专利名称：检测分析物的含尿素衍生物染料的组合物及其使用方法
介绍迄今已经开发的许多方案和装置利用产生信号系统来鉴定生理样品如血液中感兴趣分析物的存在。在各种不同分析物检测中发现用途的一类产生信号系统是氧化酶或过氧化物酶氧化感兴趣的分析物并产生过氧化氢的系统。然后用与染料底物发生随后的酶催化反应而产生可检测的产色产物来检测过氧化氢。这种信号产生系统中有用的染料通常产生敏感性高的可见颜色信号。
各种高敏感性染料通常用于产生过氧化物产生信号的系统。然而，许多高敏感性染料如尿素衍生物染料由于其稳定性(如对氧化，光)，限于固相和/或溶液。
尽管已经开发了含高敏感性染料的组合物，仍旧需要进一步开发这样的组合物。例如，包括高敏感性尿素衍生物染料且抗氧化的固相组合物将有极大的兴趣。相关文献使人感兴趣的专利包括JP1118768；JP9019296；EP38 205，EP124 287和EP251297。也参见Yagi等人(1986)Biochem.Int.12367-371。
发明概述提供了组合物、试剂测试条、分析物检测系统及其试剂盒，以及它们用于检测样品中分析物的方法。本组合物的特征在于具有正电荷多孔基质和该基质至少一个表面上的尿素衍生物染料，其中在许多优选实施方案中，尿素衍生物染料是负电荷尿素衍生物染料。在许多优选实施方案中，本组合物进一步包括至少一种产生过氧化物的产信号系统的另外的试剂成员，如分析物氧化酶和/或过氧化物酶。本组合物、测试条、分析物检测系统和试剂盒用于样品，如生理样品，如血液或其成分中广泛分析物的检测。
附图简述
图1和2提供了各种商业上得到的染料底物(1mM)与辣根过氧化物酶(1mg/mL，549U/mg)和过氧化氢(50μM)在pH7.4 PBS缓冲液(0.02M)中反应后的UV吸光度的图式表示。
图3提供了过氧化氢浓度对DA-67和TOOS-4AP涂布的One-Touch尼龙膜的作用的图式表示。用分别含5mM TOOS和4AP、1mg/mlHRP和1％PVP(360K)的0.02M PBS、pH7.4溶液涂布TOOS-4AP条。用2.5mM DA-67、1mg/ml HRP、1％PVP(360K)在0.5M pH8.0磷酸盐缓冲液中的溶液涂布DA-67条。
具体实施例方式
描述提供了组合物、试剂测试条、分析物检测系统及其试剂盒，以及它们用于检测样品中分析物的方法。本组合物的特征在于具有带正电荷的多孔基质和该基质至少一个表面上的尿素衍生物染料，其中在许多优选实施方案中，尿素衍生物染料是负电荷尿素衍生物染料。在许多优选实施方案中，本组合物进一步包括至少一种产生过氧化物的产信号系统的另外的试剂成员，如分析物氧化酶和/或过氧化物酶。本组合物、测试条、分析物检测系统和试剂盒用于样品，如生理样品，如血液或其成分的广泛分析物的检测。在进一步描述本发明中，首先讨论本组合物，随后回顾组合物发现用途和包括本组合物的系统和试剂盒的代表性应用。
在进一步描述本发明之前，应该理解本发明不限于下述发明的特定实施方案，因为可以进行特定实施方案的变型且仍落在所附权利要求的范围内。也应该理解使用的术语是为了描述特定实施方案的目的，不意欲限制。相反，本发明的范围将由所附权利要求确定。
在本说明书和所附权利要求中，单数形式包括复数，除非文中有清楚的相反指示。除非有相反定义，所有这里使用的技术和科技术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含意相同。组合物和试剂测试条如上总结，本发明提供了用于检测样品中广泛分析物的组合物。该组合物包括正电荷多孔基质和该基质至少一个表面上的尿素衍生物染料。然而，在许多实施方案中，该组合物进一步包括至少一种产生过氧化物的产信号系统的另外的试剂成员，典型地包括多个产信号系统成员。该试剂组合物是干燥组合物，如典型地在试剂测试条中发现。特别是，本发明提供了检测全血中特定分析物如葡萄糖、醇、糖基化蛋白等的条。从最广的意义上来说，该试剂测试条包括正电荷多孔基质和存在于所述基质上的产生过氧化物的产信号系统，该系统包括尿素衍生物染料。在多数实施方案中，存在于所述基质上的产信号系统进一步包括分析物氧化酶。
现在更详细地进一步描述上述元件。正电荷多孔基质本测试条中使用的基质是为产信号系统的各个成员(下述)提供支持的惰性多孔基质，且具有正电荷。该基质配置提供施用生理样品如血液，和检测产信号系统的染料产生的产色物质的位置。这样，该基质是允许含水液体流过并提供足够的用于产信号系统发生化学反应占据的空隙空间的基质。已经开发大量不同的正电荷多孔基质用于各种分析物检测试验，其中基质可以根据材料、孔尺寸、大小等等而不同，其中代表性的基质包括美国专利号55,932,431；5,874,099；5,871,767；5,869,077；5,866,322；5,834,001；5,800,829；5,800,828；5,798,113；5,670,381；5,663,054；5,459,080；5,459,078；5,441,894和5,212,061中描述的那些；通过引用将这些专利并入本文。测试条的大小和孔隙率可以大大变化，其中基质可以具有或可以不具有孔隙率梯度，如较大孔接近或位于样品施用区和较小孔位于检测区。可使用带正电荷的聚合物如聚酰胺来制备正电荷膜。或者，可用各种技术制备这样的膜，如使用阳离子表面活性剂或聚合物涂布表面。该涂层可通过浸渍涂布、化学处理、photografting、等离子体聚合等来涂布。在其它实施方案中，可以通过一种或多种正电荷材料与成膜聚合物共混的方法制备该膜。正电荷聚合物的实例是聚酰胺、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)、聚(烯丙基胺)、聚(乙烯基苄基二甲基氯化铵)、聚赖氨酸。阳离子表面活性剂的实例包括含伯、仲和季氨基的那些。该材料可以或可以不官能化来提供产信号系统各种成员的共价或非共价连接，下面更详细描述。
在许多实施方案中，该基质配置成膜测试垫并固定于固体载体上，其中载体可以是塑料(如聚苯乙烯、尼龙或聚酯)或金属片或本领域已知的任何其它合适的材料。在许多实施方案中感兴趣的是美国专利号5,972,294；5,968,836；5,968,760；5,902,731；5,846,486；5,843,692；5,843,691；5,789,255；5,780,304；5,753,452；5,753,429；5,736,103；5,719,034；5,714,123；383,550；381,591；5,620,863；5,605,837；5,563,042；5,526,120；5,515,170；367,109；5,453,360；5,426,032；5,418,142；5,306,623；5,304,468；5,179,005；5,059,394；5,049,487；4,935,346；4,900,666和4,734,360中公开的测试条结构，通过引用将这些专利并入本文。信号产生系统除了正电荷多孔基质，本测试条进一步包括产信号系统的一种或多种成员，该系统对分析物存在应答产生可检测产物，可检测产物可用于得到所检测样品中存在的分析物的量。在本测试条中，产信号系统的一种或多种成员关联，例如与至少一部分(即检测区)正电荷多孔基质，和在许多实施方案中与基本上全部正电荷多孔基质共价或非共价连接。
产信号系统是分析物氧化产信号系统。分析物氧化产信号系统是指在产生取得样品中分析物浓度的可检测信号中，分析物被合适的酶氧化产生氧化形式的分析物和相应的或成比例量的过氧化氢。然后又利用过氧化氢，从一种或多种指示剂化合物产生可检测产物，然后，产信号系统产生的可检测产物即信号的量与最初样品中分析物的量相关。这样，本测试条中存在的分析物氧化产信号系统也可以正确描述特性为基于过氧化氢的信号产生系统或产生过氧化物的产信号系统。
如上指出，基于过氧化氢的产信号系统包括氧化分析物并产生相应量过氧化氢的酶，其中相应量是指产生的过氧化氢量与样品中存在的分析物的量成比例。这第一个酶的特异性质需要依赖于正检测的分析物的性质，但通常是氧化酶。这样，该酶可以是葡萄糖氧化酶(分析物是葡萄糖)；胆固醇氧化酶(分析物是胆固醇)；醇氧化酶(分析物是醇)；甲醛脱氢酶(分析物是甲醛)；谷氨酸盐(酯)氧化酶(分析物是L-谷氨酸)、甘油氧化酶(分析物是甘油)、半乳糖氧化酶(分析物是半乳糖)；酮胺氧化酶(分析物是糖基化蛋白，例如果糖胺)；3-羟丁酸盐(酯)脱氢酶(分析物是酮体)、L-抗坏血酸盐(酯)氧化酶(分析物是抗坏血酸)、乳酸盐(酯)氧化酶(分析物是乳酸)、亮氨酸氧化酶(分析物是亮氨酸)；苹果酸盐(酯)氧化酶(分析物是苹果酸)、丙酮酸盐(酯)氧化酶(分析物是丙酮酸)、尿酸盐(酯)氧化酶(分析物是尿酸)等等。其它与这些或其它感兴趣分析物使用的氧化酶是本领域技术人员已知的并且也可以使用。
产信号系统也包括在过氧化氢存在下，催化染料底物转变为可检测产物的酶，其中这个反应产生的可检测产物的量与存在的过氧化氢量成比例。这第二个酶通常是过氧化物酶，合适的过氧化物酶包括辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶、重组产生的过氧化物酶和具有过氧化活性的合成类似物等等。参见如Ci等(1990)AnalyticaChimica Acta，233299-302。
在过氧化物酶存在下，过氧化氢氧化染料底物产生在预先确定的波长范围内吸收光线的产物，即指示剂染料。优选指示剂染料在与样品或测试试剂强烈吸收波长所不同的波长处吸收强烈。氧化形式的指示剂可以是着色的、微弱着色的、或无色的最终产物，证明膜测试侧颜色改变。也就是说，测试试剂可通过着色区域变白或可供选择地通过无色区域显色来指示样品中分析物的存在。
可用在本发明中的染料底物包括尿素衍生物染料。尿素衍生物染料至少包括JP1118768；JP9019296；EP38 205，EP124 287和EP251297中公开的一些；通过引用将这些文献并入本文。染料底物通常是尿素衍生物，具有负电荷，合适的带负电荷的尿素衍生物包括承载着羧酸基或磺酸基的衍生物。感兴趣的尿素衍生物染料用下式表示R1R2NCONHR3，其中R1、R2一起代表N，N-二-取代的氨基芳基；和R3选自羧基烷基、烷氧羰基、烷基羰基、芳基磺酰基、磺基芳基和羧基芳基。
R1和R2的芳基可以通过S结合形成吩噻嗪衍生物类型的染料，用下式表示 其中R4和R5独立地选自NR2和OR，其中R是氢，(C1-C6)-烷基，(C1-C6)-烯基，芳基，取代的芳基，芳烷基，取代的芳烷基；R3是上面定义的；和R6和R7独立地选自氢，(C1-C6)-烷基，(C1-C6)-烯基，酰基，羧基，磺酰基，硝基，卤素，羟基，(C1-C6)-烷氧基或羟基-(C1-C6)-烷基。
或者，R1和R2的芳基可以通过O结合形成吩噁嗪衍生物类型的染料，用下式表示
在另一个实施方案中，R1和R2的芳基不结合，用下式二苯基胺表示 示例的尿素衍生物染料包括10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(隐色亚甲篮)，10-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺，10-丙酸吩噻嗪和它们的盐。在优选的实施方案中，尿素衍生物染料是10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪，钠盐。
由于组合物的性质，组合物的尿素衍生物染料成分是稳定的，即，与溶液状态，特别是含水溶液状态相比，耐氧化分解。这样，本组合物可在各种温度和湿度条件下保存，没有观察到颜色改变，即本组合物具有保存稳定性。本组合物和试剂测试条具有保存稳定性的代表性条件包括下述实验部分。基于这些发现，本组合物在范围大约至少-80℃至60℃的温度，通常大约-20℃至56℃，湿度范围至少大约0％至80％，通常大约5％至20％能稳定保持至少大约六个月至一年半的时间，通常大约九个月至一年。本组合物比包含中性或负电荷多孔基质如亲水聚砜膜或纤维素滤纸的组合物更稳定，这个稳定性增加的幅度至少大约一百倍。
可以使用任何方便的方案制造本试剂测试条。一个方便的方案是首先至少使条的测试垫部分接触包含试剂组合物所有成员的含水溶液，这些成员待与除尿素衍生物染料外的最终试剂测试条上的测试垫关联。方便地，测试垫可以浸于含水溶液中，在其中保持足够的一段时间，然后干燥。测试垫随后可浸于包含尿素衍生物染料的有机溶液，如70％甲醇溶液中，在其中保持足够的一段时间，然后干燥，由此产生了已与组合物关联的试剂测试条的测试垫。
如上陈述，含水溶液将包括与除尿素衍生物染料外的试剂测试条上的测试垫待关联的组合物的各个成员，有机溶液将包括尿素衍生物染料成员，其中所有成员存在的量足够提供在测试垫上产生的试剂组合物中的所期望的量。这样，分析物氧化酶的浓度典型的范围为从大约5×10-13至0.25mM，通常从大约0.05至0.10mM。类似地，当存在过氧化物时，其浓度范围为从大约5×10-4至0.125mM，通常从大约0.005至0.05mM。尿素衍生物染料的浓度典型的范围为从大约0.5至2mM，通常从大约0.8至1.2mM。含水溶液中可存在的用于制备试剂测试条的其它成分包括氯化钠、氯化镁、Tris、PSSA、Tetronic1307、crotein、蔗糖、草氨酸、钠盐、EDTA、甘露醇、聚合物如PVP和PVBTA等等。参见下面更详细描述制备本试剂测试条的代表性方法的实施例部分。分析物检测方法上述组合物，试剂测试条和产信号系统在检测样品中分析物的存在，通常是分析物量，的方法中发现用途。可以使用本方法检测各种不同的分析物，其中代表性分析物包括上述的那些，如葡萄糖、醇、甲醛、L-谷氨酸、甘油、半乳糖、糖基化蛋白、肌酸酐、酮体、抗坏血酸、乳酸、亮氨酸、苹果酸、丙酮酸、尿酸和类固醇等。尽管原则上，本方法可以用于确定各种不同生理样品如尿、泪液、唾液等中分析物的存在，通常是分析物的浓度，但是它们特别适合用于确定血液或血液成分如血液得到的样品更特别是全血中分析物的浓度。
本方法的重要的特征是使用包括尿素衍生物染料的本信号产生系统提供过氧化氢的高敏感性检测。这样，使用本发明稳定干燥试剂规格，如测试条可以检测亚毫摩尔(submillimolar)浓度的过氧化氢，其中亚毫摩尔浓度典型地是指浓度范围从0.010至1mM，通常从大约0.050至0.8mM。使用包括尿素衍生物染料的本产信号系统提供了与包括染料底物而不是尿素衍生物染料，如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺，4-氨基安替比林，的产信号系统相比，更敏感的过氧化氢检测(见图3)。
在本方法中，样品和包括尿素衍生物染料的产信号系统组合成反应混合物，如通过将样品施至测试条，该反应允许进行足够的一段时间以产生样品中存在分析物(通常是分析物的量)的信号指示，检测所得信号且它与样品中存在分析物(通常是分析物的量)相关。现在，根据使用试剂测试条的方法进一步讨论本方法。
在实施本方法时，第一步是将一定量生理样品施于测试条，其中测试条见上述。施于测试条的生理样品如血液的量可以变化，但通常范围为大约2μl至40μl，通常为大约5μl至20μl。当血液是生理样品时，可以用本方法检测各种不同血细胞比容的血液样品，血细胞比容范围可以为大约20％至65％，通常为大约25％至60％。
样品施于测试条后，允许样品与产信号系统的成员反应以产生可检测产物，其存在的量与样品中存在的感兴趣分析物最初的量成比例。然后，可检测产物的量，即产信号系统产生的信号并与最初样品中分析物的量联系起来。分析物检测系统可用于实施本方法的分析物检测系统包括试剂测试条和自动仪器。在这种系统中，将生理样品施于如上所述的测试条并用自动仪器检测产信号系统产生的信号与样品中分析物的存在(通常是分析物的量)联系起来。上述反应中，检测和联系步骤，和实施这些的仪器在美国专利4,734,360；4,900,666；4,935,346；5,059,394；5,304,468；5,306,623；5,418,142；5,426,032；5,515,170；5,526,120；5,563,042；5,620,863；5,753,429；5,573,452；5,780,304；5,789,255；5,843,691；5,846,486；5,902,731；5,968,836和5,972,294中进一步描述，将其通过引用并入本文。在联系步骤中，得到的分析物浓度考虑竞争反应对观察到的信号的恒定贡献，如通过相应校准仪器。
本分析物检测系统包括用于分析物确定的酶免疫试验系统，其中这样的系统包括形成条板的多个测试条，条板包括带正电荷的多孔基质和基质至少一个表面上的尿素衍生物染料，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中酶是过氧化物酶和条板进一步包括基质至少一个表面上的分析物-特异性抗体。试剂盒本发明也提供了用于实施本方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括如上所述含产生过氧化物的产信号系统的试剂测试条，和至少一种用于获得所述生理样品的工具，如刺手指用小刀，小刀开启工具等等，和分析物标准，如含标准化分析物浓度的分析物对照溶液。在某些实施方案中，试剂盒也包括自动仪器，如上所述，来检测样品施用后测试条上产生的产物的量和将检测产物与样品中存在的分析物(通常是分析物的量)联系起来。最后，试剂盒包括使用本试剂盒成分确定生理样品中分析物浓度的仪器。这些仪器可以存在于一个或多个包装的、插入标签的、存在于试剂盒中的容器中，等等。
以例证的方式而不以限制的方式提供下列实施例。
实施例实施例1.筛选商业上可得到的染料底物在水中或水/0.2M柠檬酸盐或水/0.2M柠檬酸盐/乙醇混合物中制备下面列出的各种染料原液。染料原液的浓度范围从8mM至50mM。也在0.02M PBS，pH7.4溶液中制备10mg/ml HRP原液。适当体积的染料原液、10mg/ml HRP原液和0.02M PBS缓冲液混合至[HRP]＝1mg/ml和[染料]＝1mM的终浓度而制备染料/HRP溶液。然后，200μl由此制备的染料/HRP加入微滴定板孔中，随后加入20μl 500mM H2O2溶液。颜色显色达到稳定状态(少于2分钟)后，用微滴定板读数器读出溶液的吸光度。
实施例2.制备涂布产生过氧化物信号产生系统包括DA-67的测试条One Touch尼龙膜切成1/4″宽、12″长的条，膜条首先用A浸渍溶液然后用B浸渍溶液(具体成分和浓度在下表中)涂布。每次涂布后，将膜在热气烤箱中55℃干燥10分钟。将涂布的膜粘贴在2″×12″聚酯薄膜(Melinex)载体上，载体沿其长度的每四分之一英寸开有5mm直径圆形孔用于颜色测定。聚酯薄膜也具有胶粘印制在孔顶和底的3/8″宽的两个条。将膜以完全覆盖聚酯薄膜上的孔的方式层合。通过胶粘印制到聚酯薄膜，将扩散样品Porex(1″×12″)层进一步层合于膜顶。然后将整个装配件切成1/4″宽的条。
实施例3.过氧化氢的检测为了证明在涂布稳定化DA-67染料的条上颜色显色的可行性，用含2.5mM DA-67、1mg/ml HRP和1％PVP(MW＝360K)在0.5M pH8.0磷酸盐缓冲液中的溶液涂布One Touch尼龙膜。然后，将膜粘贴于聚酯薄膜载体上，用Porex覆盖并切割成测试条如实施例2所述。将10μl体积各种浓度的H2O2溶液分别滴在测试条上，用Macbeth反射计监测颜色形成。为了比较DA-67染料与H2O2最常用染料TOOS-4AP的检测敏感性，用含5mM TOOS，5mM 4AP，Img/ml HRP和1％PVP(MW＝360K)在0.02M PBS，pH7.4中的溶液涂布One Touch尼龙膜。然后，膜用于制备测试条如实施例2所述并采用测试DA-67涂布条的方法用H2O2检测。结果在图3中作图。
上述结果和讨论明显得出本发明提供了有效检测分析物的基于显著稳定的高敏感尿素衍生物染料成员过氧化氢的产信号系统。这样，本发明提供了与某些现有组合物和方法，如依赖于不是尿素衍生物染料的染料底物的组合物和方法相比更敏感的分析物检测，为现有技术做出了显著的贡献。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，好像每一出版物或专利被具体和分别指出通过引用并入本文似的。任何出版物的引用是为了说明其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认由于先有发明在先出版物而不能赋予本发明权力。
尽管已经为了清楚理解目的以例证和实施例的方式有些详细地描述了前述发明，很明显，本领域普通技术人员根据本发明的教导，可以对其作出某些改变和变型，而不背离所附权利要求的精神或范围。
权利要求
1.物质的组合物，包括带正电荷的多孔基质；和所述基质至少一个表面上的尿素衍生物染料。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的正电荷多孔基质包括尼龙。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述的尿素衍生物染料是带负电荷的尿素衍生物染料。
4.根据权利要求1、2或3的组合物，其中所述的尿素衍生物染料具有式R1R2NCONHR3，其中R1、R2一起为N，N-二-取代的氨基芳基和R3选自羧基烷基、烷氧羰基、烷基羰基、芳基磺酰基、磺基芳基和羧基芳基。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述的尿素衍生物染料选自吩噻嗪衍生物染料、吩噁嗪衍生物染料和二苯胺衍生物染料。
6.根据权利要求1至5之任一项的组合物，其中所述的尿素衍生物染料是存在于所述基质上的产生过氧化物的产信号系统的成员。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述的组合物进一步包括至少一种产生过氧化物的产信号系统的另外的试剂成员。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述的至少一种另外的试剂成员是分析物氧化酶。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述的至少一种另外的试剂成员是过氧化物酶。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述的过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
11.根据前述权利要求之任一项的组合物，其中所述的尿素衍生物染料是10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐。
12.用于检测生理样品中分析物存在或确定其浓度的试剂测试条，所述测试条包括权利要求1至11之任一项的组合物。
13.分析物检测或测定系统，包括(a)权利要求12的试剂测试条；和(b)自动仪器。
14.检测样品中分析物的存在或确定其浓度的方法，所述方法包括(a)将所述生理样品施于权利要求12的试剂测试条；(b)检测由所述产信号系统产生的信号；和(c)将所述检测信号与所述生理样品中所述分析物的存在或浓度联系起来。
15.用于确定生理样品中分析物浓度的试剂盒，所述试剂盒包括(a)权利要求12的试剂测试条；和(b)下列至少一个(i)获得所述生理样品的工具和(ii)分析物标准。
全文摘要
提供了组合物、试剂测试条、分析物检测系统及其试剂盒，以及它们用于检测样品中分析物的方法。本组合物的特征是具有带正电荷的多孔基质和该基质至少一个表面上的尿素衍生物染料，其中在许多优选实施方案中，尿素衍生物染料是负电荷尿素衍生物染料。在许多优选实施方案中，本组合物进一步包括至少一种产生过氧化物的产信号系统的另外的试剂成员，如分析物氧化酶和/或过氧化物酶。本组合物、测试条、分析检测系统和试剂盒在样品，如生理样品，如血液或其成分的广泛分析物的检测中发现用途。
文档编号G01N21/78GK1454315SQ01814100
公开日2003年11月5日 申请日期2001年6月7日 优先权日2000年6月13日
发明者S·X·郭, K·-W·梁 申请人:生命扫描有限公司