脱氧－d－木酮糖磷酸生物合成途径的基因在改变类异戊二烯浓度中的应用的利记博彩app

专利名称：脱氧－d－木酮糖磷酸生物合成途径的基因在改变类异戊二烯浓度中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及来自于细菌或寄生虫的DNA序列(SEQ1，3，5，7)的应用，该基因编码gcpE或yfgB蛋白质，当将该基因掺入到病毒，真核细胞和原核细胞的基因组时所述的DNA序列改变类异戊二烯的含量，并且涉及测量类异戊二烯合成中gcpE基因的活性的方法。此外本发明还涉及鉴定在植物中具有除草剂，抗寄生虫，抗病毒，杀真菌的作用和在人和动物中具有抗真菌，抗寄生虫，抗病毒的作用的物质的方法。
已经知道借助于经典的乙酸/甲羟戊酸途径和一种可替代的甲羟戊酸-依赖性生物合成途径，脱氧-D-木酮糖磷酸途径形成类异戊二烯的生物合成途径(Rohmer，M.，Knani，M.，Simonin，p.，Sutter，B.和Sahm，H.(1993)生物化学杂志295517-524)。
在美国专利US5858367中描述了aarC-寡聚核苷酸在识别抗细菌物质中的应用。
令人惊奇的是，已经发现gcpE蛋白质在类异戊二烯生物合成的另一种代谢途径中还具有激酶功能和催化类异戊二烯生物合成的糖或前体的磷酸化作用，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖醇，2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸的磷酸化，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的磷酸化，2-C-甲基-D-赤藓糖，2-C-甲基-D-赤藓糖磷酸的磷酸化，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸，CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，
CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2OH，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-OH，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH＝CH-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(OH)CH3-CH＝CH-OH，CH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH3-C(CH3)＝CH-CH2-O-PO(OH)2，CH3-C(CH3)＝CH-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-OH的磷酸化。
因此本发明涉及来自于细菌或寄生虫的DNA序列的应用，所述DNA序列编码gcpE或yfgB的蛋白质[来自于细菌或来自寄生虫的gcpE或yfgB]或所述的DNA序列编码该蛋白质的类似物或衍生物，其中该蛋白质的一个或多个氨基酸被缺失，叠加或被其它氨基酸替代，并且基本上没有降低该多肽的酶促活性。特别是本发明涉及SEQ1，3，5，7的DNA序列的应用。列举的SEQ 1和5序列以及蛋白质2和6的起始来源是微生物大肠杆菌K12菌株。SEQ 3和7列举的序列以及蛋白质4和8的原始来源是微生物恶性疟原虫株3D7。
这样的DNA序列描述于US5858367并且也可以通过下面的国际互联网地址和登记号找到http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/protein.html AAD07695，AAD18517，AAC75568，AAC67648，AAC65433，P36979，CAA15530，CAA98356，CAA98355，AAC24056，AAC07467，P54482，P44667，P27434，P27433，BAA17717，BAA20919，BAA16402，S23058，AAB51469，1819264A，CAA45783，CAA45782，AAA21360，AAA21359，BAA02549，I39486，2113330A。
本发明的序列适用于在病毒、真核生物和原核生物中表达基因，他们负责1-脱氧-D-木酮糖途径的类异戊二烯的合成。
根据本发明真核生物或真核生物细胞包括动物细胞，植物细胞，藻类，酵母，真菌，而原核生物或原核生物细胞包括细菌，古细菌和真细菌。
当将DNA序列插入到定位了上面所述DNA序列的基因组时，上面所说的基因能够在病毒、真核生物和原核生物中表达。以本领域内技术人员已知的方式培养本发明转化的病毒、真核生物和原核生物并且分离在这样的培养期间形成的类异戊二烯，非强制性地进行纯化。不是所有的类异戊二烯都需要分离，在一些情况下，类异戊二烯可以直接释放到室温。
借助于下面的步骤可以进行所使用的转基因病毒、真核生物和原核生物的制备以便修饰类异戊二烯的含量a)生产具有下面亚序列的DNA序列i)在病毒、真核生物和原核生物中具有活性并且在预定的靶组织或靶细胞中确保形成RNA，ii)编码具有来自于细菌或寄生虫的gcpe或yfgB蛋白质的氨基酸序列的多肽或者该多肽的类似物或者衍生物的DNA序列，iii)导致将聚-A残基加到病毒、真核生物和原核生物的RNA的3’末端的未翻译的序列，
b)利用或不利用载体(例如质粒，病毒DNA)将该DNA序列转移到和掺入到病毒细胞，原核生物细胞或真核生物细胞的基因组。
从这种方式转化的植物细胞再生完整的整个植株。
给编码gcpE或yfgB蛋白质或者其类似物或者衍生物的序列提供确保在一定的器官或细胞中转录的启动子，该启动子以有义方向偶合(启动子的3’末端到编码序列的5’末端)到编码待形成的蛋白质的序列。将决定mRNA合成的终止的终止信号结合到编码序列的3’末端。以便指导将表达的蛋白质到一定的亚细胞室，例如叶绿体，淀粉体，线粒体，液泡，胞液或者细胞间隔，将编码所谓的信号序列或转移肽的其他的序列插入到启动子和该编码序列之间。该序列必须是在与该蛋白质的编码序列相同的阅读框架中。为了将本发明的DNA序列导入到高等植物中需要获得大量的克隆载体，所述的载体含有大肠杆菌中的复制信号和用以选择转化细胞的标记物。载体的例子是pBR322，pUC-系列，M13mp-系列，pACYC184，EMBL3等等。根据将需要的基因导入到植物中的方法，需要其他的DNA序列。例如如果将Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，必须插入Ti和Ri质粒T-DNA的至少一个右边界，但是通常是右边界和左边界，作为待导入基因的侧面区域。在欧洲专利120516；Hoekama在“双性植物载体系统”，Offset-drukkerij KantersB.V.Alblasserdam(1985)，第5章；Fraley等人，植物科学的关键和综述4，1-46和An等人(1985)EMBO J.4，277-287广泛地调查和描述的T-DNA在转化植物细胞中的应用。一旦将导入的DNA掺入到基因组，通常是稳定的并且还保留在原始转化的细胞的子代中。通常它含有选择性标记，该标记授予转化植物细胞对杀生剂或抗生素，例如卡那霉素，G418，bleomycin，潮霉素或磷苏菌素和其他的抗性。所使用的特定的标记物允许选择出失去插入的DNA的转化细胞。
许多技术可用于将DNA导入到植物。这些技术包括用农杆菌的辅助转化，原生质体的融合，DNA的微注射，电击穿，以及微弹轰击方法和病毒注射。然后将转化植物材料在合适的培养基上再生为完整植株，所述的培养基含有用于选择目的的抗生素或杀生剂。对于用于注射和电击穿的质粒没有特别的需求。但是，如果完整植株从这样的转化细胞再生，必须存在选择性标记物。以常规的方式在植物中生长转化细胞(McCormick等人(1986)，植物细胞报告5，81-84)。通常可以培养该植物并且与具有相同的转化基因组或其他基因组的植物进行杂交。获得的个体具有相应的表现型特性。
本发明还提供了表达载体，它含有一个或多个本发明的DNA序列。可以通过给本发明的DNA提供合适的功能调节信号获得这样的表达载体。这样的复制信号是负责表达的DNA序列，例如启动子，加强子，核糖体结合位点，并且由宿主生物体识别。
非强制性地其他的调节信号例如控制重组DNA在宿主生物体中复制或重组的，也可以是表达载体的组成部份。
用于表达本发明的酶的合适的宿主细胞和生物体是那些不包括具有DOXP合成酶功能的固有酶，DOXP还原异构酶或gcpE激酶的微生物。这样的例子是古细菌，动物，真菌，丝状毛霉和一些真细菌。这样的固有酶活性的缺失本质上促进了重组酶的检测和纯化。因此，也可能是利用各种化学品和药物第一次直接从宿主细胞的粗提物中检测到本发明的重组酶的活性和特别是活性的抑制。
如果想要获得多肽链的翻译后修饰和天然折叠本发明的酶优选地在真核细胞中表达。但是根据表达系统，当表达通过DNA拼接去除内含子的基因组DNA序列时，确保产生的酶的多肽序列对寄生虫具抗性。利用重组DNA技术，将编码内含子的序列去除或为了试验的目的将该序列插入到待表达的DNA序列。
利用本领域内技术人员已知的方法从宿主细胞或宿主细胞的上清液可以分离蛋白质。也可以需要酶的体外重新活化。
为了有助于纯化，以具有不同肽链的融合蛋白的形式表达本发明的酶活该酶的亚序列。寡聚一组氨酸序列和来源于谷胱甘肽S-转移酶，硫氧还蛋白或钙调素结合肽的序列特别适用于该目的。
进一步以具有本领域内技术人员已知的这样的肽链的融合蛋白的形式表达本发明的酶或该酶的亚序列，该重组酶被运输到细胞外或运输到宿主细胞的腔室。因此有助于该酶的思维活性的纯化和调查。
当表达本发明的酶时，证明修饰个体密码子是方便的。如果在寄生虫中使用的密码子不同于在异源表达系统中的密码子的使用，该编码序列中碱基的有目的替代是可取的，以便确保蛋白质的最佳合成。此外非翻译5’和3’区域的分别缺失经常可调节，例如如果存在DNA的3’序列的几个脱稳定的序列基序ATTTA。然后在真核生物中优选表达中应该缺失这些。碱基的缺失，叠加或替代时这类变异并且是本发明的主题。
进一步可以在标准条件下，采用本领域内技术人员已知的方法进行体外翻译获得本发明的酶。适用于本发明的目的的系统是兔子网织红血球和小麦胚提取物和细菌裂解液。也可以将体外转录的mRNA翻译到Xenopus卵子。
其序列来源于本发明的酶的肽序列的寡聚-和多肽的序列可以通过化学合成方法获得。如果合适选择该序列，这样的肽具有本发明特征的特性。这样的肽可以大量地产生并且特别适合于酶活性动力学，酶活性的调节，酶的三维空间结构，各种化学剂和药物对酶活性的抑制，各种配体的结合几何形状和结合亲和性的调查。
本发明也提供了用于测定gcpE蛋白质的酶促活性的方法。利用已知的方法可以测定所述的活性。通过测定糖或磷糖类或类异戊二烯生物合成的前体的磷酸化，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖醇，2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸的磷酸化，2-C-甲基-D-赤藓糖，2-C-甲基-D-赤藓糖磷酸的磷酸化，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖4-磷酸，CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2OH，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-OH，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH＝CH-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(OH)CH3-CH＝CH-OH，CH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH3-C(CH3)＝CH-CH2-O-PO(OH)2，CH3-C(CH3)＝CH-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-OH的磷酸化进行测定。本发明还提供了将该测定方法用于识别抑制特定的酶的活性的物质。
已经发现脱氧-1-木酮糖磷酸代谢途径也存在于许多寄生虫，病毒和真菌。
因此本发明还涉及用于筛选抑制脱氧-D-木酮糖磷酸代谢途径的化合物的方法。根据本发明，提供了含有重组表达载体的宿主生物体，其中载体包括至少SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQID NO5的寡聚核苷酸序列的一部分或其变异体或其同系物，和提供了被怀疑对人和动物具有抗微生物，抗寄生虫，抗细菌，抗病毒和抗真菌的作用或对植物具有抗微生物，抗病毒，杀菌剂，除草剂或杀真菌剂的作用的化合物。然后将宿主生物体与该化合物和待测定的化合物接触。
序列表<110>哈桑·朱马<120>脱氧-D-木酮糖磷酸生物合成途径的基因在改变异戊二烯类的浓度中的应用<130>15904<140><141><150>19923567.8<151>1999-05-21<150>19923568.6<151>1999-05-21<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1119<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400>1atg cat aac cag gct cca att caa cgt aga aaa tca aca cgt att tac 48Met His Asn Gln Ala Pro Ile Gln Arg Arg Lys Ser Thr Arg Ile Tyr1 5 10 15gtt ggg aat gtg ccg att ggc gat ggt gct ccc atc gcc gta cag tcc 96Val Gly Asn Val Pro Ile Gly Asp Gly Ala Pro Ile Ala Val Gln Ser20 25 30atg acc aat acg cgt acg aca gac gtc gaa gca acg gtc aat caa atc 144Met Thr Asn Thr Arg Thr Thr Asp Val Glu Ala Thr Val Asn Gln Ile35 40 45aag gcg ctg gaa cgc gtt ggc gct gat atc gtc cgt gta tcc gta ccg 192Lys Ala Leu Glu Arg Val Gly Ala Asp Ile Val Arg Val Ser Val Pro50 55 60acg atg gac gcg gca gaa gcg ttc aaa ctc atc aaa cag cag gtt aac 240Thr Met Asp Ala Ala Glu Ala Phe Lys Leu Ile Lys Gln Gln Val Asn65 70 75 80gtg ccg ctg gtg gct gac atc cac ttc gac tat cgc att gcg ctg aaa288Val Pro Leu Val 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权利要求
1.细菌或寄生虫的gcpE或yfgB基因的DNA序列用于掺入到病毒、真核生物和原核生物细胞的基因组中的应用。
2.DNA序列用于掺入到病毒、真核生物和原核生物细胞的基因组中的应用，所述DNA序列与细菌或寄生虫的gcpE或yfgB的蛋白质的DNA序列或来源于通过插入、缺失或替代的序列的其类似物或衍生物杂交，并且所述的DNA序列编码具有gcpE或yfgB基因的生物学活性的质体蛋白质。
3.根据权利要求1或2之一的DNA序列SEQ 1，3，5或7的应用。
4.根据权利要求1，2或3的应用，其特征在于将这些序列与控制元件连接，该原件确保在细胞中的转录和翻译的元件并且导致可翻译的mRNA的表达，引起gcpE或yfgB基因的合成。
5.植物细胞，其包括DNA序列，所述DNA序列与细菌或寄生虫的gcpE或yfgB基因的DNA序列或来源于通过插入、缺失或替代的序列的其类似物或衍生物杂交，并且所述的DNA序列编码具有gcpE或yfgB蛋白质的生物学活性的质体蛋白质。
6.转化的植物细胞和来自于所述的植物细胞的转基因植物，包括DNA序列或与细菌或寄生虫的gcpE或yfgB基因的DNA序列或来源于通过插入、缺失或替代的序列的其类似物或衍生物杂交的DNA序列，并且所述的DNA序列编码具有gcpE或yfgB蛋白质的生物学活性的质体蛋白质。
7.根据权利要求1-4任一项所述的应用，特别是用于增加病毒，真核生物或原核生物细胞中类异戊二烯的含量。
8.根据权利要求1-4任一项所述的应用，用于测定gcpE或yfgB蛋白质的酶促活性。
9.根据权利要求1-4任一项所述的应用，用于识别对gcpE蛋白质的酶促活性具有抑制作用的物质。
10.用于测定来自于细菌或寄生虫的gcpE蛋白质的酶促活性的方法，其特征在于缺失了类异戊二烯的生物合成的糖或磷糖或前体的磷酸化，特别是2-D-甲基-D-赤藓糖醇，2-C-甲基-D-磷酸赤藓糖醇，特别是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸的磷酸化，2-C-甲基-D-赤藓糖，2-C-D-赤藓糖磷酸，特别是2-C-甲基-赤藓糖-4-磷酸，CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(CH3)＝C(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(CH3)-CO-CH2OH，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CO-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(＝CH2)-C(OH)-CH2-OH，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-OH，CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH＝CH-O-PO(OH)2，CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH＝CH-OHCH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2，CH(OH)＝C(CH3)-CH(OH)-CH2-OHCH3-C(CH3)＝CH-CH2-O-PO(OH)2，CH3-C(CH3)＝CH-CH2-OH，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-O-PO(OH)2，CH2＝C(CH3)-CH2-CH2-OH的磷酸化。
11.筛选化合物的方法，该方法包括a)提供了含有重组表达载体的宿主细胞，其中载体包括编码来自于细菌或寄生虫的gcpE或yfgB蛋白质或该多肽的类似物或衍生物的DNA序列的至少一个片段，其中一个或多个氨基酸被缺失，叠加或被另一个氨基酸替代，并且基本上没有降低该多肽的酶促活性，而且提供了被怀疑对人和动物具有抗真菌、抗寄生虫，或抗病毒作用的化合物，b)将宿主细胞与该化合物接触和c)测定该化合物的抗真菌，抗寄生虫或抗病毒作用。
12.筛选化合物的方法，该方法包括a)提供了含有重组表达载体的宿主细胞，其中载体包括编码来自于细菌或寄生虫的gcpE或yfgB蛋白质或该多肽的类似物或衍生物的DNA序列的至少一个片段，其中多肽一个或多个氨基酸被缺失，叠加或被其它氨基酸替代，并且基本上没有降低该多肽的酶促活性，而且提供了被怀疑对植物具有抗病毒，抗寄生虫，杀真菌或除草剂作用的化合物，b)将宿主细胞与该化合物接触和c)测定该化合物的抗病毒，抗寄生虫，杀真菌或除草剂作用。
全文摘要
本发明涉及来自于细菌或寄生虫的命名为gcpE和yfgB基因的DNA序列用于掺入到病毒,真核细胞和原核细胞的基因组,从而改变类异戊二烯的浓度。本发明还涉及识别在植物中具有除草剂,抗寄生虫,抗病毒剂,杀真菌剂作用和在人体和动物中具有抗真菌,抗寄生虫,抗病毒剂作用的物质的方法。
文档编号G01NGK1351715SQ00807856
公开日2002年5月29日 申请日期2000年5月20日 优先权日1999年5月21日
发明者哈桑·朱马 申请人:朱马制药有限公司