表明12个重复等位基因与自我察觉的干燥皮肤倾向降低相联系。
显示出可见的腿皮肤干燥的小组成员中，具有至少11个重复单元等位基因的成员比例为73％，而无11个重复单元等位基因的成员比例仅为52％(图6)。这表明11个重复单元等位基因与可见的腿干燥症倾向加重相关。
贴SLS后4到48小时间表现出红斑减少的小组成员中，至少具有12个重复单元等位基因的成员比例为66％，无12个重复单元等位基因的成员比例仅为47％(图7)。这再一次表明12个重复单元等位基因与受洗涤剂刺激后皮肤恢复倾向增强相关。
序列表<110>Unilever plc<120>皮肤处理<130>J3611<150>GB0111324.0<151>09 May 2001<160>2<170>SeqWin99<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>侧翼探针<400>1ggatgaagcc tatgacacca c21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>侧翼探针<400>2gacaggaaaa gataacttcc c2权利要求
1.一种确定个体对皮肤状况的倾向的方法，该方法包括对来自该个体体内样品基因组中的纤丝聚集蛋白原的等位基因进行鉴定。
2.如权利要求1所述的方法，用于确定个体产生天然保湿因子(NMF)的能力。
3.如权利要求1或2所述的方法，用于确定个体对干燥性皮肤的倾向。
4.如权利要求1或2所述的方法，用于确定个体对洗涤剂诱导的红斑的倾向。
5.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，通过确定由各等位基因编码的纤丝聚集蛋白重复单元数目来鉴定纤丝聚集蛋白原的等位基因。
6.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，所述的来自体内的样品是从口腔收集的样品。
7.如前述任何一项权利要求所述的方法，其包括下述步骤(a)从来自体内的样品中提取DNA作为底物；(b)扩增底物中给定的区域，所述的给定区域包括纤丝聚集蛋白重复单元编码序列；和(c)通过确定所产生的扩增产物的大小确定存在于样品基因组中的纤丝聚集蛋白原的等位基因。
8.如权利要求7所述的方法，其中，步骤(b)通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
9.如权利要求8所述的方法，其包括提供具有下述序列的寡核苷酸对，所述的序列指能与底物DNA在纤丝聚集蛋白重复单元编码序列两侧杂交的序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中寡核苷酸对中的一个具有如下的序列5′GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3′。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中，寡核苷酸对中的一个具有如下的序列5′GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3′。
12.如权利要求7-11中任意一项所述的方法，其中，所述的扩增是利用0.1到30ng/ml DNA底物，2μM到2mM dNTPs，2μM到2mM正向和反向引物，以及17μM到170mM Mg2+进行的。
13.如前述任意一项权利要求所述的方法，用于为临床典型对象调查的目的将个体分组。
14.如权利要求1-12中任意一项所述的方法，用于使个体与个人护理产品匹配。
15.一种确定个体对皮肤状况的倾向的系统，该系统包括鉴定来自该个体的样品基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因的工具。
16.含纤丝聚集蛋白原等位基因序列或其变异体或片段的多肽，或编码所述多肽、变异体或片段的多核苷酸在制备用于处理个体皮肤状况的组合物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述个体的纤丝聚集蛋白原基因型已通过如权利要求1-14中任意一项中所述的方法进行了鉴定。
18.如权利要求16或17所述的用途，其中，所述的皮肤状况与NMF的生产相关。
19.如权利要求16-18中任意一项所述的用途，其中，所述的皮肤状况是干燥性皮肤。
20.一种多核苷酸，其包括下述序列5′GGA TGA AGC CTA TGACACCAC 3′或5′GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3′。
21.权利要求20所定义的多核苷酸在确定个体对皮肤状况的倾向中的用途。
22.一种鉴定适合个体使用的个人护理产品的方法，该方法包括鉴定个体的纤丝聚集蛋白原基因型并选择已知适合用于所确定出的纤丝聚集蛋白原基因型的个人护理产品。
23.如权利要求22所述的方法，其进一步包括提供适用于具有所确定的纤丝聚集蛋白原基因型的个体的个人护理产品。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述的个人护理产品是保湿性的皮肤护理产品。
25.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述的个人护理产品是洗涤剂基洗涤产品。
全文摘要
本发明提供一种确定个体对皮肤状况的倾向的方法，该方法包括鉴定来自该个体体内样品基因组中的纤丝聚集蛋白原等位基因的工具。皮肤状况包括个体产生天然保湿因子的能力、干燥性皮肤和/或皮肤患洗涤剂诱导的红斑的倾向。典型地，纤丝聚集蛋白原等位基因是通过确定编码纤丝聚集蛋白重复单元数目鉴定的。本发明的方法对以参与临床实验或使个体与化妆品制剂相匹配为目的将个体归组特别有用。
文档编号G01N33/50GK1551923SQ02813885
公开日2004年12月1日 申请日期2002年5月7日 优先权日2001年5月9日
发明者R·S·金格, R S 金格 申请人:荷兰联合利华有限公司