专利名称：一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定蛋白质的方法，尤其是一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法。
(2)背景技术花菁染料属一类化合物，访类染料最早作为光敏剂，应用于照相化学工业中，或作为能量转换与储存材料，例如太阳能电池用色素或激光染料。近年来发现该类化合物具有长波荧光(600～1000nm)发射，因而逐渐应用于荧光分析，结合激光诱导荧光(Laserinduced-fluorescence，LIF)技术及毛细管电泳(Caterpillar electroporesis，CE)技术或色谱分离技术，该类化合物已用于核酸的测序(Shealy，D.B.et al.Anal.Chem.，1995，67，247；Shealy，D.B.et al.Appl.Spectrosc.，1995，49，1815)以及蛋白质(Sauda，K.et al.Anal.Chem.，1986，58，2649；Williams，R.et al.Anal.Chem.，1993，65，601)、氨基酸(Flanagan，J.H.et al.Anal.Chem.，1995，67，341)及其它小分子(Imasaka，T.et al.Anal.Chem.，1984，56，1077)的超微量分析中。
利用蛋白质与一些染料在酸性溶液中的结合反应所形成的蛋白质-染料复合物吸光度的变化(一般倾向于采用吸光度的增加)可以对蛋白质进行定量测定，这就是染料结合法。染料结合法已在生物化学实验及临床分析中得到广泛应用，如考马斯亮蓝(CBB)G-250染料结合法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)测定样品总蛋白及溴甲酚绿法(张德安等编著.生物大分子实验手册.吉林大学出版社，第1版，1991.377)测定血清白蛋白。人们还发表了许多利用染料结合法进行蛋白定量的方法，但其灵敏度相对考马斯亮蓝法而言并无实质性提高。
(3)发明内容本发明旨在提供一种测定灵敏度高，测定波长位于近红外波长区，以减少样品中某些物质的干扰，工作曲线线性关系好的基于染料结合原理测定微量蛋白质的方法。
本发明的步骤如下1)在容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液；2)加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度；
3)逐瓶加入花菁溶液；4)放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量吸光度的增加值。
在一系列容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液，所用容量瓶最好不少于3个，蛋白质水溶液的系列浓度可落在相应的工作曲线线性范围内；所谓的相应工作曲线线性范围是指对应于所用花菁溶液浓度所决定的测定蛋白质浓度的线性工作曲线范围。
所加入的酸性缓冲溶液是指pH 1.0～4.0的各种酸性缓冲溶液。
所加入的花菁溶液为终浓度介于2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相应量的花菁溶液，加入花菁溶液后放置的时间在6分钟左右，可在883～922nm的波长范围内测定吸光度。
所说的花菁为分子式C34H38N2ClS2O6Na结构式 英文名称5-sulfoate-2-[4’-chloro-7’-(5”-sodiumsulfoate-1”-ethyl-3”，”-dimethylindolin-2”-ylidene)-3’，5’-(propane-1，3-diyl)-1’，3’，5’-heptatrien-1’-yl]-1-ethyl-3，3-dimethyl-3H-indolium中文名称水溶性七次甲基花菁，简称HMC或花菁。
所说的花菁依如下程序合成1)化合物(1)(2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成在100mL圆底烧瓶中，加入3-甲基-2-丁酮25.2mL，对肼基苯磺酸15g以及冰醋酸45mL，混合物回流5小时。以旋转蒸发器抽除冰醋酸，得粉红色粘稠状物。在加热情况下以尽可能少的甲醇溶解，慢慢加入以KOH饱和的异丙醇溶液，至反应瓶中液体由棕红色变为土黄色(此时pH5～6)。于1～4℃中放置，有大量黄色固体析出。过滤，以无水乙醚洗涤。 2)化合物(2)(1-ethyl-2，3，3-trimethylindoleninium-5-sulfonate)的合成 取化合物(1)3g以及15mL碘乙烷于50mL圆底烧瓶中回流24小时。反应混合物冷却，倾去未反应的碘乙烷。所得固体以丙酮处理三次(15mL×3)以除去生成的碘化钾，得亮紫色易吸湿固体，置干燥器中保存。
3)化合物(3)(2-chloro-l-formyl-3-hydroxymethylenecyclohexene)的合成 在以冰水浴冷却的40mL DMF及40mL CH2Cl2混合液中，逐滴滴入37mL POCl3与35mLCH2Cl2的混合液；然后再滴加10g的环己酮。滴加完毕后，混合液在氮气氛下回流3小时，冷却至室温，所得红色反应混合物慢慢加入到200g碎冰中(勿使水解剧烈而致温度升高)，放置过夜。滤去液体，所得棕红色固体以预先冷冻的丙酮洗涤数次至固体呈亮黄色。
4)目标化合物(花菁)的合成
在50ml圆底烧瓶中，称取化合物(2)1.02克，化合物(3)0.347克，以30ml醋酸酐溶解，再加入470毫克无水NaAc。于氮气氛下室温搅拌6小时，倒出反应混合物，于其中加入适量无水乙醚至无沉淀析出，倾去上清液，沉淀物以甲醇溶解(不溶物为醋酸钠)，洗涤残渣，收集滤液，减压浓缩，以快速柱层析法分离，收集绿色组分，得270毫克草绿色且具金黄色金属反射光泽的晶体，产率约20％。
合成的目标化合物(花菁)结构表征数据如下1H NMR(500 MHz)(ppm，DMSO-d6)1.3(t，J＝7.0Hz，6H)，1.68(s，12H)，1.86(m，J＝5.6Hz，2H)，2.72(t，J＝5.7Hz，4H)，4.26(q，J＝7.0Hz，4H)，7.8(d，J＝1.2Hz，2H)，7.68(dd，J＝1.4Hz，8.3Hz，2H)，7.38(d，J＝8.3Hz，2H)，6.34(d，J＝14.1Hz，2H)，8.26(d，J＝14.1Hz，2H).IR(KBrPellet)1640，1475，1390，1252，1167，1061，824，728，668cm-1MS，m/z694.4(M++1，22)，693.4(M+，42)，671.4(M++1-Na，100)。Rf＝0.46(薄层层析用硅胶板，自制)CHCl3/MeOH＝4/1(v/v)。m.p.202-205℃本发明所合成的七次甲基花菁染料在酸性条件下，蛋白质存在时，在904nm处出现一新的吸收峰，且吸光度(ABS)的增加与蛋白质含量的增多成正比，据此建立了以染料结合法为原理进行蛋白质定量的新方法。相对于传统的染料结合法，本发明的独特优点有试剂无本底吸收，因而可用水或缓冲溶液做空白调零；蛋白质-染料复合物摩尔吸收系数大，在同等浓度的蛋白质条件下，本发明所引起的测定体系的吸光度的增强最显著，测定的灵敏度高(测定5000ng/mL牛血清白蛋白时，考马斯亮蓝法引起吸光度增加值为0.275OD(见Bradford，M.M.Anal.Biochem.，1976，72，248)，而测定2000ng/mL牛血清白蛋白时，本发明引起吸光度增加值为0.900OD；若以A＝0.02计，本发明的最低检出量为100～200ng/mL，比现有的各种染料结合法灵敏度提高近10倍。)；测定波长大于900nm，位于近红外波长(700～1000nm)区，可消除样品中可能存在的长波强吸收物质，如溶血等对测定的干扰。
本发明的工作曲线线性关系良好，而考马斯亮蓝法有时会出现工作曲线的非线性现象。
(4)
图1为花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH 2.6时的吸收光谱。
图2为花菁染料-蛋白质复合物的稳定性曲线。
图3为测定不同种类蛋白质的响应曲线。
(5)
具体实施例方式
以下给出优化条件下实验操作举例。
在一系列10 mL容量瓶中依次加入0.0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL浓度为20ug/mL的人血清白蛋白(HSA)水溶液，再依次加入1.0mL pH 2.6的甘胺酸-盐酸缓冲溶液，以水稀释至满刻度并摇匀。然后逐瓶加入0.3mL浓度为1.0×10-4mol/L的花菁溶液，摇匀。放置40min后，以缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或在904nm处测量吸光度。各组分参数见下表
以下给出其它条件下本发明对蛋白质的响应。
1)不同pH体系对蛋白质的响应系列浓度蛋白质在不同pH时所引起的吸光度变化见下表。
aHCl-KCl体系bHac-NaAc体系
a邻苯二甲酸氢钾-HCl体系bBritton-Robinson体系c0.01N HCl体系d0.005N H2SO4体系可见，在pH1.0～4.0范围内，可用七种体系来调控pH值甘胺酸-HCl体系；HAc-NaAc体系；HCl-KCl体系；邻苯二甲酸氢钾-HCl体系；Britton-Robinson体系；稀浓度的HCl体系及稀浓度的H2SO4体系。
2)不同测定波长时体系对蛋白质的响应不同波长处测定系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
3)体系在不同测定时间对蛋白质的响应不同时间测定系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
不同时间测定同一浓度蛋白质的吸光度数值见下表。
4)体系在不同花菁浓度时对蛋白质的响应使用不同花菁浓度时系列浓度蛋白质所引起的吸光度变化见下表。
以下结合附图对本发明作进一步的说明。
1)近红外花菁染料的吸收光谱图1为花菁染料及花菁-牛血清白蛋白(BSA)混合物在pH2.6时的吸收光谱。
从图1中可以看出，当不存在BSA时，花菁最大吸收峰位于776nm，在904nm处无吸收；加入BSA后，776nm处的吸光度随BSA浓度增大而降低并略红移，而904nm处则出现新的吸收峰且其吸光度随BSA浓度增大而增大。在图1中，HMC的浓度为3.0×10-6mol/L；BSA的浓度(ng/mL)为(1)0，(2)400，(3)800，(4)1200，(5)1600；WL为测定波长。
2)染料—蛋白质复合物的稳定性图2为花菁染料—蛋白质复合物的稳定性曲线。
在实验条件下，染料与蛋白质作用后，形成的染料—蛋白质复合物在40分钟时吸光度达到最大并至少在80分钟内是稳定的，在图2中，HMC的浓度为3.0×10-6mol/L；BSA的浓度2400ng/mL，甘胺酸-盐酸缓冲溶液pH2.6。
3)对不同种类蛋白质的响应图3为测定不同种类蛋白质的响应曲线。
在实验条件下建立测定不同种类蛋白质的标准工作曲线。测定BSA的线性范围是200～2000ng/mL，回归方程为A＝-0.085+4.874×10-4C(Cng/mL)，线性相关系数γ＝0.9976。对1200ng/mL BSA的七次平行测定的相对标准偏差(RSD)为2.19％。测定人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的线性范围是100～2400ng/mL，回归方程为A＝-0.048+5.706×10-4C(Cng/mL)，线性相关系数γ＝0.9987。测定人血丙球蛋白(IgG)的线性范围是200～3000ng/mL，回归方程为A＝-0.060+3.427×10-4CA＝(Cng/mL)，线性相关系数r＝0.9984。测定卵清蛋白(ovalbumin)的线性范围是300～4000ng/mL，回归方程为A＝-0.027+2.425×10-4CA＝(Cng/mL)，线性相关系数r＝0.9990。由此可见，该方法对于不同种类的蛋白质有不同的响应，因而在蛋白质测定时应以同源的蛋白质作为标准。
权利要求
1.一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于步骤如下1)在容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液；2)加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度；3)逐瓶加入花菁溶液；4)放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量吸光度的增加值。
2.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于所说的容量瓶至少3个。
3.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于所说的蛋白质水溶液的系列浓度落在相应的工作曲线线性范围内，所说的相应工作曲线线性范围是指对应于所用花菁溶液浓度所决定的测定蛋白质浓度的线性工作曲线范围。
4.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于所加入的酸性缓冲溶液是指pH 1.0～4.0的酸性缓冲溶液。
5.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于所加入的花菁溶液为终浓度介于2.0×10-6～1.0×10-5mol/L所相应量的花菁溶液。
6.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于加入花菁溶液后放置的时间至少6分钟。
7.如权利要求1所述的一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法，其特征在于在883～922nm的波长范围内测定吸光度。
全文摘要
涉及一种测定蛋白质的方法，尤其是一种基于染料结合原理在近红外波长区测定微量蛋白质的方法。步骤为在容量瓶中依次加入浓度递增的蛋白质水溶液；加入酸性缓冲溶液，以水稀释至满刻度；逐瓶加入花菁溶液；放置，以水或相应缓冲溶液为参比扫描吸收光谱或测量吸光度的增加值。测定灵敏度高，测定波长位于近红外波长区，以减少样品中某些物质的干扰，工作曲线线性好；试剂无本底吸收，可用水或缓冲溶液做空白调零；蛋白质－染料复合物摩尔吸收系数大，在同等浓度的蛋白质条件下，所引起的测定体系的吸光度的增强最显著，测定的灵敏度高，测定波长大于900nm，位于近红外波长区，可消除样品中可能存在的长波强吸收物质，如溶血等对测定的干扰。
文档编号G01N21/31GK1401988SQ0212846
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者郑洪 , 李东辉, 毛玉霞 申请人:厦门大学