人g－蛋白偶联受体的利记博彩app

专利名称：人g－蛋白偶联受体的利记博彩app
描述本发明涉及新的已鉴定的多核苷酸、由它们编码的多肽以及此类多核苷酸和多肽的用途，并涉及它们的产生。更明确地，本发明的多核苷酸和多肽涉及G-蛋白偶联受体(GPCR)，此后称之为IGS1。本发明也涉及对此类多核苷酸和多肽之作用的抑制或活化，涉及含有该多核苷酸的载体、含有该载体的宿主细胞以及转基因动物，其中IGS1基因过度表达、错表达、表达不足和/或被抑制(敲除动物)。本发明进一步涉及筛选化合物的方法，其中所述化合物能作为该G-蛋白偶联受体IGS1的激动剂或拮抗剂。
背景技术：
已充分确定许多医学上重要的生物进程由参与信号转导途径的蛋白质介导，其中信号转导途径涉及G-蛋白和/或第二信使；例如cAMP(Lefkowitz，自然(Nature)，1991，351353-354)。此处这些蛋白质指的是参与G-蛋白途径的蛋白质。这些蛋白质的一些实例包括GPC受体(例如肾上腺素能因子和多巴胺的那些受体(Kobilka，B.K.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1987，8446-50；Kobilka，B.K.等人，科学(Science)，1987，238650-656；Bunzow，J.R.等人，自然，1988，336783-787))、G-蛋白自身、效应蛋白质(例如磷脂酶C、腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶)以及调节(actuator)蛋白质(例如蛋白激酶A和蛋白激酶C(Simon，M.I.等人，科学，1991，252802-8))。
例如，在信号转导的一种形式中，激素与GPCR结合后，该受体与异三聚体的G-蛋白相互作用，诱导GDP从鸟嘌呤核苷酸结合位点位离。在正常的鸟嘌呤核苷酸细胞浓度下，GTP立即填充此位点。GTP与G-蛋白的α亚基结合导致G-蛋白从受体解离，并且G-蛋白分解为α和βγ亚基。携带有GTP的形式然后结合至活化的腺苷酸环化酶。GTP水解为GDP，该过程由G-蛋白自身催化(α亚基具有内在的GTPase活性)，使G-蛋白回到其基础的非活化形式。α亚基的GTPase活性实质上是控制打开/关掉开关的内部时钟。α亚基的GDP结合形式对βγ具高亲和性，接下来αGDP与βγ重新结合，使该系统回到基础状态。这样，G-蛋白起到双重作用，即作为中间体将信号从受体传递至效应器(在这个实例中是腺苷酸环化酶)，以及作为控制信号持续时间的时钟。
G-蛋白偶联受体的膜结合超家族已表征为具有七个推定的跨膜结构域。这些结构域被认为是代表跨膜α-螺旋，其由胞外或胞质环连接。G-蛋白偶联受体包括大范围上的生物学活性受体，例如激素、病毒、生长因子和神经受体。
G-蛋白偶联受体家族包括多巴胺受体，其结合用于治疗CNS紊乱的神经安定药物。该家族成员的其它实例包括(但不限于)降钙素、肾上腺素能、神经肽Y、somastotatin、神经紧张素、神经激肽、辣椒素、VIP、CGRP、CRF、CCK、缓激肽、galanin、促胃动素、伤害感受素(nociceptin)、内皮素、cAMP、腺嘌呤核苷、毒蝇碱、乙酰胆碱、5-羟色胺、组胺、凝血酶、激肽、促卵泡激素、视蛋白、内皮分化基因-1、视紫红质、添味剂以及巨细胞病毒受体。
大部分G-蛋白偶联受体的头两个胞外环中各具有单一保守的半胱氨酸残基，其可形成二硫键，该二硫键认为可稳定功能的蛋白质结构。将这7个跨膜区指定为TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。连接TM5和TM6的胞质环可能是G-蛋白结合结构域的一个主要组成部分。
大部分G-蛋白偶联受体包含潜在的磷酸化作用位点，其位于第三个胞质环内和/或羧基末端。对一些G-蛋白偶联受体(如β-肾上腺素受体)而言，蛋白激酶A和/或特异的受体激酶的磷酸化作用可介导受体的脱敏。
近来发现某些GPCR(像降钙素受体样受体)可与小的单次跨膜蛋白质相互作用，后者被称为受体活性修饰蛋白质(RAMP’s)。GPCR与某种RAMP的相互作用决定了哪个天然配体对GPCR-RAMP的组合具有适当的亲和性，并且可调节该复合体的功能信号传递活性(McLathie，L.M.等人，自然(1988)393333-339)。
对一些受体，人们认为G-蛋白偶联受体的配体结合位点包含亲水口袋，其由数种G-蛋白偶联受体的跨膜结构域形成，该口袋被G-蛋白偶联受体的疏水残基包围。每个G-蛋白偶联受体的跨膜螺旋之亲水位点推定面朝里，并形成极性的配体结合位点。一些G-蛋白偶联受体牵涉到TM3，因为其具有配体结合位点，如TM3天冬氨酸残基。TM5的丝氨酸、TM6的天冬酰胺以及TM6或TM7的苯丙氨酸或酪氨酸也参与配体的结合。
G-蛋白偶联受体可通过异三聚体的G-蛋白与多种胞内酶、离子通道和转运蛋白进行胞内偶联(见Johnson等人，内分泌评论(Endoc.Rev.)，1989，10317-331)。不同的G-蛋白α-亚基优势性刺激特定的效应器，以调节细胞内多种生物功能。已确定G-蛋白偶联受体胞质残基的磷酸化作用是调节一些G-蛋白偶联受体与G-蛋白偶联的重要机制。已在哺乳动物宿主的许多地方发现了G-蛋白偶联受体。
受体—主要是GPCR类—已导致了一多半目前公知的药物(Drews，自然生物技术(Nature Biotechnology)，1996，141516)。这表明这些受体作为治疗靶位已有确定的、经证实的历史。本发明描述的新IGS1 GPCR无疑满足了本领域对鉴定和表征进一步的受体之需求，其中所述进一步的受体为可在诊断、防止、改善或纠正机能障碍、紊乱或疾病(此后通称为“疾病”)中发挥作用之受体。疾病包括(但不限于)精神病学的和CNS紊乱，包括精神分裂症、阵发性焦虑(EPA)紊乱例如强迫观念与行为疾病(OCD)、创伤后应激障碍(PTSD)、恐怖症和极度焦虑、大部分的抑郁障碍、双极情感障碍、帕金森氏疾病、一般的焦虑障碍、孤独癣、谵语、多发性硬化症、阿尔茨海默疾病/痴呆以及其它神经变性疾病、严重的智力低下、运动障碍、亨廷顿舞蹈病、图雷特氏综合征、抽搐、震颤、张力障碍、痉挛、厌食症、贪食症、脑卒中、成瘾/依赖/渴望、睡眠障碍、癫痫、偏头痛、注意缺陷障碍(伴多动)(ADHD)；心血管疾病，包括心力衰竭、心绞痛、心律失常、心肌梗塞、心脏肥大、低血压、高血压—例如原发性高血压、肾高血压或肺高血压、血栓形成、动脉硬化、脑血管痉挛、蛛网膜下出血、脑缺血、脑梗塞、外周血管病、雷诺氏病、肾脏疾病—例如肾功能衰竭；dyslipidemias；肥胖症；呕吐；胃肠道紊乱，包括肠道易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、胃食管回流疾病(GERD)、能动性障碍、延迟的胃排空情况，如手术后或糖尿病性胃轻瘫和糖尿病，溃疡—例如胃溃疡；腹泻；其它疾病，包括骨质疏松症；炎症；感染，如细菌、真菌、原生动物以及病毒感染，尤其是HIV-1或HIV-2引起的感染；疼痛；肿瘤；化学治疗诱发的损伤；肿瘤侵袭；免疫紊乱；尿潴留；哮喘；变态反应；关节炎；良性前列腺肥大；内毒素休克；败血症；糖尿病并发症以及妇科疾病。
特别地，本发明描述的新IGS1 GPCR无疑满足了本领域对鉴定和表征进一步的受体之需求，其中所述进一步的受体为可在诊断、防止、改善或纠正精神病学的和CNS机能障碍、紊乱或疾病中发挥作用之受体，特别是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
发明概述本发明一方面涉及IGS1多肽和重组物以及产生它们的方法。本发明另一方面涉及利用该IGS1多肽和多核苷酸的方法。此类用途包括(但不限于)对上述疾病之一的治疗。特别地，该用途包括对精神病学的和CNS障碍的治疗，尤其是运动失调，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
再者，本发明的另一方面涉及使用本发明提供的物质鉴定激动剂和拮抗剂的方法，以及用已鉴定的化合物治疗与IGS1相关的失调情况。还有本发明的另一方面涉及检测疾病的诊断方法，其中疾病与不适当的IGS1活性或水平有关。本发明进一步的方面涉及基于动物的系统，其作为IGS1表达异常或活性不当而引起的紊乱模型。
附图简述

图1.不同克隆相对位置的图式表示，分离的这些不同的克隆用于产生共有序列的IGS1毗连序列群。用于克隆的PCR引物表示为(IP#)。通过对克隆HNT1398和HNT1413的重叠PCR可获得克隆HB4693。IGS1编码序列(IGS1 PROT)的位置用星号表示(“*”)。EST20889和EST登记号AI672141的定位用“＝”表示，IGS1 DNA序列的定位用“++”表示。IGS1 DNA是IGS1毗连序列群的一部分，其中在每一个核苷酸位置上，至少对4个独立的cDNA克隆进行了序列测定。
图2.用人IGS1探针进行的多组织表达阵列分析。膜上有许多假信号。只有箭头所指的信号与所保藏的RNA位置相同并且是特异的。
图3.用来自不同脑区的RNA进行人IGS1的Northern印迹分析。
表1SEQ ID NO1的IGS1-DNA
表2SEQ ID NO2的IGS1-蛋白质
发明详述本发明的IGS1 GPCR与其它的人类GPCR之间在序列和基序上存在结构相似性。此外，IGS1在脑组织中表达，特别是在尾状核和豆状核中表达。因此暗示了IGS1在尤其是上面提及的疾病中起作用。暗示了IGS1尤其在精神病学的和CNS障碍中作用，特别是运动失调，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
除非另外加以定义，此处所用的全部技术和科学术语与本发明所属领域中一般技术人员通常了解的意思相同。虽然类似或等同于此处所描述的任一方法和材料可用于本发明的实践或试验中，现在仍对优选的方法、设备和材料进行了描述。说明书中的所有出版物此处引用作为参考，尽管此处引用的每一个单独的出版物均专门地、单独地指出。定义提供以下定义，以利于对此处常用的某些术语的了解。
“IGS1”特别是指包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其等位基因变体。
“受体活性”或“受体的生物活性”指该IGS1的代谢功能或生理功能，包含类似的活性或提高的活性或具有降低的、不希望的副作用的这些活性。也包括该IGS1的抗原活性和免疫原性活性。
“IGS1-基因”指包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸，或其等位基因变体，和/或它们的互补物。
此处所用的“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、嵌合的、单链和人源化抗体，以及Fab片段，包括Fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物。
“分离的”指“通过人工”从天然状态改变和/或从天然环境分离。这样，如果存在于自然界的“分离的”组合物或物质被“分离”，那么它已被改变或已被从其最初的环境移走，或两者都有。例如，天然存在于活的动物内的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但从其天然状态的共存物质中分离的同一多核苷酸或多肽是“分离的”，正如此处所用的该术语。
“多核苷酸”通常指任一多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可为未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括(但不限于)单链和双链DNA、单链区和双链区混合的DNA、单链和双链RNA，以及单链区和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子，其可为单链或更一般地，可为双链或单链区和双链区的杂合体。另外，“多核苷酸”也可包括三链区，其包含RNA或DNA或同时包含RNA和DNA。术语多核苷酸也包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及因为稳定性或因为其它原因而对主链进行修饰了的DNA或RNA。“修饰”碱基包括例如，三苯甲基化碱基和不寻常碱基(如次黄苷)。对DNA和RNA可进行多种修饰；这样，“多核苷酸”包含多核苷酸经化学修饰、酶修饰或代谢修饰后的形式，它们一般可在自然界中发现，以及病毒和细胞的DNA和RNA特征性的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
“多肽”指任一肽或蛋白质，其包含通过肽键或修饰的肽键而互相连接起来的两个或多个氨基酸(即肽等配物)。“多肽”指短链以及较长的链，其中前者通常称为肽、寡肽或寡聚体，后者通常称为蛋白质和/或其组合物。多肽可包含除了20种基因编码氨基酸之外的其它氨基酸。“多肽”包含经修饰的氨基酸序列，所述修饰或被天然方法修饰(如翻译后加工)，或被本领域公知的化学修饰技术修饰。此类修饰在基础课本和较详细的专著中，以及在大量的研究文献中有充分的描述。修饰可发生在多肽的任一位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应意识到在特定多肽的一些位点，同一类型的修饰可以同样或不同程度出现。同样，特定多肽也可含有许多类型的修饰。多肽可因遍在蛋白化作用而分支，并且它们可为带或不带分支的环状。环状的、分支的以及分支环状的多肽可来自翻译后天然加工或可通过合成法产生。修饰包括乙酰化作用、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接；交联、环化作用、二硫键形成、去甲基化作用、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰基化、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI锚的形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰化作用、氧化作用、蛋白水解加工、磷酸化作用、异戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化作用和遍在蛋白化作用)。见例如，蛋白质-结构和分子特性，第二版(PROTEIN-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.)T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约，1993以及，蛋白质的翻译后共价修饰(POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson，Ed.，学术出版社，纽约，1983一书中的Wold，F.，翻译后的蛋白质修饰展望和前景(Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects)，1-12页；Seifter等人，“蛋白质修饰和非蛋白质辅因子的分析”(“Analysisfor protein modifications and nonprotein cofactors”)，酶学方法(Meth.Enzymol.)(1990)182626-646和Rattan等人，“蛋白质合成翻译后修饰和老化”(“Protein SynthesisPosttranslational Modificationsand aging”)，纽约科学会纪事(Ann.NY Acad.Sci.)(1992)66348-62。
此处所用的术语“变体”是指多核苷酸或多肽，其分别不同于参考的多核苷酸或多肽，但保留了基本的特性，如基本的生物特性、结构特性、调节特性或生化特性。多核苷酸的一般变体之核苷酸序列不同于另一个，参考核苷酸。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变多肽的氨基酸序列，其中所述的多肽由参考多核苷酸编码。核苷酸的变化可导致参考序列所编码的多肽中氨基酸的替换、添加、删除、融合和截短，对此将在下面讨论。多肽的一般变体之氨基酸序列不同于另一个，参考多肽。通常，差异是有限的，以使参考多肽之序列与变体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽氨基酸序列上的差异可以是一个或多个氨基酸以任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变体可以自然产生(如等位基因变体)，或者它可以是非自然产生的变体。多核苷酸和多肽之非自然产生的变体可通过诱变技术或直接合成而产生。
“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列之同一性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域认知的意义并且可用公开的技术计算。见例如(计算分子生物学(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY)，Lesk，A.M.，ed.，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算机学资讯学和基因组计划(BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS)，Smith，D.W.，ed.，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第一部分(COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTI)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULARBIOLOGY)，von Heinje，G.，学术出版社，1987；以及序列分析导引(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER)，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStockton Press，纽约，1991)。虽然存在许多可用于测量两个多核苷酸或多肽间同一性的方法，该术语“同一性”为技术人员周知(Carillo，H.，和Lipton，D.，工业与应用数学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)(1988)481073)。测定两个序列间的同一性或相似性的常用方法包括(但不限于)公开于超大计算机指南(Guide to Huge Computers)，MartinJ.Bishop，ed.，学术出版社，圣地亚哥，1994和Carillo，H.，和Lipton，D.，工业与应用数学会应用数学杂志(1988)481073中的方法。测定同一性或相似性的方法已按规则编在计算机程序中。优选的、用于测定两个序列间的同一性或相似性的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包(Devereux，J.，等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)(1984)12(1)387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等人，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)(1990)215403)。单词“同源性”可替代单词“同一性”。
通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ IDNO1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指在SEQ ID NO1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5或3末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。
类似地，一种多肽，其所具有的氨基酸序列例如与SEQ ID NO2的参考氨基酸序列至少具95％的“同一性”是指在SEQ ID NO2的参考氨基酸序列之每100个氨基酸中，该多肽之氨基酸序列除了含有多达5个氨基酸的变化外，该多肽之氨基酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得氨基酸序列与参考氨基酸序列至少95％相同的多肽，参考序列中多达5％的氨基酸残基可被删除或被另一氨基酸替代；或可将一些氨基酸插入参考序列中，其中插入的氨基酸多达参考序列之总氨基酸残基的5％。参考序列的这些突变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的残基中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。本发明的多肽本发明一方面涉及IGS1多肽(包括IGS1蛋白质)。IGS1多肽包括SEQ ID NO2的多肽和具有由DNA插入片段编码的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，于1999年7月15日保藏在荷兰的真菌菌种保藏中心；还包括包含SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽和包含具有由DNA插入片段编码的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心；以及包含与SEQ ID NO2和/或具有由DNA插入片段编码的氨基酸序列之多肽至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心，并且较优选地至少90％、更优选地至少95％的同一性。进一步地，那些至少97％、特别是至少99％的同一性的多肽是高度优选的。IGS1多肽中也包括具有与包含SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或与具有由DNA插入片段编码的氨基酸序列之多肽至少80％同一性的氨基酸的多肽，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心，并且较优选地至少与SEQ ID NO2 90％同一性、更优选地至少95％。进一步地，那些至少97％、特别是至少99％同一性的多肽是高度优选的。优选地，IGS1多肽显示该受体的至少一种生物活性。
IGS1多肽可为“成熟”蛋白质形式或为较大蛋白质(如融合蛋白质)的一部分。含有额外的氨基酸序列通常是有利的，其中所述之额外的氨基酸序列包括分泌或前导序列、前序列、利于纯化的序列(如多个组氨酸残基)或在重组体产生过程中起稳定作用的额外序列。
IGS1多肽片段也包括在本发明中。片段是具有氨基酸序列的多肽，其具有与上述IGS1多肽之氨基酸序列的一部分(非全部)相同的氨基酸序列。与IGS1多肽一样，片段可以“独立存在”或包含在较大的多肽中，片段在其中形成一部分或一个区域，最优选地是作为单一的连续区域。本发明之多肽片段的代表性实例包括例如，氨基酸数从约1-20、21-40、41-60、61-80、81-100以及101至IGS1多肽末端的片段。文中“约”包括在特指范围的任一末端或两端多出或少了数个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
优选的片段包括例如，具有IGS1多肽之氨基酸序列的截短多肽，其中不包括对包括氨基末端的连续残基序列的删除，或对包括羧基末端的连续残基序列的删除，或对两个连续残基序列的删除，其中一个包含氨基末端，一个包含羧基末端。通过结构或功能属性表征的片段也是优选的，例如含有α-螺旋和α-螺旋形成区、β-片层和β-片层形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两亲区、β两亲区、可变形区、表面形成区、底物结合区和高抗原系数区的片段。其它优选的片段为生物活性片段。生物活性片段是那些介导受体活性的片段，包括那些具相似活性或具升高的活性，或具降低的、不希望的活性之片段。也包括那些对动物，尤其对人是抗原或免疫原的片段。
这样，本发明的多肽包括具有氨基酸序列与SEQ ID NO2之氨基酸序列至少80％同一性的多肽和/或具有由DNA插入片段编码的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心，或其片段，其中所述片段与对应片段有至少80％同一性。优选地，所有这些多肽片段保留了受体的生物活性，包括抗原活性。所定义的序列和片段的变体也构成了本发明的一部分。优选的变体是那些通过保守氨基酸替换而不同于参考序列的变体—即用另一个类似特征的残基替换的变体。一般此类替换为Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；以及碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe或Tyr之间。特别优选的变体是其中有数个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸被以任一组合替换、删除或添加。
本发明的IGS1多肽可以任一合适的方式制备。此类多肽包括分离的天然存在多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方法的结合产生的多肽。制备此类多肽的方法为本领域公知。本发明的多核苷酸本发明进一步的方面涉及IGS1多核苷酸。IGS1多核苷酸包括编码IGS1多肽和片段的分离的多核苷酸，以及与其密切相关的多核苷酸。更明确地，本发明的IGS1多核苷酸包括这样的多核苷酸，其包含的核苷酸序列包含于SEQ ID NO1中，例如可编码SEQ ID NO2的IGS1多肽之多核苷酸，具有SEQ ID NO1特定序列的多核苷酸，以及基本上对应于DNA插入片段的多核苷酸，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心。
IGS1多核苷酸还包括如下多核苷酸包含其全长至少与SEQ ID NO2的编码IGS1之多核苷酸序列80％同一性的核苷酸序列之多核苷酸，包含其全长序列与SEQ ID NO1至少80％同一性的核苷酸序列之多核苷酸，以及基本上相应于包含在保藏于荷兰真菌菌种保藏中心的保藏物(CBS 102049)中的DNA插入片段的多核苷酸。
在这点上，具至少90％同一性的多核苷酸是特别优选的，并且那些具至少95％同一性的多核苷酸是尤其优选的。而且，具至少97％同一性的多核苷酸是高度优选的，并且那些具至少98-99％同一性的多核苷酸是最高度优选的，具至少99％同一性的多核苷酸是最优选的。也包括在IGS1多核苷酸条目下的核苷酸序列是这样的，其中所述核苷酸序列为可在一定条件下可与SEQ ID NO1或DNA插入片段中所含有的核苷酸序列具足够的同一性可与之杂交的一段核苷酸序列，其中DNA插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心，所述条件可用于扩增或用作探针或标记。本发明也提供与此类IGS1多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的IGS1与G-蛋白偶联受体家族的其它蛋白质具有结构相关性，这一点可通过公共数据库中BLAST研究结果显示。表2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的主要部分(氨基酸残基7-222和396-470)与兔α-1c肾上腺素能受体(登记号#O02824，Miyamoto S等人，RL life Sci.(1997)602069-2074)具有约30％的同一性(应用BLAST，AltschulS.F.等人，，核酸研究253389-3402)，并且31-220的氨基酸残基与人G-蛋白偶联受体RE2(GenBank登记号#AF091890)具有约33％的同一性。表1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)与人α-1a/d肾上腺素能受体中的266个核苷酸残基(登记号#L31722，Bruno J.F.等人，生物化学与生物物理学研究快讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)(1991)1791485-1490)57％相同，与人G-蛋白偶联受体RE2的前1426个核苷酸残基(GenBank登记号#AF091890)44％相同。进一步地，IGS1蛋白质序列的亲水性分析(Hofmann，K.，Stoffel，W.(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 347166)表明存在7个跨膜结构域。这样，可以预计本发明的IGS1多肽和多核苷酸尤其是具有与它们同源的多肽和多核苷酸类似的生物功能/特性，并且它们的应用对任一本领域技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可从自然资源中获得，如基因组DNA。特别地，可设计简并PCR引物，其编码特定GPCR基因亚家族内的保守区。用简并引物对基因组DNA或cDNA的PCR扩增反应会导致该目标基因家族一些成员的扩增(包括已知的和新的)(当所使用的是基因组模板时，简并引物必须位于同一外显子内)。(Libert等人，科学，1989，244569-572)。本发明的多核苷酸也可用公知的和商业上可得到的技术合成。
编码SEQ ID NO2之IGS1多肽的核苷酸序列可与包含在SEQ IDNO1中的多肽编码序列相同(核苷酸数36至1559)，或者它可以是一个不同的核苷酸序列，因为基因密码子的冗余性(简并性)，其与SEQ IDNO1中含有的多肽编码序列相比，也可显示变化，但仍编码SEQ ID NO2之多肽。
当本发明的多核苷酸用作产生IGS1多肽的重组体时，该多核苷酸可自身包含成熟多肽或其片段的编码序列；也可符合阅读地包含成熟多肽或其片段的编码序列与其它编码序列，例如那些编码前导序列或分泌序列、前蛋白、原蛋白或前原蛋白质序列、或其它融合肽部分。例如，可编码促进融合多肽纯化的标记序列。本发明此方面的某些优选的实施方案中，标记序列是6个组氨酸肽或HA标签，其中pQE载体(Qiagen，Inc.)可提供6个组氨酸肽，并且Gentz等人，美国国家科学院报(1989)86821-824进行了描述。多核苷酸也可包含5’和3’非编码序列，例如转录、非翻译区、剪切和多聚腺苷化信号、核糖体结合位以及稳定mRNA的序列。
进一步优选的实施方案为编码IGS1变体的多核苷酸，其中IGS1变体包含SEQ ID NO2的IGS1多肽之氨基酸序列，其中的几个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸残基以任一组合被替换、删除或添加。
可用本领域普遍公知的方法基因工程设计本发明的多核苷酸，以便为一些目的而改变IGS1编码序列，其包括(但不限于)克隆、加工和/或基因产物之表达的改变。通过随机片段化的DNA改组和基因片段的PCR重新组装以及合成寡核苷酸可用来基因工程化核苷酸序列。例如寡核苷酸介导的定点诱变可用于导入突变，以产生氨基酸替换、产生新的限制性位点、改变修饰作用(例如糖基化作用或磷酸化作用)模式、改变密码子偏好、产生剪接变体等。
本发明进一步涉及可与上述序列杂交的多核苷酸。在这方面，本发明特别涉及到在严紧条件下可与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。此处所用术语“严紧条件”是指只要序列间存在至少80％，优选至少90％，较优选地至少95％，更优选地至少97％，特别优选地至少99％的同一性，则会发生杂交。
本发明的多核苷酸可用作cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码IGS1的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与IGS1基因具有高序列相似性的其它基因(包括编码来自非人物种的同种物或直系同源进化物的基因)的cDNA和基因组克隆，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO1中含有的核苷酸序列或其片段相同或十分相同。本领域技术人员周知此类杂交技术。一般地，这些核苷酸序列与参考的核苷酸序列80％，优选地90％，更优选地95％相同。探针通常包含至少5个核苷酸，并且优选地至少8个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选地至少12个核苷酸，特别是至少15个核苷酸。此类探针最优选的为具有至少30个核苷酸，以及具有至少50个核苷酸。特别优选的探针在30至50个核苷酸的范围之间。
为了获得编码IGS1多肽之多核苷酸，其包括来自非人物种的同种物或直系同源进化物，一个实施方案包含以下步骤在严紧的杂交条件下，用具有SEQ ID NO1或其片段的标记探针筛选合适的文库，并分离含有该核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术为本领域技术人员周知。严紧杂交条件为如上所定义的或经改变的条件，于溶液中42℃过夜温育，然后在约65℃下，用0.1×SSC洗膜，其中所述杂交溶液含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖以及20微克/ml变性的切断鲑精DNA。
本发明的多核苷酸和多肽可用作研究试剂和材料，以发现对动物和人类疾病的治疗和诊断方法。载体、宿主细胞、表达本发明也涉及载体，其包含本发明的一种多核苷酸或多种多核苷酸，还涉及用本发明的载体经基因工程改造的宿主细胞，并涉及用重组技术产生本发明的多肽。通过本发明的DNA构建体得到的RNA，可用无细胞翻译系统产生此类蛋白质。
为了产生重组体，可通过基因工程改造宿主细胞，使之具有本发明之多核苷酸的表达系统或其部分。许多标准的实验室手册中描述的方法可实现多核苷酸导入宿主细胞，例如Davis等人，分子生物学基础方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1986)和Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版(MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，2nd Ed.)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)中描述的例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、transvection、微注射、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导、scrape loading、粒子轰击导入或注射。
合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇属S2(Drosophila S2)和灰翅夜蛾属Sf9(Spodoptera Sf9)细胞；动物细胞例如CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、HEK293和鲍斯黑素瘤细胞(Bowes melanoma cells)；以及植物细胞。
可使用许多表达系统。此类系统尤其包括衍生于染色体的、游离体的以及病毒的系统，例如，衍生于细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离体、插入成分、酵母染色体成分、病毒(如杆状病毒(baculoviruses)、乳多空病毒(papova viruses)如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒(fowl pox viruses)、假狂犬病病毒(pseudorabies viruses)和逆病毒(retroviruses))的质粒，以及衍生于其组合的质粒，如那些衍生于质粒和噬菌体遗传成分的质粒，如粘粒和噬菌粒。表达系统可包含控制区，其调节并引起表达。通常可使用任一系统或载体，其适于在宿主内维持、增殖或表达多核苷酸以产生多肽。可用许多公知的和常规技术之一将合适的核苷酸序列插入表达系统，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(出处同前)。
可将合适的分泌信号加入目标多肽，使被翻译蛋白质分泌入内质网腔、壁膜间隙或分泌至胞外环境。这些信号对多肽而言可以是内源的或者它们可是异源信号。
如果IGS1多肽的表达用于筛选测定，通常优选在细胞表面产生多肽。在这种情况下，可于使用筛选分析前收获细胞。在IGS1多肽的亲和性或功能活性由受体活性修饰蛋白质(RAMP)修饰时，尽可能地在细胞表面共表达相关的RAMP是优选的并且通常是需要的。在这种情况下，同样需要在筛选分析前收获表达IGS1多肽和相关RAMP的细胞。如果IGS1多肽分泌至培养基中，可回收培养基，以回收和纯化多肽；如果产生在胞内，在回收多肽前必须首先裂解细胞。
可采用公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化IGS1多肽，其中包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，使用高效液相色谱法纯化。可使用周知技术进行蛋白质的重折叠，使在分离和/或纯化过程中变性的多肽再生为活性构象。诊断测定本发明也涉及IGS1多核苷酸用作诊断试剂的用途。对与功能紊乱相关的IGS1基因之突变形式的检测可提供一种诊断工具，其可添加至或定义一种疾病或疾病易感性，其源于IGS1的低表达、过表达或表达改变。同样在这种情况下，需要相关的受体活性修饰蛋白质的共表达，以得到所希望质量的诊断测定。可通过一系列技术于DNA水平检测携带IGS1基因突变的个体。
用于诊断的核酸可来自受试者的细胞。例如来自血液、尿、唾液、活组织检查或尸体解剖材料。基因组DNA可直接用于检测或在分析前通过PCR或其它扩增技术对其进行酶扩增。RNA或cDNA也可以类似方式使用。可通过与正常基因型比较扩增产物的大小而检测删除和插入。将扩增的DNA与标记的IGS1核苷酸序列杂交可鉴定点突变。通过RNase消化或通过变性温度的不同可将完全匹配的序列与错配的双链区别开来。通过DNA片段在有或没有变性剂的凝胶中电泳迁移率的改变，或通过直接的DNA测序也可检测DNA序列的差异。见例如Myers等人，科学(1985)2301242。也可通过核酸酶保护测定来揭示特定位点处序列的改变，其中所述核酸酶保护测定例如RNase和S1保护或化学切割方法。见Cotton等人，美国国家科学院院报(1985)854397-4401。在另一个实施方案中，可通过构建寡核苷酸引物阵列来进行例如基因突变的有效扫描，其中所述引物包含IGS1核苷酸序列或其片段。阵列技术方法是周知的，并且具普遍适用性，可用于解决分子遗传学中的许多问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性。(见例如M.Chee等人，科学，274卷，610-613页(1996))。
诊断测定提供了对尤其是上述疾病易感性的诊断或测定方法，方法是通过所述方法检测IGS1基因中的突变。诊断测定特别提供了对精神病学的和CNS紊乱易感性的诊断或测定方法，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛，方法是通过所述方法检测IGS1基因中的突变。
此外，尤其是上述疾病可通过包括测定样本的方法来诊断，其中样本来自于IGS1多肽或IGS1 mRNA水平异常下降或升高的受试者。可通过包括测定样本的方法来诊断，特别是精神病学的和CNS紊乱，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛，其中样本来自于IGS1多肽或IGS1 mRNA水平异常下降或升高的受试者。
可使用任一本领域公知的、用于在RNA水平定量多核苷酸的方法测定表达的下降或升高，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹以及其它杂交方法。用于测定来自宿主样本中蛋白质水平(如IGS1)的测定技术为本领域技术人员公知。此类测定方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析和ELISA测定。
本发明另一方面涉及诊断试剂盒，用于诊断尤其是上述疾病或对上述疾病之一的易感性诊断。特别地，本发明涉及精神病学的和CNS紊乱的诊断试剂盒，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
试剂盒可包含(a)IGS1多核苷酸，优选地SEQ ID NO1的核苷酸序列或其片段；和/或(b)与(a)互补的核苷酸序列；和/或(c)IGS1多肽，优选地SEQ ID NO2的多肽或其片段；和/或(d)针对IGS1多肽的抗体，优选地针对SEQ ID NO2的多肽的抗体；和/或(e)RAMP多肽，其为IGS1多肽的相关生物特性或抗原特性所需。
应当理解在任一此类试剂盒中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可包括其基本成分。染色体测定本发明的核苷酸序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向并且能与个体的人染色体上之特定位置杂交。根据本发明对染色体相关序列的作图是将那些序列与基因相关疾病联系起来的第一步重要步骤。一旦某个序列被作图至精确的染色体位置，则可使该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相联系。此类数据可在，例如V.McKusick，人类孟德尔遗传(Mendelian Inheritance in Man)(通过与约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆联机可获得)中找到。然后通过连锁分析(物理毗连基因的共同继承)鉴定作图至同一染色体区的基因和疾病的关系。
也可测定受影响的和未受影响的个体cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部受影响的个体观察到了某个突变，而未在任一正常个体观察到该突变，则这个突变可能是引起疾病的因子。抗体本发明的多核苷酸或其片段或其类似物，或表达它们(如果需要的话，与相关的RAMP一起表达)的细胞也可作为免疫原，以产生对IGS1多肽免疫特异性的抗体。术语“免疫特异性的”指抗体对本发明之多肽的亲和性与它们对现有技术中其它相关多肽的亲和性相比较，抗体对前者具有明显较大的亲和性。
可使用常规方法，通过将多肽或具有表位的片段、类似物或细胞施与动物，优选的非人，以获得产生针对IGS1多肽的抗体。对于单克隆抗体的制备而言，可使用任一提供通过连续的细胞系培养而产生抗体的技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，自然(1975)256495-497)、三瘤trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，今日免疫学(Immunology Today)(1983)472)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体与肿瘤治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY)，77-96页，Alan R.Liss.Inc.，1985)。
上述抗体可用于分离或鉴定表达多肽的克隆，或通过亲和层析法纯化多肽。
此类抗IGS1多肽抗体、或抗IGS1多肽-RAMP复合物抗体也可用于治疗尤其是上述疾病。特别地，此类抗IGS1多肽抗体、或抗IGS1多肽-RAMP复合物抗体可用于治疗精神病学的和CNS紊乱，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。动物本发明的另一方面涉及基于非人动物的系统，其用作因IGS1反常表达或活性异常而致的紊乱模型。基于非人动物的模型系统也可用于进一步表征IGS1基因的活性。此系统可用作为鉴定化合物而设计的筛选策略之一部分，其中所述化合物能治疗基于IGS1的紊乱，尤其是上述疾病。特别地，该系统可用作为鉴定化合物而设计的筛选策略之一部分，其中所述化合物能治疗基于IGS1之精神病学的和CNS紊乱，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
以这种方式，基于动物的模型可用于鉴定药物化合物、疗法以及干预法，它们可有效治疗反常IGS1表达或活性异常而致的紊乱。此外，此类动物模型可用于确定受试动物的LD50和ED50。这些数据可用于确定潜在的IGS1紊乱治疗的体内有效性。
基于IGS1紊乱的基于动物的模型系统可包括非重组动物和重组基因工程的转基因动物，其中所述紊乱是基于反常的IGS1表达或活性异常。
IGS1紊乱的动物的模型包括例如遗传模型。显示基于IGS1紊乱样症状的动物模型可通过使用例如，将如上所述的那些IGS1序列与本领域技术人员周知的产生转基因动物的技术相结合，进行基因工程设计。例如，可将IGS1序列导入目标动物的基因组，并使之过表达和/或错表达，或者，如果存在内源的IGS1序列时，它们可被过表达、错表达或另外地它们可被破坏，以使IGS1基因的表达不足或失活。
为了过表达或错表达IGS1基因序列，可将IGS1基因序列的编码部分与调节序列连接，后者能驱动高水平的基因表达，或在通常不表达该基因的目标动物类型的细胞类型中表达该基因。此类调节区将为本领域技术人员周知，且无需过度实验即可利用。
对于内源的IGS1基因序列的低表达，可分离并基因工程设计这样的序列，使其重新导入目标动物的基因组后，可失活或“敲除”内源IGS1基因的等位基因。优选地，基因工程的IGS1基因序列通过基因打靶导入，使内源的IGS1序列在基因工程的IGS1基因序列整合入动物基因组后被破坏。
可用来产生IGS1相关紊乱之动物模型的任一类动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、兔子、松鼠、豚鼠、猪、小猪、山羊以及非人灵长类的动物，例如狒狒、猴子和黑猩猩。
可用本领域公知的任一技术将IGS1转基因导入动物，以产生转基因动物的起始系。此类技术包括，但不限于，原核显微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，美国专利号4,873,191)；逆病毒介导的胚系基因转移(van der Putten等人，美国国家科学院院报826148-6152，1985)；胚胎干细胞的基因打靶(Thompson等人，细胞(Cell)56313-321，1989，)；胚胎的电穿孔(Lo，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)31803-1814，1983)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等人，细胞57717-723，1989)等。此类技术的综述见Gordon，转基因动物，国际细胞学评论(Intl.Rev.Cytol.)115171-229，1989。
本发明提供所有细胞内均携带IGS1转基因的转基因动物，以及一些细胞(而非所有细胞)内携带该转基因的动物，即镶嵌动物。(见例如，Jakobovits描述的技术，当前生物学(Curr.Biol.)4；761-763，1994)。转基因可作为单一转基因整合或作为串联体整合，例如头-头串联或头-尾串联。通过例如下述Lasko等人的方法(Lasko，M.等人，美国国家科学院院报896232-6236，1992)，该转基因可被选择性导入特定的细胞类型并活化。
此类细胞类型特异性活化所需调节序列依赖于特定的目标细胞类型，并且这一点对本领域技术人员是显然的。
当希望IGS1转基因被整合于内源IGS1基因的染色体位点时，优选基因打靶。简而言之，当欲应用此技术时，设计用作整合目的之载体，其中所述载体含有与目标内源IGS1基因同源的一些核苷酸序列(例如小鼠IGS1基因的核苷酸序列)，通过与染色体序列的同源重组，导入并破坏内源IGS1基因或IGS1基因的等位基因的核苷酸序列之功能。通过例如下述Gu等人(Gu，H.等人，科学265103-106，1994)的方法，该转基因也可被选择性导入特定的细胞类型，这样仅在该细胞类型中失活目标内源基因。此类细胞类型特异性失活所需调节序列依赖于特定的目标细胞类型，并且对本领域技术人员是显然的。
一旦产生了转基因动物，可用标准技术测定重组IGS1基因和蛋白质的表达。最初的筛选可通过Southern印迹分析或PCR技术来分析动物组织，以测定是否转基因的整合已发生。也可使用如下技术评估转基因动物组织中IGS1转基因的mRNA表达水平，其中技术包括，但不限于，对来自动物组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析及RT-PCR。表达目标基因的组织样品也可使用抗体免疫细胞化学评估，其中抗体对目标基因的转基因目标产物是特异的。然后对以易于检测到的水平表达IGS1基因mRNA或IGS1转基因肽(用直接抗目标基因产物表位的抗体通过免疫细胞化学检测)的IGS1转基因动物进行进一步的评估，以鉴定显示特征性基于IGS1紊乱症状的那些动物。
一旦产生IGS1转基因的起始动物(即那些在目标细胞或组织中表达IGS1蛋白质的动物，并且优选地，显示基于IGS1紊乱症状的那些动物)，可对它们进行繁殖、近交繁殖、杂交繁殖或杂交育种，以产生特定动物群体。此类繁殖策略的实例包括，但不限于将具有多于一个整合位点的起始动物杂交繁殖，以建立分离品系；将分离品系近交繁殖，以产生复合的IGS1转基因学，因为每个IGS1转基因的加合表达作用，其可高水平表达目标IGS1转基因；杂合子的转基因动物杂交，以在特定整合位点产生纯合动物，目的在于提高表达并无需通过DNA分析来筛选动物；将分离的纯合子品系杂交，以产生复合的杂合子或纯合子品系；繁殖具有不同近交繁殖遗传背景的动物，以检验改变等位基因对IGS1转基因的表达及对产生IGS1样症状的影响。一种方法是将IGS1转基因的起始动物与野生型品系杂交，以产生显示如上所述的那些IGS1相关的紊乱样症状之F1代。然后将F1代近交，以开发一种纯合子品系，如果发现纯合子的目标基因转基因动物可存活。疫苗本发明的另一方面涉及诱导哺乳动物免疫反应的方法，其包括施与(例如通过接种)哺乳动物IGS1多肽或其片段，如果需要的话，与RAMP多肽一同施与，足以产生抗体和/或T细胞免疫反应，以保护所述的动物免于尤其是上述疾病之一。
本发明的另一个方面涉及诱导哺乳动物免疫反应的方法，其包括通过载体递送IGS1多肽，其中载体可于体内表达IGS1多核苷酸，以诱导免疫反应，保护所述的动物免于疾病。
本发明进一步的方面涉及免疫/疫苗制剂(组合物)，其导入哺乳动物宿主后，可在哺乳动物内诱导对IGS1多肽的免疫反应，其中组合物包含IGS1多肽或IGS1基因。此类免疫/疫苗制剂(组合物)可为治疗性免疫/疫苗制剂或预防性免疫/疫苗制剂。疫苗制剂可进一步包含合适的载体。因为IGS1多肽在胃中可被降解，故优选地肠胃外施用(包括皮下注射、肌内注射、静脉内注射、真皮内注射等)。适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和可使制剂与受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可包含悬浮因子或增稠因子。制剂可以单位剂量或多剂量存在于容器中，例如密封安瓿和小玻璃瓶，并且可在冷冻干燥条件下储存，在使用前只需加入无菌液体载体。疫苗制剂也可包含佐剂系统，以促进制剂的免疫原性，例如本领域公知的水包油系统和其它系统。剂量依赖于疫苗的比活性，并且很容易通过常规实验测定。筛选测定本发明的IGS1多肽可用作化合物的筛选方法，其中化合物与该受体结合，并且活化(激动剂)或抑制(拮抗剂)本发明之受体多肽的活化。这样，本发明的多肽也可用于评估在例如，细胞、无细胞制备物、化学文库以及天然产物混合物中，小分子底物与配体的结合。这些底物和配体可以是天然的底物和配体，或者是结构或功能的模拟物。
IGS1多肽负责生物功能，包括病理学方面。据此希望找到化合物和药物，其一方面刺激IGS1，并且另一方面其可抑制IGS1的功能。通常，激动剂用于对尤其是上述疾病情况的治疗和预防目的。特别地，激动剂用于对精神病学的和CNS紊乱的治疗和预防目的，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
拮抗剂可用于对尤其是上述疾病情况的一系列治疗和预防目的。特别地，拮抗剂用于对精神病学的和CNS紊乱的治疗和预防目的，尤其是运动机能障碍、运动失调或疾病，例如抽搐、震颤、图雷特氏综合征、帕金森氏疾病、亨廷顿疾病、运动障碍、张力障碍和痉挛。
通常，此筛选步骤包括产生合适的细胞，其在表面表达本发明的受体多肽，并且如果必要的话，与RAMP在其表面共表达。此类细胞包括来自哺乳动物、酵母、果蝇属或大肠杆菌的细胞。然后，将表达该受体的细胞(或含有表达受体的细胞膜)与试验化合物接触，以观察结合，或功能反应的刺激或抑制。
一种筛选技术包括在系统中使用表达本发明的受体之细胞(例如，转染的CHO细胞)，其中系统可测量胞外pH、胞内pH或受体活化引起的胞内钙变化。在此技术中，化合物与表达本发明的受体多肽的细胞接触，然后测定第二信使反应，例如信号转导、pH改变或钙水平的改变，以确定潜在的化合物是否活化或抑制了该受体。
另一种方法涉及受体抑制剂的筛选，它通过测定受体介导的信号调节而进行，例如cAMP累积和/或腺苷酸环化酶活性。此方法包括用本发明的受体转染真核细胞，以在细胞表面表达该受体。然后当存在潜在的拮抗剂时，将细胞暴露于本发明的受体之激动剂。如果潜在的拮抗剂与受体结合，这样会抑制受体的结合，调节激动剂介导的信号。
另一种检测本发明的受体之激动剂或拮抗剂的方法是在美国专利号5,482,835中描述的基于酵母的技术。
测定可只需测试候选化合物的结合，其中与带有受体之细胞的粘附可通过与候选化合物直接或间接结合的标记而检测，或者测定中涉及到与标记的竞争物竞争。进一步地，使用适于对表面携带受体之细胞的检测系统，这些测定可测试候选化合物是否通过活化受体导致信号产生。通常在公知的激动剂存在时，测定活化作用的抑制剂，并且在候选化合物存在时，观察激动剂对活化作用的影响。
进一步地，测定可只需包含以下步骤将候选化合物与含有IGS1多肽的溶液混合以形成混合物，测定混合物中IGS1活性，并将混合物的IGS1活性与标准比较。
IGS1 cDNA、蛋白质以及该蛋白质的抗体也可用于构型测定，用于检测添加的化合物对细胞内IGS1 mRNA和蛋白质产生的影响。例如通过本领域公知的标准方法，用单克隆和多克隆抗体构建ELISA，以测定IGS1蛋白质的分泌水平或细胞相关水平，并且它可用于从经适当操作的细胞或组织中发现这样的药剂，其可抑制或增强IGS1的产生(也分别称为拮抗剂和激动剂)。进行筛选测定的标准方法为本领域周知。
潜在的IGS1拮抗剂的实例包括抗体或，在有些时候，为寡核苷酸或与IGS1的配体密切相关的蛋白质，例如配体的片段或小分子，其与受体结合但不引起反应，导致受体活性被抑制。
这样在另一方面，本发明涉及筛选试剂盒，其用于鉴定IGS1多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等；或者用于鉴定降低或增强IGS1多肽产生的化合物，其包括(a)IGS1多肽，优选地SEQ ID NO2的多肽；(b)表达IGS1多肽的重组细胞，优选地表达SEQ ID NO2的重组细胞；(c)表达IGS1多肽的细胞膜，优选地表达SEQ ID NO2的细胞膜；或(d)针对IGS1多肽的抗体，优选地SEQ ID NO2的抗体。
应当理解在任一此类试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可包括其基本成分。预防和治疗方法本发明提供了治疗与IGS1活性过量或不足有关的反常情况的方法。
如果IGS1活性过度，可采用一些方法。一种方法包括将如上所述的抑制剂化合物(拮抗剂)与药学可接受的载体一起以有效量施与受试者，通过阻断配体与IGS1的结合，或通过抑制与RAMP多肽或第二信号的相互作用，从而抑制活化作用，由此缓解反常情况。
在另一种方法中，可施用IGS1多肽的可溶形式，其仍可与内源的IGS1竞争地结合配体。此类竞争物的一般实施方案包括IGS1多肽片段。
还有另一种方法，编码内源IGS1的基因之表达可用表达-阻断技术抑制。公知的此类技术涉及反义序列的使用，该反义序列或在内部产生，或单独施用。见例如，O’Connor，神经化学杂志(J Neurochem)(1991)56560寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of Gene Expression)，CRC Press，Boca Raton，美国弗罗里达(1988)。另外，可提供能与基因形成三股螺旋的寡核苷酸。见例如，Lee等人，核酸研究(1979)63073；Cooney等人，科学(1988)241456；Derven等人，科学，(1991)2511360。这些寡聚物本身是可施用的，或者可在体内表达相关的寡聚物。合成的反义或三链寡核苷酸可含有经修饰的碱基或经修饰的主链。后者的实例包括甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸主链。在反义或三链寡核苷酸中掺入此类主链，以保护不受核酸酶的降解，并且为本领域周知。合成的具有这些或其它经修饰主链的反义或三链分子也形成了本发明的一部分。
此外，可使用对IGS1 mRNA序列特异的核酶阻止IGS1多肽的表达。核酶是具有酶活性的RNA，其可为天然的或合成的(见例如Usman，N.等人，结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)(1996)6(4)，527-33)。合成的核酶可设计为在所选位点特异地切割IGS1 mRNA，由此阻止IGS1mRNA翻译为功能多肽。可用天然的核糖磷酸主链和天然碱基合成核酶，正如通常在RNA分子中所见。另外，可用非天然的主链合成核酶，以提供免受核酸酶降解的保护，例如2’-O-甲基RNA，并且可含有经修饰的碱基。
为治疗与IGS1和其活性低表达相关的反常情况，也可采用一些方法。一种方法包括将活化IGS1的化合物(即上述的激动剂)与药学可接受的载体组合以治疗有效量施与受试者，以因此减轻反常情况。另外，可使用基因治疗，以实现受试者体内的相关细胞产生内源IGS1。例如，如上所讨论的，本发明的多核苷酸可被基因工程设计，以便在复制缺陷的逆病毒载体中表达。然后可分离该逆病毒表达构建体并将其导入包装细胞，其中包装细胞用含有编码本发明多肽的RNA的逆病毒质粒载体转导，使得包装细胞现在可产生含有目标基因的感染性病毒粒子。这些生产者细胞可施与受试者用于体内构建细胞，并在体内表达多肽。基因治疗的综述见人分子遗传学(Human Molecular Genetics)一书中第20章，基因治疗和其它基于分子遗传的治疗方法(Chapter 20，Gene Therapy andother Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches)(并且此处引用作为参考)，Strachan T.和Read A.P.，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996).
上述任一治疗方法可用于任一需要此类治疗的受试者，包括例如，哺乳动物如狗、猫、牛、马、兔、猴以及最优选地，人。
制剂及施用肽，例如IGS1多肽的可溶形式，以及激动剂和拮抗剂肽或小分子，可与合适的药物载体组合而形成制剂。此类制剂包括治疗有效量的多肽或化合物，以及药学可接受的载体或赋形剂。制剂应该为适于施用的模式，并且在本领域的技术范围内。本发明进一步涉及药学包装和试剂盒，它们含有用一种或多种本发明的上述组合物之成分填充的一个或多个容器。
本发明的多肽和其它化合物可单独使用，或与其它化合物，如治疗化合物结合。
对药物组合物进行系统施用的优选形式包括注射，一般通过静脉内注射。也可用其它注射途径，例如皮下注射、肌内注射或腹腔内注射。用于系统施用的其它途径包括使用渗透剂(如胆汁盐或夫西地酸或其它去污剂)经粘膜和经皮肤施用。此外，如果存在合适的肠制剂或胶囊制剂，也可口服施用。
所需的剂量范围依赖于对肽或化合物的选择、施用途径、制剂的性质、受试者情况的性质和主治开业医生的决定。合适的剂量范围为0.1-100μg/kg受试者。但鉴于许多化合物是可得到的，以及不同的施用途径具有不同的有效性，可以预计所需剂量存在大的差异。例如，可以预计口服施用与静脉内注射比较，前者需要较高的剂量。这些剂量水平间的差异可用标准的日常经验调整优化，这一点为本领域周知。
用于治疗的多肽也可在受试者体内内源地产生，在治疗形式上通常称为如上所述的“基因治疗”。这样例如，来自受试者的细胞可用多核苷酸(如DNA或RNA)基因工程改造，以离体编码多肽，以及例如，通过逆病毒质粒载体的使用。然后将细胞导入受试者。
下列实施例只用于进一步较详细地说明本发明，因此这些实施例无论如何不用于限制本发明的范围。实施例1.编码新的G蛋白偶联受体之cDNA克隆实施例1a.基因组片段的同源PCR克隆，其中基因组片段编码新的G蛋白偶联受体(GPCR)。
基于PCR的同源克隆策略用于分离部分基因组DNA序列，其中所述基因组DNA序列编码新的G蛋白偶联受体。分别在神经紧张素受体基因家族跨膜结构域1(TM1)的保守区内以及跨膜结构域3与胞内环n02(TM3/12)交界处设计下列正向(F11)和反向(R13)简并PCR引物F11(TM1)5’-CATCTTCGTCGTCGGCAC(A，C，G orT)G(C or T)(A，C，G or T)GG(A，C，G or T)AA-3’(SEQ ID NO3)R13(TM3/12)5’-GGGTGGCAGATGGCCA(A or G)(A or G)(C or T)A(A，C，G orT)c(G or T)(C or T)TC-3’(SEQ ID NO4)
此外，设计了一条3’封闭的寡引物(HNTR1F1STOP)HNTR1F1STOP5’-ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT-3’-3’-dA(SEQ ID NO5)3’封闭引物对人神经紧张素受体(NTR1)cDNA TM1编码区中是特异的，并且与简并正向引物部分重叠(和竞争)。它的3’-末端用3’-脱氧腺苷基团封闭，以阻止聚合酶催化的延伸(Eurogentec，Belgium catalogueOL-0401-0302)。
于60μl体积中进行PCR反应，其中含有100ng人基因组DNA(Clontech)、6μl 10×PCR缓冲液II(100mM Tris-HCl pH8.3；500mMKCl，Perkin Elmer)、3.μl 25mM MgCl2、0.36μl dNTP(每种dNTP25mM)、1.5单位AmpliTaqTM聚合酶(Perkin Elmer)、每条简并的正向和反向引物各30pmole，以及3’封闭引物100pmole。反应管于94℃加热2分钟，然后进行20个循环的变性(94℃，30秒)、退火(55℃，1分钟，每次减少-0.25℃/循环)和延伸(72℃，1分钟)，接下来进行另一轮20个循环的变性(94℃，30秒)、退火(50℃，1分钟)和延伸(72℃，1分钟)。最后于72℃5分钟加热反应管。2％琼脂糖凝胶对PCR反应产物的大小进行分离并用溴化乙锭染色。用Qiaex-IITM纯化试剂盒(QiagenInc.)纯化凝胶上预期大小(±300bp)的片段，并按照供应商(pGEM-T试剂盒Promega)推荐步骤连接至pGEM-T质粒。这样产生的重组质粒用于转化感受态大肠杆菌SURETM2细菌(Stratagene)。
将转化的细胞铺于含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(0.5mM)和X-gal(50μg/ml)的LB琼脂平板。菌落转移至Hybond N+膜(Amersham)上并根据Buluwela等人的微波炉步骤(核酸研究17，452页；1989)变性和固定DNA。转移集落用改良Church缓冲液(0.5M磷酸盐、7％SDS、10mM EDTA)65℃预杂交2小时，然后在含有等摩尔32P-标记的人神经紧张素受体1和2 cDNA探针(NTR1/2)之2×106cpm/ml的同一缓冲液中65℃过夜杂交。根据供应商提供的指导，用Prime-It II kitTM(Stratagene)通过随机引物法将[α-32P]dCTP掺入，进行cDNA探针的放射性标记，使其比活性＞109cpm/μg，其中所述cDNA探针含有人NTR1和NTR2的全部编码序列。在高严紧条件下洗杂交滤膜(用2×SSC/0.1％SDS室温下洗2×30分钟，然后用0.1×SSC、0.1％SDS于65℃洗2次，每次40分钟)，并且放射自显影过夜。选择一些高严紧洗膜后显示无杂交信号的随机白色集落用于DNA序列分析。
用ABI Prism BigDye终止末端循环测序反应试剂盒(PE-ABI)进行DNA测序反应。通过EtOH/NaOAc沉淀来纯化循环测序反应产物并上样于ABI 373自动测序仪。鉴定到了两个几乎一样的克隆(HNT642和HNT768)，其似乎编码GPCR家族中一个新成员的部分。我们称该新的GPCR为IGS1。
表3所用的寡引物总览
实施例1b.含有完整IGS1编码序列的cDNA片段之克隆通过cDNA末端的快速扩增法(RACE分析)获得IGS1 cDNA的完整编码序列。用Marathon-ReadyTM人脑cDNA(Clontech n07400-1)进行5’和3’RACE PCR，所用引物为MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech K1802-1)提供的接头引物1(AP1SEQ ID NO6)和基于克隆HNT642和HNT768之DNA序列(图1)的IGS1特异性引物IP11261(3’RACE；SEQ ID NO9)，以及IP11262和IP11263(5’RACE；分别为SEQ ID NO10和11)。接下来用接头引物2(AP2；SEQ ID NO7)和IGS1特异性巢式引物IP11260(3’RACE；SEQ ID NO8)，以及IP11515和IP11516(5’RACE；分别为SEQ ID NO13和14)进行巢式RACE PCR。根据Clontech所提供的Marathon-ReadyTMcDNA用户手册中的指导进行初次和巢式PCR RACE反应。用1％琼脂糖凝胶分离巢式PCR RACE产物并用EtBr染色。将凝胶印迹至Hybond N+膜上，并与克隆HNT642之32P-标记的插入片段于Church杂交缓冲液65℃过夜杂交。
AP2/IP11515和AP2/IP11516 5’RACE巢式PCR反应的Southern印迹分析均显示一些阳性条带(±200bp、±250bp、±330bp、±360bp、±400bp和±700bp)。从凝胶上纯化这些条带中的每一条带并克隆入pGEM-T质粒载体(在克隆前混合IP11515和IP11516巢式5’RACE反应的单独PCR片段)。对来自每个片段的3-4个随机集落进行测序(＝克隆HNT1393-1412)(图1)。
巢式AP2/IP11260 3’-RACE PCR反应显示一些条带。从凝胶上纯化可与IGS1探针杂交之3’巢式RACE PCR的最大片段(±1,550bp)，并连接至pGEM-T(Promega)，用于转化感受态大肠杆菌SURE II细胞。用克隆HNT642之32p-标记的插入片段进行集落杂交，鉴定来自该连接反应的IGS1特异的转化子。如前所述与探针进行集落印迹杂交，并且在高严紧条件下洗(0.1×SSC 0.1％SDS 65℃洗30分钟)。对3’RACE巢式PCR文库的杂交筛选产生了3个阳性克隆。对它们中的两个进行测序(HNT1413-1414)。
在两个附加的实验中，按照供应商(Clontech PT1156-1)所提供手册中的步骤，从Marathon-ReadyTM人脑cDNA(Clontech)获得另外三个3’RACE cDNA克隆(HB4686、HB4687和HB4688)。在一个实验中，对来自初级3’RACE反应的产物(用IGS1特异性引物IIP11261和接头引物AP1获得)用半巢式引物对IP11260/IP11261(分别为SEQ ID NO8和16)再扩增。这样产生了预想的±1400bp片段，将其从凝胶上纯化并克隆入pGEM-T质粒载体，产生克隆HB4686和HB4687。在另一个实验中，对初级3’RACE PCR反应产物(用IGS1特异性引物IP11684(SEQ ID NO15)和接头引物AP1获得)用巢式引物对IP11260/IP11261再扩增。从这个反应中产生了一条±1400bp片段，将其纯化并克隆入pGEM-T质粒载体，产生克隆HB4688。
对所有分离的IGS1 cDNA克隆全长测序，并可组装为单一的毗连序列群(图1)。此处以IGS1 DNA(SEQ ID NO1)给出邻接的cDNA序列部分，其中邻接的cDNA序列是对至少四个独立的cDNA克隆进行测定所确定的。对此毗连序列群的翻译显示出一个长的开放读码框，其可预测为含有508个氨基酸的蛋白质，该蛋白质显示出与GPCR蛋白质(IGS1PROT；SEQ ID NO2)具有好的同源性。将IGS1毗连序列群的DNA序列与已表达序列标志数据库(dbest)进行计算机辅助的同源性研究(Blastn；Altschul S.F.等人，，核酸研究，253389-3402)，显示存在EST20889(登记号AA318717)和EST登记号AI672141，它们均与IGS1毗连序列群的3’末端重叠，但位于IGS1开放读码框外(图1)。实施例1c.分离含有全长IGS1编码序列之邻接的cDNA片段通过对克隆HNT1398和HNT1413模板进行重叠-PCR产生邻接的IGS1 cDNA克隆。在独立的反应中(50μl)分别用引物IP12264/IP11264(分别为SEQ ID NO18和12)和IP11260/IP11262(分别为SEQ ID NO8和17)对100ng HNT1398质粒DNA和100ng HNT1413质粒进行PCR扩增，(用ExpandTMHigh Fidelity PCR系统[Boehringer]变性[94℃，30秒]、退火[60℃，30秒]和延伸[72℃，1分钟]反应30个循环)。将每个PCR反应产物取1μl合并，并用引物对IP12264/IP12261在同样条件下再扩增。该重叠-PCR产生了一条±1730bp的条带，将其从凝胶上纯化并连接入pGEM-T质粒载体。重组质粒用于转化感受态大肠杆菌DH5αF’细菌。将转化的细胞铺于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板。从一些随机集落中制备质粒DNA，并通过限制性消化确定插入片段的大小。对含有±1730bp插入片段的三个克隆测序。克隆HB4693的序列与共有的IGS1 cDNA序列完全相同(见图1)。带有质粒HB4693的菌株在再次铺于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板后，进行再克隆并保藏于Innogenetics菌种目录(ICCG#4297)和位于Baarn的真菌菌种保藏中心(CBS)，荷兰(保藏号CBS102049)。对从再克隆的分离株制备的质粒DNA再次测序，并发现与以前测得的共有序列相同。
注意我们后来发现引物IP12262序列不包括在克隆HNT1413的插入序列中，并因此从HNT1413模板不能产生扩增子。由此我们推断通过HNT1413质粒DNA(作为携带污染而存在于重叠PCR反应管)与HNT1398模板产生的扩增子之间的直接重叠，导致了重叠片段的成功扩增。实施例2.IGS1的NORTHERN和“MTE阵列”分析实施例2a.pcDNA3.1(+)hu IGS1表达载体的构建5μg pcDNA3.1(+)(Invitrogen)用Hind III酶切(37℃，3小时)，存在dNTP(0.25mM f.c.)时用T4聚合酶补平，并且进行凝胶分析。将线性化的DNA从凝胶上洗脱(使用Qiagen的Qiaex II提取试剂盒)并溶于40μlH2O。该DNA用Not I消化，并再次进行凝胶分析。用Qiaex II凝胶提取试剂盒从凝胶上洗脱所获得的5364bp载体片段，并溶于40μlH2O。取5μl于凝胶上分析，以检查大小、量和纯度。
5μg pGEM-T hu IGS1质粒(ICCG#4297)用Nae I/Not I消化(37℃，3小时)后，可得到人IGS1编码序列。琼脂糖凝胶电泳显示消化产生了400bp、1629bp和2702bp的三个片段。从凝胶上洗脱1629bp的片段(Qiaex II)，并重新溶于40μl H2O。取5μl于凝胶上分析。
向Ready-To-Go连接酶管(T4DNA连接酶，Amersham PharmaciaBiotech)加入1μlHind III消化的pcDNA3.1(+)载体、3μl插入片段和16μlH2O，于室温温育1小时。用2μl的连接反应混合物转化经化学处理的感受态DH5αF’细菌。将200μl转化的细菌铺于LB平板(100μg氨苄青霉素/ml)，于37℃过夜生长。挑选16个随机克隆，并培养于3ml含氨苄青霉素的LB培养基中。用BioRobotTM9600核酸纯化系统(Qiagen)制备质粒DNA，并通过Not I、Pst I和Sph I限制性酶进行限制性分析。对来自一个具有正确限制性酶切模式之集落的DNA部分测序，以证实插入位点并发现具有预计的序列。部分测序的克隆保藏于Innogenetics菌种目录(ICCG#4350)，并从保藏菌株制备大量的DNA(MegaPrep，Qiagen500试剂盒)。该大规模的DNA制备物(3μg/μl，共500μl)的序列分析证实了预计的序列。实施例2b.MTE(多组织表达)阵列分析25ng人IGS1 DNA(来自peDNA3.1 huIGS1[ICCG#4350]的1093bpAat II插入片段)用(α-32P)-dCTP标记。用Micro Bio-Spin P-30柱(BioRad)纯化该标记探针。16×106cpm标记的huIGS1 cDNA探针与30μg的C0t-1、150μg的切断鲱精DNA和50μl 20×SSC混合成总体积200μl，于95℃加热5分钟，然后于68℃温育30分钟。将该混合物加入5ml Express Hyb溶液，并均匀分布在人多组织表达(MTE)阵列(Clontech#7775-1)上。该阵列于68℃过夜杂交。用2×SSC/1％SDS 65℃洗印迹4次20分钟，然后用0.1×SSC/0.5％SDS 55℃洗2次20分钟。该印迹用X线胶片放射自显影。
IGS1探针在MTE阵列上的杂交显示只有尾状核和豆状核具强信号(图2)。实施例2c.Northern印迹分析25ng人IGS1 DNA(来自peDNA3.1 huIGS1[ICCG#4350]的1093bpAat II插入片段)用(α-32P)-dCTP标记。用Micro Bio-Spin P-30柱(BioRad)纯化该标记探针。8×106cpm标记的huIGS1 cDNA探针于95℃变性5分钟，并将其加入5ml Express Hyb溶液，并均匀分布在人脑MTN Blots II或IV(分别为Clontech#7755-1和#7769-1)上。该印迹于68℃过夜杂交。用2×SSC/0.05％SDS室温洗印迹4次10分钟，然后用0.1×SSC/0.1％SDS 50℃洗2次40分钟。该印迹用X线胶片放射自显影。
IGS1探针与来自不同人脑区RNA的Northern印迹杂交显示位于豆状核和尾状核的两条约4,400和9,000核苷酸(nt)的强带(图3)。较低的带为尾状核，稍密集，而另一个为豆状核的情况。于背侧丘脑也可见到4,400和9,000nt的带，但两者均很弱。此外于黑质可检测到一条很弱的9,000nt转录物，但没有4,400nt的带。最后于小脑、髓质和杏仁体观察到极弱的9,000nt带。于背侧丘脑和黑质不能观察到4,400nt的带。这些结果与MTE分析结果相吻合，其根据是于尾状核和豆状核观察到IGS1的最强表达。但未预料到会存在2个转录物。虽然4,400nt带最可能对应于IGS1 mRNA，但对9,000nt带的来源还不清楚。因为IGS1基因不包含内含子(至少在编码区没有)，故9,000nt转录物可能不是未剪接或其它剪接的转录物。它可能是具有另外的多聚腺苷化作用位点的IGS1转录物，或者它只是一种交叉杂交的类。我们假定只可检测到一条很弱的9,000nt转录物而未检测到4,400nt转录物的情况时，这是因为9,000nt转录物较4,400nt转录物稍强，以及这条较低带因此刚好在Northern测定的检测限之下。
通过大鼠脑的IGS1原位杂交分析进一步证实了这些结果，其在与上述同样的解剖区中检测到了IGS1的表达。实施例3.筛选推定的IGS1配体实施例1a.构建IGS1转染的CHOG 16-细胞为鉴定IGS1的配体，用IGS1稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。由于IGS1的G蛋白耦联机制未知，故使用了特定的CHO细胞株，其表达G-蛋白G 16(CHOG 16，Molecular Devices)，是GPCR公知的“普遍性接合体”(Milligan G.，等人(1996)药物科学趋势(TrendsPharmacol.Sci.)17235-7)。
所用材料包括IGS1-pREP9载体；SuperFect Transfection Reagent(Qiagen)；生长培养基CHO-S-SFM II(Gibco BRL)，补充10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、潮霉素B 400μg/ml；选择培养基CHO-S-SFM II(Gibco BRL)，补充10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、潮霉素B 400μg/ml和Geneticin 500μg/ml；RNeasy微试剂盒(Qiagen)、DNase I(Ambion，2U/μl)、SuperScript II(Gibco BRL)、SuperScript II200U(Gibco BRL)、AmpliTaq(PerkinElmer)通过Xho I/Nhe I位点将IGS1编码序列从pcDNA3.1huIGS1[ICCG#4350]克隆入pREP9(Invitrogen)。按供应商所述用SuperFect(Qiagen)转染CHOGα16细胞。在T25烧瓶中进行转染。用生长培养基培养24小时后，弃去培养基并换上选择培养基。于选择培养基中生长汇片后，将多克隆于T25烧瓶传代两次。细胞通过有限稀释接种，以获得单克隆。
通过RT-PCR选择单克隆。对14个单克隆进行测试。根据所提供的方法，用RNeasy微试剂盒(Qiagen)从单克隆(来自24孔板的1个汇片孔)分离RNA。DNase I(Ambion，2U/μl)处理RNA，每个样品用1U。用SuperScript II(Gibco BRL)对一半的RNA样品进行RT-PCR。RNA和oligo-dT16(0.6μM)于65℃ 10分钟进行引物退火，然后置于15℃。加入第一链缓冲液(Gibco BRL)，及dNTP各0.43mM、DTT10mM、20U RNasin(Promega，40U/μl)和SuperScript II200U(GibcoBRL，200U/μl)至终体积30μl，然后于42℃温育1小时。
用IGS1特异性内引物、AmpliTaq(PerkinElmer)进行25μl的PCR。首先进行35个循环的PCR。为了证实阳性单克隆并获得最佳的一个单克隆，用较少的循环及较高的退火温度进行另一轮PCR。每次PCR反应用2μl第一链cDNA(来自30μl)。
6个最佳单克隆于T25烧瓶中生长汇片并于含有10％DMSO的生长培养基中冷冻。实施例3b.测定细胞内钙用Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)测定对推定配体的反应所引起的细胞内钙转移，从而对CHOG 16-IGS1细胞进行功能筛选。
对细胞的制备，使用了下列材料洁净、平底、黑色孔96孔板(Costar)；生长培养基补充10％胎牛血清(Gibco)的含有Glutamax(Gibco)的Nut-Mix F-12(HAM)；培养箱5％CO2，37℃(Nuaire)。
在实验前24小时或48小时接种细胞至黑色壁微孔板。欲培养48小时的细胞密度为0.8×10-4个细胞/孔以及欲培养24小时的细胞密度为2.2×10-4个细胞/孔。所有步骤在无菌条件下进行。
对染料上样，使用了下列材料2mM染料贮存液1mg Fluo-4(Molecular Probes)溶于443μl低水(low-water)DMSO(Sigma)(液体保存在-20℃)；20％普罗尼克酸(pluronic acid)溶液于37℃，将400mg普罗尼克酸(Sigma)溶于2ml低水DMSO(Sigma)(室温保存)；染料/普罗尼克酸混合液使用前，将等体积的染料贮存液与20％普罗尼克酸混合(染料与普罗尼克酸的终浓度分别为1mM和10％)；4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸，250mM贮存液710mg 4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸(Sigma)溶于5ml 1N NaOH，并与5ml补充了20mM HEPES的无酚红Hank’s BSS(Gibco)混合；上样缓冲液10.5ml补充了20mM HEPES的无酚红Hank’s BSS(Gibco)，105μl 4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸，210μl1M HEPES；洗涤缓冲液补充了20mM HEPES的无酚红Hank’s BSS(Gibco)和2.5mM 4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸。
2mM染料贮存液与等体积的20％(w/v)普罗尼克酸混合后，立即加至上样缓冲液中。在不破坏汇片细胞层的情况下，吸出生长培养基。每孔用Multidrop(Labsystems)分加100μl上样缓冲液。细胞于5％CO2，37℃培养箱培养30分钟。为计算背景荧光，一些孔不进行染料上样。染料上样后，用洗涤缓冲液洗细胞三次(自动的Denley细胞洗涤仪)，以使基础荧光降至背景之上20,000-50,000计数。加入100μl洗涤缓冲液，并于37℃培养至开始实验。
用补充了20mM HEPES(Gibco)和0.1％BSA(Sigma)的无酚红Hank’s BSS(Gibco)稀释被筛选化合物。按生产商(Molecular Devices)所述用FLIPR检测细胞内钙。建立的FLIPR参数为曝光0.4秒，滤波器1，50μl液体加入，移液器高度125μl，扩散速度40μl/秒无混合。

序列表<110>SOLVAY PHARMACEUTICALS B.V.<120>新人G-蛋白偶联受体<130>SPW99.04<140><141><160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1659<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(36)..(1559)<400>1gcctgcaacc tgtcycacgc cctctggctg ttgcc atg acg tcc acc tgc acc 53Met Thr Ser Thr Cys Thr1 5aac agc acg cgc gag agt aac agc agc cac acg tgc atg ccc ctc tcc101Asn Ser Thr Arg Glu Ser Asn Ser Ser His Thr Cys Met Pro Leu Ser10 15 20aaa atg ccc atc agc ctg gcc cac ggc atc atc cgc tca acc gtg ctg149Lys Met Pro Ile Ser Leu Ala His Gly Ile Ile Arg Ser Thr Val Leu25 30 35gtt atc ttc ctc gcc gcc tct ttc gtc ggc aac ata gtg ctg gcg cta197Val Ile Phe Leu Ala Ala Ser Phe Val Gly Asn Ile Val Leu Ala Leu40 45 50gtg ttg cag cgc aag ccg cag ctg ctg cag gtg acc aac cgt ttt atc245Val Leu Gln Arg Lys Pro Gln Leu Leu Gln Val Thr Asn Arg Phe Ile55 60 65 70ttt aac ctc ctc gtc acc gac ctg ctg cag att tcg ctc gtg gcc ccc293Phe Asn Leu Leu Val Thr Asp Leu Leu Gln Ile Ser Leu Val Ala Pro75 80 85tgg gtg gtg gcc acc tct gtg cct ctc ttc 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1.一种分离的多核苷酸，其包含选自如下的核苷酸序列a)核苷酸序列，其编码根据SEQ ID NO2的IGS1多肽；b)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽由DNA插入片段编码，所述插入片段包含在保藏号CBS 102049，保藏于荷兰的真菌菌种保藏中心的保藏物中，特别是对应于SEQ ID NO1的核苷酸序列；c)核苷酸序列，其全长至少有80％(优选地至少90％)的序列与(a)或(b)的核苷酸序列相同；d)核苷酸序列，其与(a)或(b)或(c)的核苷酸序列互补。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸含有包含于SEQ IDNO1的核苷酸序列，而SEQ ID NO1编码SEQ ID NO2之IGS1多肽。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸全长包含至少80％与SEQ ID NO1的核苷酸序列相同的核苷酸序列。
4.权利要求3的多核苷酸，其为SEQ ID NO1的多核苷酸。
5.权利要求1-4的多核苷酸，其为DNA或RNA。
6.一种杂交探针，其包含权利要求1的多核苷酸或其至少有5个核苷酸，并且优选地在30至50个核苷酸之间的片段。
7.DNA或RNA分子，其含有表达系统，其中当所述表达系统位于合适的宿主细胞中时，该表达系统可产生包含氨基酸序列的IGS1多肽，其与SEQ ID NO2之多肽具有至少80％的同一性。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7的表达系统。
9.根据权利要求8的宿主细胞，其为酵母细胞。
10.根据权利要求8的宿主细胞，其为动物细胞。
11.IGS1受体的膜制备物，其来自于根据权利要求8-10的细胞。
12.一种产生IGS1多肽的方法，其包括在足以产生该多肽的条件下培养权利要求8的宿主，并从培养物中回收多肽。
13.一种产生可产生IGS1多肽的细胞的方法，包括用权利要求7的表达系统转化或转染细胞，使得细胞在合适的培养条件下可产生IGS1多肽。
14.IGS1多肽，其包含的氨基酸序列全长至少80％与SEQ ID NO2的氨基酸序列相同。
15.权利要求14的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
16.一种抗体，其对权利要求14的IGS1多肽具有免疫特异性。
17.一种治疗受试者的方法，其中受试者需要增强权利要求14之IGS1多肽受体的活性或表达，包括(a)施与受试者治疗有效量的该受体之激动剂；和/或(b)提供受试者分离的多核苷酸，其中包含全长至少80％与编码SEQID NO2之IGS1多肽的核苷酸序列相同的核苷酸序列；或包含与所述核苷酸序列互补的、呈可以体内影响所述受体活性产生的形式的核苷酸序列。
18.一种治疗受试者的方法，其中受试者需要抑制权利要求14之IGS1多肽受体的活性或表达，包括(a)施与受试者治疗有效量的该受体之拮抗剂；和/或(b)向受试者施用多核苷酸，所述多核苷酸抑制编码该受体之核苷酸序列的表达；和/或(c)施与受试者治疗有效量的多肽，该多肽与所述受体竞争其配体。
19.一种诊断受试者疾病或疾病易感性的方法，所述疾病涉及受试者中权利要求14之IGS1多肽的表达或活性，包括(a)于所述受试者的基因组中，确定编码所述IGS1多肽之核苷酸序列中存在突变与否；和/或(b)对来自所述受试者的样本，分析IGS1多肽是否表达或其表达的量。
20.一种鉴定权利要求14的IGS1多肽之激动剂的方法，包括(a)将试验化合物与产生IGS1多肽的细胞接触；并且(b)测定试验化合物是否影响通过IGS1多肽活化而产生的信号。
21.一种通过权利要求20的方法而鉴定的激动剂。
22.鉴定权利要求14的IGS1多肽之拮抗剂的方法，包括(a)将激动剂与产生IGS1多肽的细胞接触；并且(b)在候选化合物存在时，测定由所述激动剂产生的信号是否消失。
23.一种通过权利要求22的方法而鉴定的拮抗剂。
24.一种表达IGS1多肽的重组宿主细胞或其膜，其通过权利要求13的方法而产生。
25.一种建立遗传修饰的非人动物之方法，其包括以下步骤a)将多核苷酸的编码部分与调节序列相连接，其中所述多核苷酸基本上由编码具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白质或其生物活性片段的核苷酸序列组成，其中所述调节序列可驱动高水平的基因表达或驱动正常情况下在所述动物中不表达的基因在一种细胞类型中表达。b)基因工程设计多核苷酸的编码部分，并将所述的序列重新导入所述动物的基因组中，以这种方式使内源基因之等位基因完全或部分失活，其中所述多核苷酸基本上由编码具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白质或其生物活性片段的核酸序列组成，所述内源基因之等位基因编码具SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白质或其生物活性片段。
全文摘要
本发明涉及新的已鉴定的多核苷酸、由它们编码的多肽以及此类多核苷酸和多肽的用途,并涉及它们的产生。更明确地,本发明的多核苷酸和多肽涉及G－蛋白偶联受体家族,称之为IGS1－家族。本发明也涉及对此类多核苷酸和多肽之作用的抑制或活化,涉及含有该多核苷酸的载体、含有该载体的宿主细胞以及转基因动物,其中IGS1基因为过度表达、错表达、表达不足或被抑制(敲除动物)。本发明进一步涉及筛选化合物的方法,其中所述化合物能作为该G－蛋白偶联受体家族IGS1的激动剂或拮抗剂,以及IGS1多肽和多核苷酸以及IGS1受体家族的激动剂或拮抗剂对精神病学的和CNS紊乱的治疗中的用途。
文档编号G01N33/53GK1371390SQ00808983
公开日2002年9月25日 申请日期2000年7月17日 优先权日1999年7月15日
发明者W·德里尔斯尼德尔, G·尼斯, 张帆 申请人:索尔瓦药物有限公司