专利名称：用于固定配体的基质的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及可在生化领域中使用的一种用于连续、高速地获得有关配体与受体间结合的大量信息的基质、一种使用该基质的仪器、一种用于检测配体与受体间结合的仪器和一种用于检测结合的方法。
在一项实施方案中，该配体的示例有核酸、糖类、肽或蛋白。核酸的示例有双链DNA或单链DNA，而DNA的示例有多核苷酸或寡核苷酸。优选的是，该基质可用于高速检测配体和能够与该配体结合的受体之间的结合。本发明所述基质的一个实例是，基质上的区域间距至少为1mm、基质上的区域密度小于100个区域/cm2、基质上的区域密度小于10个区域/cm2、基质上的区域数量为100或100以上，或基质上的区域数量为1000或1000以上。受体的示例包括能够与一种核酸、糖类、肽或蛋白结合的核酸、糖类、肽或蛋白。可以用带标记的受体作为受体。
第二方面，本发明涉及一种仪器，用于检测配体与受体间的结合，该仪器包括a)一种索状、带状或盘状基质，其表面的预定区域固定有多个不同的配体；
b)将基质暴露于至少能结合一种配体的受体的一种设备；以及c)检测受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域的一种设备。
第三方面，本发明涉及一种仪器，用于检测配体和受体之间的结合，该仪器包括一种设备，用于高速检测受体与表面预定区域固定有配体的索状、带状或盘状基质上多个不同配体中的一种配体之间发生结合的区域。
第四方面，本发明涉及一种方法，用于检测配体和受体之间的结合，该方法包括a)将表面预定区域固定有多个不同配体的索状、带状或盘状基质暴露于至少能结合其中一种配体的受体；并且b)检测受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域。
在第二至第四方面中，优选的是采用第一方面的基质。可以使用一种带标记的受体，并通过该标记来检测受体与基质上的配体之间发生结合的区域。优选的是用一种能够与作为配体的核酸、糖类、肽或蛋白结合的核酸、糖类、肽或蛋白来作为受体。
发明详述本发明的配体只需是一种能够被特异性受体识别并结合的分子，除此之外并无特别的限制。例如，该配体可以是一种核酸、一种糖、一种蛋白或一种肽。
配体的实例包括细胞膜受体的激动剂和拮抗剂、毒素和毒液、病毒表位、激素(如镇静剂、阿片制剂和类固醇)、激素受体、肽、酶、酶底物、辅因子、药物、外源凝集素、糖类、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、寡糖、蛋白和单克隆抗体。
本发明的受体只需具有与上述配体结合的能力，除此之外并无特别的限制。本发明的受体可以是天然分子，也可以是人造分子。受体的实例包括核酸、糖类、蛋白和肽，如酶、细胞表面蛋白(受体)、糖蛋白和抗体。
本发明的配体与能够结合该配体的受体的接触面特性彼此互补。
文中使用的术语“索状”是指物质的宽度小于带状物质的宽度，该术语包括索状、线状和绳状。索状基质可以由任何材料制成，条件是能够将配体固定在该基质表面的预定区域。带状基质是一种狭长的系带样基质。带状基质可以由任何材料制成，条件是能够将配体固定在该基质表面的预定区域。本发明的盘状基质是一种圆盘形基质，它可以由任何材料制成，条件是能够将配体固定在该基质表面的预定区域。
索状基质可以采用任何柔性或半柔性材料。理想的是在物理上分离的表面位置分布有多个配体固定化区域。带状基质可以采用任何柔性或半柔性材料。带状基质至少有一个面基本上为平面。理想的是在物理上分离的表面位置分布有多个配体固定化区域。盘状基质可优选地采用任何刚性、柔性或半柔性材料。盘状基质至少有一个面基本上为平面。理想的是在物理上分离的表面位置分布有多个配体固定化区域。
索状、带状或盘状基质表面上配体固定化位置的排列方式没有特别的限制。其排列方式可根据用途的不同而有所改变。
例如，索状基质上的配体可以按1-100个配体/cm、1-100个配体/cm2或1-100个配体/cm3的密度呈点状排列。带状基质上的配体可以沿短边和长边均按1-100个配体/cm的密度呈点状排列。盘状基质上的配体可以按1-10000个配体/cm2的密度呈点状排列。
可以用一种商品化的定位仪方便地将配体定位在基质上。某些类型的配体可以在基质上合成。
优选的是，本发明的基质采用一种可用于高速检测配体与能够结合该配体的受体之间的结合的基质。当利用该基质可以高速检测出配体与能够结合该配体的受体之间的结合时，即使所用基质上的配体固定化区域的位置彼此有一定距离，也可以在短时间内检测出配体与能够结合该配体的受体之间的大量结合。配体固定化区域的位置彼此有一定距离的基质可以用简便的制备方法获得。即使采用这种基质，也可通过由该基质高速获得信息的方法产生与具有高密度配体固定化区域的基质相类似的结果。
此外，配体固定化区域的位置彼此有一定距离的基质可以减少制备后的配体间污染的几率。
以下为该基质的范例，这些范例均可根据本发明优选地使用配体固定化区域的位置间隔至少为1mm的一种索状、带状或盘状基质；配体固定化区域的位置密度小于100个区域/cm2的一种索状、带状或盘状基质；配体固定化区域的位置密度小于10个区域/cm2的一种索状、带状或盘状基质；所含配体固定化区域的数量为100或100以上的一种索状、带状或盘状基质；以及所含配体固定化区域的数量为1000或1000以上的一种索状、带状或盘状基质。
根据本发明，如果配体固定化区域在特定范围内呈单线形排列，则只需一维扫描即可检测出配体与目的受体之间的结合。另一方面，当采用含有高密度配体固定化区域的常规基质时，需要通过二维扫描来检测配体与目的受体之间的结合。因此，本发明提供一种检测配体与目的受体结合的简便方法，该方法与传统方法相比具有划时代的意义。
上文所述的线形并不局限于直线形或曲线形。
本发明的索状或带状基质可优选地采用一种由基本不溶的材料制成的基质。这种材料的实例包括能够与配体共价或非共价连接的杂聚物、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯、聚氯乙烯、尼龙和本申请书公开后将被该领域所了解的其他聚合物，另外还包括纸、尼龙、纤维素，以及纤维素衍生物如硝化纤维素。
本发明的盘状基质可优选地采用一种由基本不溶的材料制成的基质。这种材料的实例包括能够与配体共价或非共价连接的杂聚物、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯、聚氯乙烯、尼龙和本申请书公开后将被该领域所了解的其他聚合物、纸、尼龙、纤维素、纤维素衍生物如硝化纤维素，塑料，如聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯，以及塑料衍生物、磁性或非磁性金属、石英和玻璃。
本发明的索状、带状或盘状基质可以由一种带有平滑表面的聚合或非聚合多孔材料制成。但是，本发明的基质并不局限于由这种材料制成的基质。例如，本发明的基质可以是能够作为DNA芯片或生物传感器的基质和能够使DNA在其表面得以固定的基质。举例来说，优选的是使用一种表面带有亲水性或疏水性官能团的基质。官能团的实例包括羟基、胺基、巯基、醛基、羧基和酰基。本发明的基质还包括表面带有这种性质的官能团作为基质材料的性质的基质。甚至当一种基质的表面不具有亲水性或疏水性官能团时，只要能通过表面处理使该基质的表面获得这种官能团，则其使用同样不受限制。
经过这种表面处理的基质的实例包括，表面经过氨基烷基硅烷等商品化硅烷偶联剂处理的基质、表面经过聚赖氨酸或聚氮丙啶等多聚阳离子处理的基质，或表面经过氨基烷基硅烷和戊二醛处理的基质。
带负电荷、不带电荷或带正电荷的基质均可优选地作为本发明的索状、带状或盘状基质，条件是其表面能够有效地固定配体。此外，本发明的基质可含有两部分结构，一部分用于配体固定化，一部分用来支持配体固定化部分。可以根据索状、带状或盘状基质的配体固定化效率和强度来进行选择。
可以先制备出配体固定化部分，再将其与支持部分粘接，然后即可使用。配体固定化部分的形状不受限制。索状、带状或盘状基质的制备可采用已事先完成配体固定化的小珠，或表面能够合成配体的小珠，等等。
只要本底被充分抑制，使信号检测可以用检测器来完成，则任何材料都可以不受限制地优选用于本发明的索状、带状或盘状基质。根据本发明，可优选地使用一种透明的、半透明的或不透明的基质。根据基质材料的不同，可以选择使用透射光型检测器、反射光型检测器，等等。
在用检测器检测时，可以使基质进行一维移动。作为选择，也可以使检测器在基质上进行一维移动。
测定配体与其受体间结合的方法可以是，将带有多个配体的索状、带状或盘状基质暴露于至少一种要检测与该配体结合能力的受体(如带标记的配体)，然后检测基质上的标记位置。可以将整个基质暴露于受体，也可以将基质的不同部分依次暴露于受体。例如，依次测定配体与受体间结合的方法如下当使用索状基质时，可以从基质的顶端开始，依次暴露于受体；当使用带状基质时，可以从短边开始，依次暴露于带标记的受体，然后检测基质上的标记位置；当使用盘状基质时，可以从基质的任意位置开始，依次暴露于带标记的受体，然后检测基质上的标记位置。还可以选择性地在上述方法中适当加入将索状、带状或盘状基质清洗和(或)干燥的步骤。
在测定配体与受体间的结合时，可以适当地选择索状、带状或盘状基质穿过基质检测器的速度。例如，该速度可以是恒定的。作为选择，也可以在需要精确检测的区域改变该速度。如果基质以恒定速度穿过，则获得10μm分辨率的优选速度为，例如，15秒/cm2或更低，更优选为10秒/cm2或更低。获得80μm分辨率的优选速度为1秒/cm2或更低，更优选的为0.5秒/cm2或更低。进行检测的方法可以是反复将整个索状、带状或盘状基质或其需要精确检测的部分穿过检测器，期间需要翻转基质的移动方向，以使信号数据统一。
通过使用一种已预先经过受体与配体结合步骤的基质，可以高速实现配体与受体结合的检测步骤。此时，即使采用一种含有低密度配体固定化区域的基质，也可以因高速度而获得与含有高密度配体固定化区域的基质相类似的结果。此外，由于在低密度基质上固定配体可以精确而又方便地实现，并且其成本低廉，所以本发明的该基质具有与包含高密度配体固定化区域的基质相同的或更强的工业实用性。
在一项优选实施方案中，所用基质上带有连接分子。配体与该连接分子上暴露的官能团反应。在一项优选实施方案中，配体的末端具有氨基或羧基基团，而连接分子具有能与配体的该末端反应的氨基或羧基基团。
所得基质具有多种用途，其中包括，例如，对大量受体进行生物活性筛选。为了进行生物活性筛选，可以将基质暴露于一种或多种受体。使用的受体可选自，例如，抗体、完整细胞、囊泡上的受体、脂类或其他不同的受体。优选的是该受体带有，例如，一种荧光标记、一种放射性标记，或能够与该受体反应的一种标记抗体。基质上的标记位置可通过，例如，光子检测法或放射自显影法来检测。例如，可以用单荧光标记来进行检测，但本发明并不局限于此。在这种情况下，可以对不同测试样品的受体存在情况进行比较和分析，方法是用本发明的多个索状、带状或盘状基质分别与带有单荧光标记的多个测试样品反应，然后同时或分别高速检测多个索状、带状或盘状基质上的荧光信号。也可以用两种或多种荧光标记来进行分析。
此外，还可以用磁性材料来标记受体，并通过磁性材料的磁场来检测受体与固定在基质上的配体之间的结合。
因此，本发明提供一种方法，用于检测配体和受体之间的结合，其中，受体被一种磁性材料标记，从而可通过磁性材料的磁场来检测受体与固定在基质的预定区域的配体之间的结合。
例如，在该方法中，可以用一种消磁的磁性微粒来标记受体，该微粒结合有或涂有一种连接分子，该分子具有一种能够与该受体结合的官能团。
将标记有消磁的磁性微粒的受体暴露于配体，然后清洗并去除未与配体结合的受体。
将配体结合的受体上连接的磁性微粒重新磁化，方法是将其暴露于适当的磁场。
这样就可以通过重新磁化的磁性微粒的磁场来检测配体与受体之间的结合。
本发明的磁性微粒可以采用硬磁材料。使磁石(Fe3O4)或磁赤铁矿(γFe2O3)微粒逐渐形成针状物，这样制成的磁粉即可作为一种硬磁材料，但本发明并不局限于此。利用磁饱和点较高的硬磁材料或未经热消磁的硬磁材料可以实现高精度的检测。作为选择，也可以使用经疏水键连接有磁性材料的受体。可以使用未消磁的磁性材料。也可以使用来源于微生物的磁性材料。
利用检测到结合的位置上的配体信息，可以快速确定与受体结合的这种配体。因此，可以用这种技术对大量受体进行筛选。本发明的其他可能用途还包括诊断。此时，在基质上分布有不同的特定受体的配体，因而可根据测试样品中的受体存在情况来诊断与受体异常相关的疾病。
利用本发明第二方面描述的用于检测配体与受体间结合的仪器可以自动实现对配体与受体间结合的检测。该仪器可以检测在表面预定区域固定有多个不同配体的索状、带状或盘状基质上的配体与测试样品中的受体之间的结合，该仪器包括a)将基质暴露于至少能结合一种配体的受体的一种设备；以及b)检测受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域的一种设备。
例如，该仪器可由一种移动索状、带状或盘状基质的设备、一种前预杂交池、一种预杂交池、一种标记受体池、一种清洗池、一种干燥设备、一种检测配体与受体间结合的设备、一台分析配体与受体间结合的数据的计算机组成。可以用单池或多池来充当各种池。
图1显示本发明的一种典型检测仪器的结构。利用由滚轮(21)驱动的带状基质移动设备(20)将固定有配体的带状基质(10)移到前预杂交池(30)进行预处理。将预处理过的基质移到预杂交池(40)，然后再移到标记受体池(50)。在标记受体池中，配体与受体发生结合。在清洗池I(60)中清洗基质，然后在清洗池II(70)中清洗基质。然后用移动设备将基质转移，用于干燥(80)，并用干燥设备(90)使其干燥。然后用移动设备将基质转移，用于检测配体与受体间的结合(100)。利用检测配体与受体间结合的设备(110)检测配体与受体之间的结合。利用分析配体与受体间结合的数据的计算机(120)分析检测到的结合信息。
盒表示一种用单池充当各种池的仪器。该盒含有一种可作为池的容器，该容器带有一个进口和一个出口，容器中含有索状或带状基质与一种缠绕设备的组合，或盘状基质与一种旋转设备的组合。此时，举例来说，从预处理步骤到清洗步骤的操作可以在这种盒中进行，期间需要更换流体。然后将干燥/检测设备装在盒上，以使基质干燥并检测配体与受体之间的结合，期间需要用缠绕设备或旋转设备移动基质。
此外，利用本发明第三方面描述的用于检测配体与受体间结合的仪器也可以自动实现对配体与受体间结合的检测。该仪器可以检测表面预定区域固定有多个不同配体的索状、带状或盘状基质上的配体与测试样品中的受体之间的结合，该仪器包括检测受体与基质上的配体之间发生结合的区域的一种设备。
如果采用这种仪器，则可以方便地使用已预先经过受体与基质上配体结合的步骤的一种基质。
在受体与基质上的配体结合之后，可以制备出含有固定这些配体的区域的索状、带状或盘状基质。然后用该仪器检测这些区域。
该仪器的测量所需时间可以通过改变索状、带状或盘状基质在仪器中的移动速度来加以调节。这样就能够以更高的速度检测配体与受体之间的结合。
本申请书公开一种改良的检测仪器和一种改进的检测方法。该检测仪器和检测方法使用一种在表面的已知位置固定有多个配体的索状、带状或盘状基质。例如，可以将这种索状、带状或盘状基质依次暴露于一种受体(如带有荧光标记的受体)。该受体可以与一个配体或一些配体相结合。如果在索状、带状或盘状基质上重复固定有若干组配体，则可以将每一组配体作为一个单位暴露于一种受体。也就是说，如果该仪器含有多个标记受体池，则可以将每一组配体作为一个单位暴露于一种标记受体。然后将索状、带状或盘状基质依次放置在一种检测器中(如显微检测器)，以确定结合的位置。显微检测器可包含一种用于把光导向基质的光源、一种检测设备，例如检测基质发出的荧光的设备，和一种确定荧光位置的设备。也可使用一种将配体与受体间的结合作为随时间而改变的电流来加以检测的检测器。可以对索状、带状或盘状基质进行多次测量并将信号整合，以提高检测信号的信号本底比(信噪比)。
索状、带状或盘状基质的荧光检测设备的实例包括光子计数器。可以将配体与受体结合位置的检测设备固定，并使索状、带状或盘状基质穿过该检测设备。作为选择，也可以使其进行X-Y移动。由穿过检测器的索状、带状或盘状基质获取的数据可以用一种适当编程的数字式计算机进行记录，然后进行分析。
表1
*CAP商品化引物。
选自表1的基因或其DNA片段的制备方法如下。由GenBank获得要固定的基因的核苷酸序列信息或产物的源基因，这些基因的序列在递交时都具有特定的登记号。根据这些信息构建出用于PCR扩增的引物对。构建时采用了OLIGOTM引物分析软件(Takara Shuzo)，设定软件的参数，以产生约100b-1kb的DNA片段，这种片段最适合于本发明的方法。然后根据已确定的核苷酸序列用DNA合成仪合成引物。组织蛋白酶G、NGF受体和CSF1受体的基因分别采用HumanUniGene DNA组(Research Genetics)中包含的引物。
以基因组DNA、基因组DNA文库或cDNA文库为模板，根据商品化PCR试剂盒中附带的标准方案由引物对获得所需的PCR扩增片段。并用SUPREC-02(Takara Shuzo)将获得的DNA片段纯化。对扩增出的cDNAs的核苷酸序列进行分析，以确定是否为所需片段。用乙醇沉淀法回收各种扩增片段，并以1μM的浓度溶解在100mM碳酸缓冲液(pH9.5)中。此外，还利用类似方式制备出一种管家基因，β-肌动蛋白基因，并将其作为阳性对照。阴性对照则采用pBR322质粒DNA。
将每种纯化DNA片段的一部分溶解在50mM碳酸缓冲液(pH9.5)中，然后分别制备成5种连续稀释液，并在260nm下测量吸光度，以确定其浓度。每种稀释液含有浓度为0.1-0.5mg/ml的DNA片段。制备出用于如下文所述进行碱变性的样品，使处理后的样品具有如上所述的浓度。
分别将样品按原样室温放置10分钟，或分别添加到含有0.5M氯化钠的0.25N氢氧化钠中(Nacalai Tesque)之后再室温放置10分钟，然后冰浴冷却。用GMS417阵列仪(Genetic MicroSystems，GMS)将DNA溶液点在索状、带状或盘状基质上。索状基质的制备方法是，将Hybond-N(Amersham)和Gene Screen Plus(NEN)这两种尼龙膜中的一种切成宽1mm、长1m的细条，再将细条捻成索。将样品以1mm或更长的间距点在索上，产生直径为0.1mm的点。35种DNA片段有5种连续稀释液，按碱变性(35×5＝175个点)或未碱变性(35×5＝175个点)两组分别进行重复点样。带状基质采用Hybond-N(Amersham)和Gene Screen Plus(NEN)这两种尼龙膜。带状基质的制备方法是将膜切成宽1cm、长1m的带。将样品点在带上，以形成点(直径0.1mm)的阵列。该阵列含有5列700行(4组，每组175行)。详细地说，也就是35种DNA片段有5种连续稀释液，以碱变性(35×5＝175个点)或未碱变性(35×5＝175个点)两组为一套进行重复点样。另一方面，盘状基质的点样方法是，35种DNA片段有5种连续稀释液，按碱变性(35×5＝175个点)或未碱变性(35×5＝175个点)两组在直径87mm的盘状Hybond-N(Amersham)尼龙膜上进行重复点样。
将点有DNA片段的上述索状、带状或盘状基质在室温下各静置30分钟，用含有0.5M氯化钠的0.5M tris-盐酸(pH7.5)清洗，然后用2×SSC(Wako Pure Chemical Industries)冲洗。用一种透照仪对基质进行大约2分钟的UV照射，以固定DNAs。这样就在索状、带状或盘状基质上制成了DNA阵列。
(2)检测不同的内分泌干扰剂对培养细胞的影响。
在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培养基上培养人乳癌MCF-7细胞。用胰蛋白酶进行消化，然后把2×106个细胞置于10cm平皿上。将细胞置于含有已利用活性碳-葡聚糖处理方法去除了甾体类激素的5％胎牛血清的DME培养基中培养24小时。去除培养基，然后将细胞置于含有10nM已烯雌酚(DES)的相同培养基中培养2小时。在不含该化学物质的条件下以类似方式培养细胞，作为对照。将处理后的细胞回收，并分别用TRIzol试剂(Gibco-BRL)制备总RNAs。
(3)用DNA酶处理上文(2)中制备的总RNA。制备含有约100-300μg总RNA、10μl 10×AMV缓冲液(Life Science)和10U DNA酶I(Takara Shuzo)的12μl反应混合物，37℃温育10分钟，然后进行两次酚-氯仿提取，再进行乙醇沉淀。用所得总RNA的一部分进行浓度测定。
(4)用上文(3)中制备的总RNA进行逆转录反应。反应混合物的成分如下反应混合物A约130μg总RNA、10μg寡聚(dT)引物(TakaraShuzo)和20μl用焦碳酸二乙酯(DEPC，Wako Pure ChemicalIndustries)处理过的水；以及反应混合物B12μl 5×AMV RTase缓冲液(Life Science)、0.5mMdATP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP、0.2mM dTTP、60U RNA酶抑制剂(Takara Shuzo)、0.1mM Cy3标记的dUTP(AmershamPharmacia)。
将反应混合物A 70℃温育10分钟，然后冰浴冷却。将反应混合物B加至其中，并将所得混合物42℃温育5分钟。再将约60U AMVRTase(Life Science)加至其中，所得总反应体积为60μl。将RT反应混合物42℃温育70分钟。然后在反应混合物中添加7.5μl的500mMEDTA溶液和15μl的1M氢氧化钠。将所得混合物60℃温育1小时，以降解模板RNA。冷却至室温后，将37.5μl的1M tris-盐酸(pH7.5)加至其中。用MicroconTM-30(Millipore)将所得溶液浓缩至20μl。将200μl含有1mM EDTA的10mM tris-盐酸加至其中，然后再将混合物浓缩至20μl。下文的杂交即采用这种Cy3标记的DNA溶液。
(5)用2×SSC将上文(1)中制备的索状、带状或盘状基质渗透1分钟，然后在含有4×SSC、0.2％ SDS和100μg/ml鲑鱼精子DNA的溶液中40℃预杂交1小时。然后将索状、带状或盘状基质上的DNA阵列置于一种杂交溶液中，40℃温育过夜。该杂交溶液的制备方法是，将上文(4)中制备的Cy3标记靶DNA进行热变性，并将其悬浮在含有4×SSC、0.2％ SDS和100μg/ml鲑鱼精子DNA的溶液中，使热变性的靶DNA的浓度约为10μg/ml。杂交结束后，在室温条件下用含有2×SSC和0.1％ SDS的溶液将基质清洗5分钟，共清洗两次，然后在68℃条件下用含有0.1×SSC和0.1％SDS的溶液将基质清洗15分钟，也清洗两次。对基质上的各个点发出的荧光信号进行检测，方法如下。将基质放在一种荧光检测器中。可以用该检测器从短边(当使用索状或带状基质时)或任意的测量起始点(当使用盘状基质时)依次进行测量。然后对标记受体与配体之间的结合进行分析。用数字来表示基质上的阵列的分析结果，方法是将内分泌干扰剂处理样品的荧光信号值除以对照样品的荧光信号值。如果计算结果大于1.00，说明用内分泌干扰剂处理可加强该基因的表达。反之，如果计算结果小于1.00，说明这种处理可抑制其表达。如果计算结果等于1.00，则用该物质处理不会影响这种基因。
利用上述分析方法，N-COR/SMRT与ARA70(核受体与核受体转录偶联因子)、p38r、JNK2和BMK2(激酶类信号转导因子)以及PDGF受体(受体类激酶)的分析结果小于1.00。这就证明，利用具有内分泌干扰活性的DES进行刺激抑制了这些基因的表达。而且还证明在点样前变性为单链产生更高的信号强度。此外，根据本发明使用Hybond-N和Gene Screen Plus这两种尼龙膜也获得了类似的结果。如上所述，利用本发明的索状、带状或盘状基质可以观测到与内分泌干扰剂可能影响的基因的表达相对应的信号的明显变化。因此可以检测和确定受内分泌干扰剂影响的基因。
(2)将实施例1(1)中制备的带状基质放入该仪器，并从一条短边开始穿过室温条件下的前预杂交池。再将其置于40℃的预杂交池中，温育1小时。然后将该基质放在装有Cy3-标记靶DNA(受体)的40℃的标记受体池中，温育过夜。清洗该基质，方法是使其穿过室温条件下的清洗池I，然后穿过68℃条件下的清洗池II。然后将这种带状基质放在一种荧光检测器中，以测量各个点发出的荧光信号。然后对标记受体与配体之间的结合进行分析。结果是获得了与实施例1中类似的结果。
(3)在一种仪器中对实施例1(1)中制备的盘状基质进行如上文(2)所述的操作。该仪器与上文(1)中描述的仪器类似，只是该仪器包括一种移动盘状基质的设备，而不是移动索状或带状基质的设备。对这种盘状基质上的各个点发出的荧光信号进行测量。然后对标记受体与配体之间的结合进行分析。结果是获得了与实施例1中类似的结果。
工业实用性本发明提供一种基质和一种测量仪器，用于依次高速测定配体与受体之间的结合。本发明提供一种固定有核酸、糖类、蛋白或肽的索状、带状或盘状基质，该基质可应用于生化、诊断等不同的领域。此外，利用这种索状、带状或盘状基质可以在不提高其单位面积的配体密度的条件下高速测定配体与受体之间的结合。因此，本发明能够高速检测配体与受体之间的结合。这种高速检测可以产生与提高基质上的密度相类似的结果。这样就可以用一种含有低密度配体固定化区域的基质获得与高密度基质相类似甚至更多的结果。这种基质的制备可以精确而又方便地实现，并且其成本低廉。此外，由于配体的位置可以根据本发明呈单线形排列，所以只需用检测器检测配体与受体之间是否存在结合，而无需用检测器对标记物进行二次扫描测定。在这一点上，本发明也显得异常方便。
无序列表的文字序列编号1设计的寡核苷酸引物，用于扩增Smad3基因的一部分。序列编号2设计的寡核苷酸引物，用于扩增Smad3基因的一部分。序列编号3设计的寡核苷酸引物，用于扩增VEGF受体基因的一部分。序列编号4设计的寡核苷酸引物，用于扩增VEGF受体基因的一部分。序列编号5设计的寡核苷酸引物，用于扩增ACTR基因的一部分。序列编号6设计的寡核苷酸引物，用于扩增ACTR基因的一部分。序列编号7设计的寡核苷酸引物，用于扩增N-CoR/SMRT基因的一部分。序列编号8设计的寡核苷酸引物，用于扩增N-CoR/SMRT基因的一部分。序列编号9设计的寡核苷酸引物，用于扩增efp基因的一部分。序列编号10设计的寡核苷酸引物，用于扩增efp基因的一部分。序列编号11设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-1基因的一部分。序列编号12设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-1基因的一部分。序列编号13设计的寡核苷酸引物，用于扩增维生素D受体基因的一部分。序列编号14设计的寡核苷酸引物，用于扩增维生素D受体基因的一部分。序列编号15设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-2基因的一部分。序列编号16设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-2基因的一部分。序列编号17设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax基因的一部分。序列编号18设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax基因的一部分。序列编号19设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK1基因的一部分。序列编号20设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK1基因的一部分。序列编号21设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38基因的一部分。序列编号22设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38基因的一部分。序列编号23设计的寡核苷酸引物，用于扩增TRIP1基因的一部分。序列编号24设计的寡核苷酸引物，用于扩增TRIP1基因的一部分。序列编号25设计的寡核苷酸引物，用于扩增ARA70基因的一部分。序列编号26设计的寡核苷酸引物，用于扩增ARA70基因的一部分。序列编号27设计的寡核苷酸引物，用于扩增胰岛素受体基因的一部分。序列编号28设计的寡核苷酸引物，用于扩增胰岛素受体基因的一部分。序列编号29设计的寡核苷酸引物，用于扩增PDGF受体基因的一部分。序列编号30设计的寡核苷酸引物，用于扩增PDGF受体基因的一部分。序列编号31设计的寡核苷酸引物，用于扩增CSF1受体-2基因的一部分。序列编号32设计的寡核苷酸引物，用于扩增CSF1受体-2基因的一部分。序列编号33设计的寡核苷酸引物，用于扩增FGF受体基因的一部分。序列编号34设计的寡核苷酸引物，用于扩增FGF受体基因的一部分。序列编号35设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38gamma基因的一部分。序列编号36设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38gamma基因的一部分。序列编号37设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bcl-X基因的一部分。序列编号38设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bcl-X基因的一部分。序列编号39设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-3基因的一部分。序列编号40设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-3基因的一部分。序列编号41设计的寡核苷酸引物，用于扩增pS2蛋白基因的一部分。序列编号42设计的寡核苷酸引物，用于扩增pS2蛋白基因的一部分。序列编号43设计的寡核苷酸引物，用于扩增乳铁蛋白基因的一部分。序列编号44设计的寡核苷酸引物，用于扩增乳铁蛋白基因的一部分。序列编号45设计的寡核苷酸引物，用于扩增RIP140基因的一部分。序列编号46设计的寡核苷酸引物，用于扩增RIP140基因的一部分。序列编号47设计的寡核苷酸引物，用于扩增TIF2基因的一部分。序列编号48设计的寡核苷酸引物，用于扩增TIF2基因的一部分。序列编号49设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK2基因的一部分。序列编号50设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK2基因的一部分。序列编号51设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax delta基因的一部分。序列编号52设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax delta基因的一部分。序列编号53设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-1基因的一部分。序列编号54设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-1基因的一部分。序列编号55设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-2基因的一部分。序列编号56设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-2基因的一部分。序列编号57设计的寡核苷酸引物，用于扩增Src-1基因的一部分。序列编号58设计的寡核苷酸引物，用于扩增Src-1基因的一部分。序列编号59设计的寡核苷酸引物，用于扩增p300/CBP基因的一部分。序列编号60设计的寡核苷酸引物，用于扩增p300/CBP基因的一部分。序列编号61设计的寡核苷酸引物，用于扩增β-肌动蛋白基因的一部分。序列编号62设计的寡核苷酸引物，用于扩增β-肌动蛋白基因的一部分。
序 列 表序列表<110>宝酒造株式会社<120>用于固定配体的基质<130>662221<150>JP 11-315610<151>1999-11-05<160>62<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Smad3基因的一部分。<400>1caggtgtccc atcggaagg<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Smad3基因的一部分。<400>2ctctctggta gtggtaggga tt 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增VEGF受体基因的一部分。<400>3tacaagatcg acgttagctc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增VEGF受体基因的一部分。<400>4cagccaaatt cacagttaaa 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增ACTR基因的一部分。<400>5gctttgaaga tataatccga aggt24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增ACTR基因的一部分。<400>6ggcctggtga tgacagagta gataa 25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增N-CoR/SMRT基因的一部分。<400>7tatggaggac cctatgaaag tgta24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增N-CoR/SMRT基因的一部分。<400>8ttacgaccat gttctactag acctt 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增efp基因的一部分。<400>9cgccgtgaag acgtgcttgg 20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增efp基因的一部分。<400>10tcttggtcag gctctgttca atctc 25<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-1基因的一部分。<400>11cgccaagctc gtctca 16<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-1基因的一部分。<400>12tcaactgttc tcgtcgtttc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增维生素D受体基因的一部分。<400>13caaacgctgt gtggacatcg g 21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增维生素D受体基因的一部分。<400>14ttctggatca tcttggcata gag 23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-2基因的一部分。<400>15gtagtaattc cagcgagagg 20<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-2基因的一部分。<400>16ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax基因的一部分。<400>17tgttttctga cggcaacttc 20<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax基因的一部分。<400>18gagcactccc gccacaa17<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK1基因的一部分。<400>19gagcagaagc aagcgtgac 19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK1基因的一部分。<400>20gacattgatg tacgggtgtt 20<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38基因的一部分。<400>21gtgcccgagc gttacca17<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38基因的一部分。<400>22aaagttcatc ttcggcatct 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增TRIP1基因的一部分。<400>23aaatgctaaa gttcgcctat 20<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增TRIP1基因的一部分。<400>24acatggactc gccgttct 18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增ARA70基因的一部分。<400>25agttgcataa gccgtcac 18<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增ARA70基因的一部分。<400>26actagccaat ctgataggtc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增胰岛素受体基因的一部分。<400>27gctgccacca atacgtcatt 20<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增胰岛素受体基因的一部分。<400>28gcatcctgcc catcgaact 19<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增PDGF受体基因的一部分。<400>29tcaccattcc atgccgagta acaga 25<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增PDGF受体基因的一部分。<400>30aggacagtgg gcggtgggta gg 22<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增CSF1受体-2基因的一部分。<400>31ccaccctgaa tgaagtcaac 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增CSF1受体-2基因的一部分。<400>32ggtggatgga ttaagactga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增FGF受体基因的一部分。<400>33cagactccgg cctctatgct 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增FGF受体基因的一部分。<400>34gggcttccag aacggtcaac 20<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38 gamma基因的一部分。<400>35tgatcgggct gctggacgta ttc 23<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p38gamma基因的一部分。<400>36agagggcttg cattggtcag gatag 25<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bcl-X基因的一部分。<400>37ccgggagctg gtggttgact tt 22<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bcl-X基因的一部分。<400>38ttcttaccca gccgccgttc t 21<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-3基因的一部分。<400>39gtagtaattc cagcgagagg 20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增c-Myc-3基因的一部分。<400>40ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增pS2蛋白基因的一部分。<400>41ggcccagaca gagacgtgta 20<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增pS2蛋白基因的一部分。<400>42gctcgatggt attaggatag aa 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增乳铁蛋白基因的一部分。<400>43ggagctgcgc aagtgtaac 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增乳铁蛋白基因的一部分。<400>44attagtaatg cctgcgacat 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增RIP140基因的一部分。<400>45gcctctttgc ttcagtcatt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增RIP140基因的一部分。<400>46ttggcttagg tatagtctgg 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增TIF2基因的一部分。<400>47tccaaggcaa gatcacgtct 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增TIF2基因的一部分。<400>48aagccaacga tgaccctaat 20<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK2基因的一部分。<400>49tatagtgtcc aagtggcaga ctcaa 25<210>50<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增JNK2基因的一部分。<400>50atgtatgggt gacgcagagc ttc 23<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax delta基因的一部分。<400>51gatgattgcc gccgtggaca caga24<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Bax delta基因的一部分。<400>52ggtgagcact cccgccacaa agatg 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-1基因的一部分。<400>53ttaaagcccg ctccttcgat gtgac 25<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-1基因的一部分。<400>54ggcggtcggc acctgggtac act 23<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-2基因的一部分。<400>55ggtggccatc aagaagatcc ctaat 25<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增BMK-2基因的一部分。<400>56cctcacgcct tgcatggaag tcct24<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Src-1基因的一部分。<400>57gtatgaatga aggacccaat aactc 25<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增Src-1基因的一部分。<400>58ctggcaggat ctccgatttg a 21<210>59<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p300/CBP基因的一部分。<400>59ttcagtcacc aacgtgccaa atatg 25<210>60<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增p300/CBP基因的一部分。<400>60ttagagctgc gggatcaggt gtt 23<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增β-肌动蛋白基因的一部分。<400>61caagagatgg ccacggctgc t 21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增β-肌动蛋白基因的一部分。<400>62tccttctgca tcctgtcggc a 2权利要求
1.一种索状、带状或盘状基质，其表面的预定区域固定有多个不同的配体。
2.权利要求1的基质，其中的配体为核酸、糖类、肽或蛋白。
3.权利要求2的基质，其中的核酸为双链DNAs或单链DNAs。
4.权利要求3的基质，其中的DNAs为多核苷酸或寡核苷酸。
5.权利要求1-4的任意一项的基质，该基质可用于高速检测配体与能够结合该配体的受体之间的结合。
6.权利要求5的基质，其中，区域间的距离至少为1mm。
7.权利要求5的基质，其中，区域的密度小于100个区域/cm2。
8.权利要求5的基质，其中，区域的密度小于10个区域/cm2。
9.权利要求6-8的任意一项的基质，其中，该基质上的区域数量为100或100以上。
10.权利要求6-8的任意一项的基质，其中，该基质上的区域数量为1000或1000以上。
11.权利要求5-10的任意一项的基质，其中的受体是核酸、糖、肽或蛋白。
12.权利要求11的基质，其中的受体是一种带标记的受体。
13.一种仪器，用于检测配体与受体间的结合，该仪器包括a)一种索状、带状或盘状基质，其表面的预定区域固定有多个不同的配体；b)将基质暴露于至少能结合一种配体的受体的一种设备；以及c)检测受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域的一种设备。
14.权利要求13的仪器，其中的索状、带状或盘状基质为权利要求2-12的任意一项所规定的索状、带状或盘状基质。
15.权利要求14的仪器，其中的受体是一种带标记的受体。
16.权利要求15的仪器，其中，受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域是通过所述标记来进行检测。
17.权利要求15或16的仪器，其中的受体是核酸、糖、肽或蛋白。
18.一种仪器，用于检测配体与受体间的结合，该仪器包括一种设备，用于高速检测受体与表面预定区域固定有配体的索状、带状或盘状基质上多个不同配体中的一种配体之间发生结合的区域。
19.权利要求16的仪器，其中的索状、带状或盘状基质为权利要求2-12的任意一项所规定的索状、带状或盘状基质。
20.权利要求19的仪器，其中的受体是一种带标记的受体。
21.权利要求20的仪器，其中，受体与基质上的配体之间发生结合的区域是通过所述标记来进行检测。
22.权利要求20或21的仪器，其中的受体是核酸、糖、肽或蛋白。
23.一种方法，用于检测配体和受体之间的结合，该方法包括a)将表面预定区域固定有多个不同配体的索状、带状或盘状基质暴露于至少能结合其中一种配体的受体；并且b)检测受体与基质上至少一种配体之间发生结合的区域。
24.权利要求23的方法，其中的索状、带状或盘状基质为权利要求2-12的任意一项所规定的索状、带状或盘状基质。
25.权利要求23或24的方法，其中，受体与基质上的配体之间发生结合的区域是以高速检测。
26.权利要求25的方法，其中的受体是一种带标记的受体。
27.权利要求26的方法，其中，受体与基质上的配体之间发生结合的区域是通过所述标记来进行检测。
28.权利要求26或27的方法，其中的受体是核酸、糖、肽或蛋白。
全文摘要
线状、带状或圆盘状基质，其表面的预定结构域分别固定有多个不同的配体。
文档编号G01N33/543GK1415073SQ00818184
公开日2003年4月30日 申请日期2000年10月24日 优先权日1999年11月5日
发明者加藤郁之进, 伊豆博幸, 浅田起代蔵 申请人:宝酒造株式会社