专利名称：恶性扩散癌发作的早期预测方法
技术领域：
本发明涉及到用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后(prognostic)方法。
背景技术：
通过基因分析鉴定癌症前期组织所有的瘤确信源自业已经受基因改变的细胞，继之以克隆扩展(clonal expansion)。这些基因改变包括原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活。鉴定伴随病理学发展的特异基因变化允许描述许多肿瘤的分子发育模型，包括口腔癌。这些发展模型提供辅助诊断和检测人肿瘤的分子标记。
分子分析已经革新了查看原发人肿瘤中特异基因变化的能力。强大的基于PCR的技术允许使用常规制备的植入石蜡的组织样品，以用于DNA提取和随后的基因分析。可以扩增从这些样品提取的DNA以揭示各种基因改变，包括等位损失。这类等位损失(染色体缺失)是包含于损失区内的关键肿瘤抑制基因失活的标记。
成熟肿瘤中，肿瘤抑制基因需要两步失活过程，这里必需敲除双亲等位基因以便肿瘤发育。通常地，一个等位基因的点突变继之以第二等位基因的缺失和肿瘤抑制功能完全丧失。这些由微卫星分析鉴别的等位损失缺失代表肿瘤抑制基因失活的普通第二失活步骤。实际上，等位损失(或缺失)可通过采用能够区分正常DNA中母源和父源等位基因的高度多态标记测定。然后这种样品(pattern)可以与肿瘤DNA比较，这里重组或缺失表示为母源或父源等位基因的损失(也称为LOH杂合性的损失)。最近，这种作图过程已经随着高度多态并位于整个人基因组中的微卫星标记(小DNA重复单位)的到来而革新。例如，人们可以测试在两条染色体臂上的关键肿瘤抑制基因部位。该区的一个位于染色体臂9p并含有称为p16(MTS-1或CDKN2)的关键肿瘤抑制基因。这种关键的细胞周期抑制剂通过大多数原发癌中的点突变、缺失和甲基化失活。在染色体区3p21可以进行第二分析，其在与吸烟有关肿瘤的最频繁缺失区中。尽管许多基因已经从3p区分离，在原发肿瘤或细胞系中没有候选基因经常地失活。重要地，9p和3p损失都是在恶性扩散癌发展中鉴别的最早的基因变化。
具有头和颈癌的病人常常伴有气消化道的第二原发肿瘤。头和颈癌的基本的基因研究显示口腔中单转化细胞可以遍及粘膜，引起大面积与克隆有关和转化(clonally related and transformed)细胞。这里有进一步的证据，当在一个病人中产生两种损害时，它们通常在起源上是克隆的。例如，具有头和颈癌的病人通常具有大片的可以通过简单的活组织检查直接化验的异常细胞。
参见，例如，Califano等，Genetic Progression Model for Headand Neck Cancer.Cancer Research 56(11)2488-2493(1996)；Sidransky，Nucleic Acid-based Methods for detection of Cancer.Science 278(5340)1045-058(1997)；Rosin等，Use of AllelicLoss to Predict Malignant Risk for Low-grade Oral EpithelialDysplasia，Clinical Cancer Research 6357362(2000)。
于是，已知最终发育成恶性扩散癌的的早期预后可以通过来自可疑部位组织的基因分析实现，提供简单的临床方案是非常希望的，这类方案在其它的可视迹象开始之前很久，鉴别这类可疑部位的位置。
现有领域Mashberg方案鉴别和描述上皮组织上可疑部位的体内诊断筛选试验是已知的。这种筛选试验，采用甲苯胺蓝O(TBO)染料以选择性地染色癌和癌症前期组织，一般描述在Mashberg的美国专利4321251和Tucci等的美国专利5372801中。最近研发了试剂盒，它使得临床医师快速和容易地进行试验成为可能，作为其它常规牙科或医学检查的一部分，从而在病人是无症状时或者当发育异常损害太小以致在普通目视检查中可能遗漏时，鉴别和/或描述可疑部位。一旦通过Mashberg方案鉴别出可疑的发育异常损害，采集合格(regular)的活组织检查样品并且进行常规的组织学检查，以确定损害是恶性的还是癌症前期的。进行该试验的试剂盒，含有适当数量和浓度的预先混合的染料和漂洗溶液，由Zila有限公司许可，并且在加拿大、澳大利亚和欧洲商业上以OraTestM商标销售。以后确定其它的阳离子染料同样有效(参见，例如Pomerantz的美国专利5882672)，这类染料的选择性标记作用归因于它们通过癌性和癌症前期细胞线粒体的摄取和保留。
实施例1临床试验方案本实施例举例说明Mashberg方案的常规实践。
临床试验溶液的制备TBO(例如，按照本发明人美国专利6086852的实施例1制备)，覆盆子增香剂(IFF覆盆子IC563457)，三水醋酸钠缓冲剂和H2O2(30％USP)防腐剂(参见美国专利5372801)，溶于纯水(USP)，冰醋酸和SD18乙醇，产生TBO试验溶液，组成如表A所示
表A组分重量％TBO 1.00香料 .20缓冲剂 2.45防腐剂 .41醋酸4.61乙醇7.48水83.85100.00制备在纯水、苯甲酸钠防腐剂和覆盆子香料中1wt％醋酸的预漂洗和后漂洗试验溶液。
临床方案给病人披上围布以保护衣物。估计会有咳出物，故给病人提供一个10-oz.的杯子，其可倾倒于感染性废物容器或者其内容物可直接倒进洗涤盆下水道中央，以免污染洗涤盆。将环境表面或可能被污染的物品罩起或从试验区移走。
进行口腔癌的目视检查，不使用任何会使软组织产生划痕或切口的器械。在软组织和牙齿的预染色表面作出标记。
让病人用约15ml预漂洗溶液漱口约20秒然后咳出，吐去过多的唾液使口腔环境恒定。然后再用预漂洗溶液重复此步骤。
然后，病人用水漂洗和漱口20秒，咳出。
然后，病人用30ml TBO试验溶液漂洗和漱口1分钟，咳出。
然后，病人用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，咳出。然后重复这一步。
病人接着用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后重复这一步。
接着对口腔进行观察，必要时使用适宜的软组织检测技术，包括退缩(retraction)、平衡光照和放大(well-balanced lightingand magnification)。记录染上蓝色的可疑损害的位置、大小、形态、颜色和表面特征。
为了减少假阳性，请病人在10-14天后返回重复上述方案。在此期间让时间去治愈任何第一次检查时存在的溃疡性或创伤性损害或刺激性病源。第二次检查之后，在第一次检查确定的可疑区域出现的阳性染色被认为是癌或癌症前期组织的指示(indication)，应进行活组织检查来确认这一结论。
早期无核红细胞(erythroplastic)损害染上蓝色，经常为点彩(stippled)或片状(patchy)图样。但是，舌背上的不规则乳头缝被染上蓝色是正常的，不表示阳性。保持蓝色但不认为是阳性的其它区域包括每颗牙齿的牙斑、牙龈边缘，从舌背保留的染色移走的染料在软腭上形成的渗出染色，以及容易确诊的溃疡性损害。在任何情形下，当某一损害高度可疑，但用本检测不呈阳性染色时，进行活组织检查仍是必要的。
“假阳性”直至现在才明白Mashberg方案可提供“假阳性”指示，即，在后来的常规组织学检查中并不确认癌或癌症前期的症状的指示，花费了相当大的努力以减少这些假阳性的发生频率，例如，通过重复Mashberg专利描述的步骤以及通过Tucci专利描述的特殊的染料制剂。
发明简述然而，现已确定，在由TBO和其它阳离子体外活体染料染色的可疑的损害中，可鉴别表示最终发育成恶性扩散癌的的克隆基因变化，尽管这类染色组织的常规组织学检查未确认该组织是癌性的或癌症前期的。从而，在Mashberg方案中先前认定为“假阳性”的指示，很大程度上是基因改变的最早期指示，这种改变是恶性扩散癌发育的前身。因此，Mashberg类型染色染料方案是确定什么组织应该进行基因分析的合理可靠的途径。
于是，考虑到其最广泛的方面，本发明人提供一种用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后方法，它结合现有领域基因分析技术和现有领域选择性染色染料技术，由Mashberg方案例示的，的教导。本发明人的方法包括施用由肿瘤前的细胞线粒体选择性保留的染色染料至组织，通过目视检查所述组织染色的组织部位，鉴别克隆片(clonal patch)，在所述克隆片的部位切除组织，并确定从所述切除组织提取的DNA是否显示等位损失或肿瘤抑制基因的突变。
提供下列实施例以向本领域熟练技术人员举例说明本发明人的发明及其目前优选实施方案的实践。这些实施例并不理解成限制本发明的范围，发明范围仅由所附权利要求限定。
实施例1Mashberg类型临床方案临床试验溶液的制备TBO(例如，美国专利6086852实施例1的产品)，覆盆子增香剂(IFF覆盆子IC563457)，三水醋酸钠缓冲剂和H2O2(30％ USP)防腐剂(参见美国专利5372801)，溶于纯水(USP)，冰醋酸和SD18乙醇，产生TBO试验溶液，组成如表A所示表A组分重量％TBO1.00香料.20缓冲剂 2.45防腐剂 .41醋酸 4.61乙醇 7.48水83.85100.00制备在纯水、苯甲酸钠防腐剂和覆盆子香料中1wt％醋酸的预漂洗和后漂洗试验溶液。
临床方案给病人披上围布以保护衣物。估计会有咳出物，故给病人提供一个10-oz.的杯子，其可倾倒于感染性废物容器或者其内容物可直接倒进洗涤盆下水道中央，以免污染洗涤盆。将环境表面或可能被污染的物品罩起或从试验区移走。
进行口腔癌的目视检查，不使用任何会使软组织产生划痕或切口的器械。在软组织和牙齿的预染色表面作出标记。
让病人用约15ml预漂洗溶液漱口约20秒然后咳出，吐去过多的唾液使口腔环境恒定。然后再用预漂洗溶液重复此步骤。
然后，病人用水漂洗和漱口20秒，咳出。
然后，病人用30ml TBO试验溶液漂洗和漱口1分钟，咳出。
然后，病人用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，咳出。然后重复这一步。
病人接着用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后重复这一步。
接着对口腔进行观察，必要时使用适宜的软组织检测技术，包括退缩(retraction)、平衡光照和放大(well-balanced lightingand magnification)。记录染上蓝色的可疑损害的位置、大小、形态、颜色和表面特征。
请病人在10-14天后返回重复上述方案。在此期间让时间去治愈任何第一次检查时存在的溃疡性或创伤性损害或刺激性病源。第二次检查之后，在第一次检查确定的可疑区域出现的阳性染色被认为是癌或癌症前期的指示。
早期无核红细胞损害染上蓝色，经常为点彩或片状图样。但是，舌背上的不规则乳头缝被染上蓝色是正常的，不表示阳性。保持蓝色但不认为是阳性的其它区域包括每颗牙齿的牙斑、牙龈边缘，由于从舌背保留的染色移走的染料而在软腭上形成的渗出染色，以及容易确诊的溃疡性损害。然而，在任何情形下，当某一损害高度可疑，但用本检测不呈阳性染色时，采集活组织并进行分子分析仍是必要的。
实施例2基因改变分析从各种临床部位获得58个样品。这些样品中有两个的分析是不可能的，由于用于进一步分子分析的玻片上只有不充分的材料。在剩余的56例中，采用激光捕获显微解剖镜从正常组织仔细地解剖肿瘤细胞(癌情形下)，或者从正常组织解剖上皮(其它情形下)。这允许细胞分离和DNA提取，以便随后在三种关键部位的微卫星分析。在15例中，DNA不充分，进一步的分析是不可能的。为试验选择的两个部位(D9S171和D9S736)在含p16基因的染色体区9p21。第三标记(D3s1067)位于染色体3p21。在余下41例中不具备病理诊断知识下盲法进行所有的分子研究。
此项研究中，分别鉴别染蓝色的损害和活组织检查邻近但是不在染蓝色区内的损害。因此，在许多情形下人们能够直接试验染色区以及相邻的非染色区。所有41例中的这些关键标记的微卫星分析显示，在事实上一切具有癌(cancer)和原位癌(carcinoma in situ)的病例中存在LOH(染色体缺失)。此外，许多发育异常的损害和非发育异常损害，以及未知(非病理诊断)类别中的那些，也隐匿克隆基因的变化。
在出自12例癌病例的12例中，正如所料鉴别出克隆基因的变化。在所有四例原位癌或严重的发育异常中，也鉴别出克隆改变。在57％的发育异常(7中有4)例和85％非发育异常(14中有12)例中，在这些标记的一项或多项发现克隆基因的变化。在具有未知组织学的情形下，鉴别出25％(4中有1)例克隆基因变化。整个地，通过微卫星分析在80％(41中有33)的损害中鉴别出克隆变化。这种分子分析决定性地表示约80％的Mashberg类型方案鉴别的损害是克隆的。
结论先前的研究暗示仅仅具有克隆基因变化的损害有可能发展成癌。所有这些研究暗示仅仅具有9p和/或3p损失的损害会发展成癌，没有这些变化的损害事实上从不发展。在肿瘤前的损害中，发展的风险明显地升至事实上的100％，如果存在其它更多提前的基因变化(例如，17p损失或p53突变)。
发展成具有3p和/或9p损失的癌的风险在28-75％变化。然而，在最低发展频率(28％)的研究中，预期试验的116名病人在参加这项研究之前未患癌症。其它两项研究包括先前切除原发肿瘤并反映较高比例或发展(45-78％)的123名病人。在更近的研究中，作者做出了清楚的推荐，切除所有具有两个或多个等位基因损失的可疑区。
因此，本实施例确定了这样的事实，在此病人群体中由甲苯胺蓝染料鉴别的肿瘤前变化是克隆的，因此在发展成癌的途径中。尽管并不确认每一个鉴别的损害会发展成恶性扩散癌，很清楚，在这些病人中初期的克隆扩展已经开始了。基于上述研究，保守的估计提示这些损害的50-75％有可能发展成恶性扩散癌。因此，这些克隆片将这些病人置于极高危险种类，并且有理由彻底切除受影响区。
源自此实施例的另一关键点涉及染色和非染色区问题。绝大多数情形下，染色和非染色区共同具有相同的基因变化。基于头和颈癌克隆发展模型的说明，很清楚，大多数复发头和颈癌的病人具有大片的异常上皮。远离染色区的活组织检查亦显示同样的克隆基因变化，这并不是令人惊奇的。重要地，存在至少三个病例，这里仅仅来自染色区的活组织检查揭示克隆基因变化，而非染色区并不显示这些变化。它可能归因于这些病人中较小克隆片的存在，并且进一步建议采用染色染料鉴别异常损害。
清楚地，Mashberg类型方案通过标准形态学分析鉴别具有原位癌的病人。显著地，极大多数其它缺失损害在显微镜下显示正常和发育异常(会从Mashberg方案另外归入“假阳性”)，但是这些损害仍然隐匿了关键的癌发育必需的克隆基因变化。
因此，Mashberg类型方案代表检测极可能发展成癌的癌以及损害的有效方法。在这点上，活组织检查染色鉴别的损害是适当的，它可能(a)导致治愈，因为其中的损害可通过进一步的切除完全切除，或者(b)通过记录克隆基因的发展将病人置于适当的高危类别。
本发明人的发明已经公开到使本领域熟练人员理解和实施它的程度，并且确定了目前优选实施方案。
权利要求
1.一种用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后方法，所述的方法包括(a)向组织施用被瘤和肿瘤前细胞线粒体选择性保留的染色染料；(b)通过目视检查所述组织寻找染色组织部位，鉴别所述组织的克隆片；(c)切除所述克隆片部位的组织；(d)确定从所述切除组织提取的DNA是否显示等位损失或者肿瘤抑制基因的突变。
全文摘要
一种用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后方法，包括通过施用选择性染色可疑的癌性和癌症前期组织部位的染料鉴别这类部位，然后通过分子基因分析确定这类部位的DNA是否显示等位损失或者肿瘤抑制基因的突变。
文档编号G01N1/30GK1399563SQ00816123
公开日2003年2月26日 申请日期2000年9月26日 优先权日2000年9月26日
发明者道格拉斯·D·伯克特 申请人:日拉公司