专利名称：生物表面活性剂鼠李糖脂的提取工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及由微生物产生的生物表面活性剂的提取方法。
背景技术：
鼠李糖脂是由微生物产生的具有表面活性的两亲化合物，它与化学合成的表面活性剂相比，除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外，其表面活性和乳化能力更强，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、易生物降解等特性，是一种有利于环境保护的绿色产品。鼠李糖脂的分子结构类型多样，具有许多特殊的官能团，专一性强，可用于一些特殊领域。它在石油采收、环境修复、医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业方面极具潜在的应用价值。
然而，鼠李糖脂在微生物发酵液中的产量很低且发酵液成分复杂，其分离、提取和浓缩工艺不仅难度较大，还成为鼠李糖脂生产成本的主要部分，其费用约占生产总成本的60％～70％。因而选择合适的产物提取方法是保证生产工艺成功的一个重要环节。目前国内的提取工艺一般包括了离心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋转蒸发及硅胶柱层析等过程。对于大规模的生产来说，需要大量的氯仿做溶剂，在经济上是不合理的，而且氯仿是一种高毒性的有机氯化物，对人体和环境极具危害。生产的高成本和高毒性决定了鼠李糖脂大规模的生产和应用受到限制。
目前国内对生物表面活性剂鼠李糖脂的研究，专利技术涉及较多的是如何提高鼠李糖脂的产率及具体应用等。如微生物产生的生物表面活性剂可以增强油类提取，某单位研制了一种鼠李糖脂生物表面活性剂，和其它表面活性剂复配，用于三次采油，平均采收率比水提高20％(专利申请号99107581.1)。对于被油污染的海面或土壤，可加快油类的降解；还有用于对重金属污染的土壤和地下水的修复等。有人研究了鼠李糖脂对土壤中多环芳烃的增溶及脱附作用，还有人研究了鼠李糖脂的发酵生产，旨在提高鼠李糖脂的含量，更好地应用于生活垃圾堆肥处理中(专利申请号03118042.6)。然而，由于鼠李糖脂存在于微生物的发酵液中，而且含量很低，如CN1275429A公开的鼠李糖脂的最大产量仅为25g/L；另一研究者公开的发酵液中鼠李糖脂的含量为30g/L～40g/L，但发酵液中成分复杂，分离提取较纯的鼠李糖脂的工艺较为复杂，它的生产成本中有约为70-90％都要用在中下游提取及分离工艺上，因而，鼠李糖脂大规模的应用就受到限制。研究提取鼠李糖脂简单而有效的环保方法已引起不少学者的兴趣。
发明内容
本发明的目的是，针对现有技术存在的缺陷，提出一种生物表面活性剂鼠李糖脂的提取工艺，它能有效降低鼠李糖脂的生产成本、显著减少生产过程中对环境的危害，使其更好地投入实际应用中。
本发明的技术方案是，所述生物表面活性剂鼠李糖脂提取的工艺步骤为(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的发酵液，将该发酵液在温度为3.5℃-4.5℃条件下，以转速为7800rpm-8200rpm离心18-22min除去菌体后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸铵后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中静置11h-13h，然后离心去除蛋白类沉淀物，得上清液B；
(3)将上清液B用0℃-4℃的冰食盐水适当稀释去除蛋白类沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱静置，至残存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，将其轻轻刮去，得上清液C；(4)将上清液C的pH值调至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中静置11h-13h，然后(5)将所得液体在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm条件下离心25min-35min后，得淡黄色沉淀物，收集该沉淀物；(6)将收集到的淡黄色沉淀物进行冷冻干燥，即得到鼠李糖脂产品。
以下对本发明做出进一步说明。
上述步骤(1)至(3)为对原料鼠李糖脂发酵液的预处理，经过这三个步骤的预处理后，发酵液中的细菌、残油及蛋白类杂质都得到了去除。
上述步骤(6)中的冷冻干燥可采用如下操作过程①将产品(淡黄色沉淀物)放入宽口烧杯中，于低温冰箱(-30℃)中冷冻30分钟；②将冷冻干燥机冷冻井的温度调至-45℃；③将冻好的产品放在冷冻干燥机的托盘上，盖上有机玻璃罩并检查其气密性；④开动真空泵抽真空，干燥的时间为24～36小时。
做为本发明提取工艺所用原料的鼠李糖脂发酵液，可采用现有技术产品，或采用已有技术制备。例如，所述鼠李糖脂发酵液可由以下途径获得1、菌种的活化及保藏从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购得铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCAB93066，菌种经活化后转接保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上。培养基的成分见表1所示。斜面培养至菌体生长旺盛后(24～36h)，将试管口用牛皮纸塞包上，将斜面放入4℃的冰箱中保藏，保藏期为1～3个月，一般2个月传代一次。传代时先通过平板划线分离获得纯培养菌，再将其接种在传代斜面培养基上保存。
表1.传代斜面培养基的成分
2.鼠李糖脂发酵液的生产按下列表2所示培养基配方配制种子培养液，取80mL于500mL三角烧瓶中灭菌，从保存的斜面接种P.A-AB93066(铜绿假单胞菌)于三角烧瓶中培养24小时。培养条件温度37℃，pH值6.5，转速200转/分钟。
表2种子培养基
发酵培养基配方为粗制豆油100～120g/L，NaNO37.5～8.5g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，Na2HPO4.12H2O 0.5～1.5g/L，FeSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。按以上配方配置发酵培养液(不包括豆油)共1.8L，分别装入8个1000mL的三角瓶中，因油类须单独灭菌，所以豆油(须加15～20％的水)另分装在8根大试管中，三角瓶和试管先用纱布封口，再包一层牛皮纸，并用棉线扎紧；用报纸包10mL移液管2根；将上述的三角瓶、大试管和移液管在灭菌锅中灭菌，温度控制在120-125℃之间，灭菌时间为30分钟；用移液管从上述装有种子培养液的500mL三角瓶中分别吸取7mL种子培养基(培养24h)，接入8个灭完菌的发酵培养液中。接种在超净工作台上完成，培养条件37℃，pH值7.0，并以250转/分钟振荡培养，培养时间为96小时，即得到所述鼠李糖脂发酵液，其中鼠李糖脂含量不低于28g/L。
按上述工艺生产的鼠李糖脂产品，通过液-质联用对样品的分析表明，含有两种结构的鼠李糖脂，分子量分别为650和504，分别为二鼠李糖脂和单鼠李糖脂。
鼠李糖脂产品的测定将经过冷冻干燥的鼠李糖脂产品进行高效液相色谱—质谱联用鉴定。高效液相色谱起到分离样品的作用，为质谱分析做准备。样品的鉴定在湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室进行。具体的仪器及操作条件如下仪器名称美国Thermo Finngan公司生产的型号为LCO Advantage的LC/MS液质联用仪色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3柱(150mm×2.1mm×5μm)。进样量20μL，流动相为乙腈1％醋酸水溶液。在不同的洗脱时段，流动相的体积比不同。在0～15min内乙腈1％醋酸的体积比为50∶50，在16～23min内流动相的体积比为100∶0，在24～30min内流动相的体积比又为50∶50。流速均为0.3mL/min。柱温25℃，毛细管温度为300℃。
质谱条件电喷雾(ESI)源，负离子(NEG)检测。质谱扫描质量数范围300～1000m/z。
扫描结果见图1-图3。
对总质谱图的每个峰进行逐个分析，得到time＝13.54min和16.32min的两个峰的m/z符合鼠李糖脂的分子量规律，如图2、图3所示。在图2和图3中，被测物质的m/z分别为650和503.9，对应的分子量分别为650和504，分别为二鼠李糖脂和单鼠李糖脂的分子量。二鼠李糖脂和单鼠李糖脂的分子结构式如图4和图5所示。
由图1总质谱图的丰度可见，样品的主要成分为二鼠李糖脂和单鼠李糖脂，且纯度已很高，其中二鼠李糖脂约占60％。将提取后的鼠李糖脂进行称量，产量为28.3g/L，溶于水后其表面张力为29.48mN/m，临界胶束浓度CMC为25mg/L。
本发明的技术原理是，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)经过发酵培养后，产生了大量的鼠李糖脂，但发酵液中成分非常复杂，除鼠李糖脂外，还含有菌体、残余的培养基成分以及蛋白化合物和蛋白质乳化剂、中性脂、多糖等。由于鼠李糖脂在水溶液中呈酸性，只有当溶液的pH值大于5时才能完全溶解，因此可以用酸沉淀法提取鼠李糖脂。但发酵液中的蛋白类物质和残余的豆油对鼠李糖脂的沉淀会产生严重的干扰作用。原因有两个，第一，用酸沉淀法提取鼠李糖脂时，需将溶液的pH调至2.0以下，此时发酵液中的蛋白类物质达到等电点从而产生沉淀，而鼠李糖脂却不能有效的分离出来；第二，鼠李糖脂的表面活性使发酵液中的残余豆油稳定地分散于溶液中，与鼠李糖脂形成了稳定的乳状体系，从而妨碍鼠李糖脂的沉淀。本实验先通过离心除去菌体；利用硫酸铵能与蛋白类物质产生沉淀的原理，在上清液中加入适量的硫酸铵再离心从而除去蛋白类物质；加入冰盐水(NaCl溶液)使残存的豆油破乳凝聚于上清液表面，轻轻刮去残油。经过这三步预处理过程后，发酵液中的细菌、残油及蛋白类杂质都得到了去除。再将上清液的pH值调至2以下静置12小时，然后以8000r/min离心，收集沉淀；将收集到的淡黄色沉淀物进行冷冻干燥去除水份后就能得到鼠李糖脂产品。
由以上可知，本发明为一种生物表面活性剂鼠李糖脂的提取工艺，即酸沉淀-冷冻提取法。同现有技术相比，它所具有的积极效果是，所得鼠李糖脂的最终产量高达28g/L以上，生产成本较用离心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋转蒸发及硅胶柱层析等方法低一倍以上，而且本发明的生产过程没有采用任何有害物质，对人体和环境无危害，是一项低成本的绿色提取工艺，且操作工艺简单，值得大力推广。
图1是鼠李糖脂样品的总质谱图；图2是二鼠李糖脂的质谱图；图3是单鼠李糖脂的质谱图；图4是单鼠李糖脂的结构式；图5是二鼠李糖脂的结构式。
具体实施例方式
1.鼠李糖脂发酵液的制备1)将铜绿假单胞菌从斜面培养基接种至种子培养基中，进行摇瓶培养，500mL的三角烧瓶中装种子培养液80mL。培养条件温度37℃，时间24小时，转速200转/分钟。
2)在每个1L发酵罐中装入250mL以豆油为碳源的发酵培养基，接种铜绿假单胞菌种子培养液7mL，培养条件37℃，用HCl或NaOH控制pH值为7.0，并以250转/分钟振荡培养，培养时间为96小时。得到每个发酵罐的发酵培养液约230mL，将所有的发酵罐中的发酵液收集在一起。
注传代斜面培养基和种子培养基的配方见表1和表2所示，发酵培养基配方为粗制豆油120g/L，NaNO38.0g/L，KH2PO41.0g/L，Na2HPO4.12H2O 1.0g/L，FeSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。
2.鼠李糖脂发酵液的预处理取出培养96小时后的发酵液，将发酵液在转速为8000转/分钟、温度为4℃时离心20分钟除去菌体，离心后取上清液。上清液加入80mg/L的硫酸铵后放入4℃的冰箱中静置12小时，再离心去除蛋白类沉淀物。用适量的冰盐水(NaCl溶液)稀释已去除蛋白类沉淀物的上清液(浓度为10％的冰盐水的体积取发酵液体积的0.2倍)，放入4℃冰箱静置8小时，待残存的豆油破乳凝聚于上清液表面，轻轻刮去残油。经过这三步预处理过程后，发酵液中的细菌、残油及蛋白类杂质都得到了去除。
3.鼠李糖脂的提取将经过预处理后的上清液的pH值调至2.0以下，放入4℃的冰箱中静置12小时；再将发酵液在4℃和8000r/min的条件下离心30分钟并收集沉淀；将收集到的淡黄色沉淀物进行冷冻干燥，得到鼠李糖脂产品。
冷冻干燥的具体操作过程如下①将产品放入宽口烧杯中，于低温冰箱(-30℃)中冷冻30分钟；②将冷冻干燥机冷冻井的温度调至-45℃；③将冻好的产品放在冷冻干燥机的托盘上，盖上有机玻璃罩并检查其气密性；④开动真空泵抽真空，干燥的时间为24～36小时。
权利要求
1.一种生物表面活性剂鼠李糖脂的提取工艺，其特征在于，其工艺步骤为(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的发酵液，将该发酵液在温度为3.5℃-4.5℃条件下，以转速为7800rpm-8200rpm离心18-22min除去菌体后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸铵后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中静置11h-13h，然后离心去除蛋白类沉淀物，得上清液B；(3)将上清液B用0℃-4℃的冰食盐水适当稀释去除蛋白类沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱静置，至残存的油脂乳凝聚于上清液表面后，将其轻轻刮去，得上清液C；(4)将上清液C的pH值调至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中静置11h-13h，然后(5)将所得液体在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm条件下离心25min-35min后，得淡黄色沉淀物，收集该沉淀物；(6)将收集到的淡黄色沉淀物进行冷冻干燥，即得到鼠李糖脂产品。
全文摘要
本发明为生物表面活性剂鼠李糖脂的提取工艺。其步骤为将鼠李糖脂发酵液在约4℃时以转速约8000rpm离心除去菌体后，按60mg/L－120mg/L的量加入硫酸铵，放入约4℃的冰箱中静置约10h，离心去除蛋白类沉淀物；用冰食盐水适当稀释去除蛋白类沉淀物后的上清液，放入约4℃冰箱静置，至残存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，将其轻轻刮去；将溶液pH值调至2以下，放入约4℃的冰箱中静置约10h；在约4℃和8000rpm条件下离心约30min后，将收集到的淡黄色沉淀物进行冷冻干燥，即得到鼠李糖脂产品。本提取工艺具有生产成本低、对环境无危害的特点，且提取率高。
文档编号E21B43/16GK1974589SQ200610136880
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者施周, 马满英, 吴星杰 申请人:湖南大学