一种线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料及其制备方法和应用，该材料结构式为MnOSiO2(FITC)-PPh3+，该磁性纳米材料以MnO纳米粒子为核，SiO2为壳层，并在壳层表面修饰FITC荧光标记分子和三苯基膦线粒体靶向阳离子。该材料对细胞中线粒体靶向效果显著，为深入研究线粒体提供很好的基础。本发明操作简单，得到的纳米颗粒分散性和稳定性好，可用作荧光标记和线粒体靶向生物应用，对环境友好。
【专利说明】一种线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学材料领域，特别涉及一种以MnO纳米粒子为核，以二氧化硅为壳，并在壳表面修饰线粒体靶向分子和荧光分子的核壳结构磁性纳米材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]MnO作为一种优秀的T1造影剂，已经被广大研究者运用到磁共振成像领域，其特征是在活体组织器官中的成像清晰，而要想控制T1弛豫率，必须在表面修饰控制其与外界接触的包覆物。其中二氧化硅作为一种既可以改善水溶性又可以提高材料生物相容性的优良包覆物得到很多的应用，通过调控二氧化硅的厚度，就可以控制其弛豫率，延长弛豫时间。
[0003]线粒体作为生物细胞中的能量供应站是细胞生存的关键，人们对于线粒体的研究从未停止过，包括与线粒体有关的疾病，如线粒体肌病和线粒体脑肌病。亲脂性阳离子带有正电荷，因而可以在线粒体基质中积累(Rottenberg, 1979,Methods Enzymol, 55, 547-560 ；Chen, 1988, Annu Rev Cell B1l, 4, 155-181) ?因此具备线粒体靶向的分子应该是亲脂性的并且带有大量正电荷。
[0004]荧光标记是医学生物成像较为普遍的方法，荧光分子需具备在适当的光照下能够激发出荧光，荧光标记可用于示踪定位，动态观察，蛋白质的标记，抗体的标记等。
[0005]本专利中涉及的纳米粒子核心为MnO，因此具备磁共振成像的功能；包覆二氧化硅后使其生物相容性增加；2_羧乙基三苯基溴化磷作为亲脂性分子并具备大量正电荷，因此可以作为线粒体靶向分子；异硫氰酸荧光素异构体经激发能发出绿光，修饰后也可使材料发出绿光。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种以MnO纳米粒子为核，以二氧化硅为壳，并在壳层表面修饰线粒体靶向分子和荧光分子的磁性纳米材料，该磁性纳米材料的粒径均一、分散性及水溶性好、具备靶向功能与发光性能。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种制备上述双功能核壳结构磁性纳米材料的方法，该工艺反应温和、操作简单快速。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0009]一种线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料，其特征在于:结构式为MnOOS12 (FITC)-PPh3+,该磁性纳米材料以MnO纳米粒子为核，S12为壳层，并在壳层表面修饰FITC荧光标记分子和三苯基膦线粒体靶向阳离子。
[0010]上述线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的制备方法步骤包括:
[0011]⑷制备MnO纳米粒子,用二氧化娃包覆的MnO纳米粒子并氨基化,用乙醇配成l-2mg/mL的溶液；
[0012](B)取步骤㈧所得纳米粒子用无水N，N_ 二甲基甲酰胺洗涤3-4次后用无水N, N- 二甲基甲酰胺配成0.67-lmg/mL的溶液；
[0013](C)取无水N，N- 二甲基甲酰胺和2-羧乙基三苯基溴化磷按照3-4mL:8mg的比例混合均勻；
[0014](D)向步骤(C)所得混合液中加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌条件下室温反应30-40min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺反应30_40min ；
[0015](E)步骤⑶所得混合液与步骤⑶所配溶液混合，再加入异硫氰酸荧光异构体
1.95%，搅拌均匀；
[0016](F)将混合液密闭，避光条件下通入氮气排除空气，氮气保护下用锡箔纸进行避光处理，室温下反应10-12小时后用乙醇洗涤3-4次。
[0017]所述步骤(A)中MnOOS12-NH2纳米粒子、步骤(C)中2_羧乙基三苯基溴化磷及步骤(E)中异硫氰酸荧光素异构体1.95%的质量比为1:4-5:0.5-0.6，优选1:4:0.5。
[0018]本发明中使用油酸猛前驱体制备MnO纳米粒子，按照方法(Hyeon等人,2007,Angew.Chem.1nt.Ed., 46, 5397-5401 ；Tremel 等人,2009, Chem.Mater, 21, 3183-3190)。
[0019]上述方法制备的线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料具有双功能，可用作生物荧光标记物和细胞中线粒体的靶向材料。
[0020]本发明通过包覆二氧化硅使得纳米粒子很好地分散在水中，并一步法修饰线粒体靶向分子和荧光分子，制备了 MnO纳米粒子，并在表面包覆二氧化硅，使得纳米粒子具有较好水溶性和生物相容性的同时，其表面带有大量的氨基，再通过2-羧乙基三苯基溴化磷和异硫氰酸荧光素异构体(FITC)与氨基作用连接到纳米粒子表面，使其具有很好的发光性能和线粒体祀向功能，从而实现合成的磁性纳米材料突光和线粒体祀向双功能的目的。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:1、所得磁性纳米材料为核壳结构，表面包覆有二氧化硅，生物相容性大大增强。2、所得磁性纳米材料经过488激光激发后、发射光谱在521纳米处发出绿光，具有很好的荧光效能，可作为生物荧光标记物应用。3、所得磁性纳米材料修饰了线粒体靶向分子，可以对细胞中线粒体产生较好的靶向效果。4、所得磁性纳米材料的原材料易得、且价格低廉，工艺简单、反应温和。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是MnO纳米粒子的透射电子显微镜图。
[0023]图2是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的透射电子显微镜图
[0024]图3是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的XRD图谱。
[0025]图4是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的红外线图谱。
[0026]图5是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的紫外吸收光谱图。
[0027]图6是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的荧光光谱图。
[0028]图7是线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的在HeLa细胞中的内吞流式细胞图谱。
[0029]图8为线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料对线粒体靶向效果的共聚焦图片。
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例，对本发明作进一步说明:
[0031]实施例1
[0032]在10mL三颈烧瓶中加入20mLl_十八烯，再2mLlmmol/mL油酸锰搅拌均匀；在冷凝管上方插充有氮气的气球，连续通四个气球排空气，最后插入一个气球，升温至110°c除水30min,快速升温至280°C,保持lh。冷却至室温后用乙醇洗漆三次,用环己烧保存,定量后配得终浓度为2mg/mL。得到的MnO纳米粒子的油溶性TEM图片如图1所示，MnO纳米粒子的粒径约为15.6nm,分散性较好；干燥后得到的XRD图谱如图3所示，与MnO标准卡片07-0230对比后证明是MnO ;红外图谱如4所示，图中1636cm—1为MnO纳米粒子表面的油酸中C = C伸缩振动峰，610、50901^为MnO纳米粒子中锰氧键的伸缩振动峰，2920,2851(^1为MnO表面油酸中C-H伸缩振动峰。
[0033]实施例2
[0034]取2mL制备好的环己烷分散的MnO纳米粒子，加入到盛有60mL环己烷的250mL三颈烧瓶中，使用磁力搅拌均勻；在搅拌条件下加入3mLlgepal C0-520,搅拌30min ;逐滴加入质量浓度25?28%的浓氨水300 μ L至溶液澄清，搅拌30min ;采用注射泵匀速加入200 μ L正硅酸四乙酯(TEOS)，常温条件下反应12h后加入50 μ L3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，继续反应12h ;取适量丙酮加入到反应体系中，出现浑浊后停止搅拌，用乙醇洗涤三次，定量后用乙醇配成2mg/mL的溶液。干燥后得到的XRD图谱如图3所示，在22-28°处出现了二氧化硅的无定形态特征衍射峰，MnO的衍射峰在包硅之后没有发现变化，说明实验中修饰二氧化硅成功。在红外图谱如4所示，包覆二氧化硅之后，Mn-O键的伸缩振动峰减弱，表面油酸中C-H伸缩振动峰减弱，在1081 CnT1处出现S 1-O-Si的不对称伸缩振动峰，在471、798CHT1处出现二氧化硅的S1-O变形振动特征峰。修饰氨基后在1568CHT1处出现氨N-H的弯曲振动峰。
[0035]实施例3
[0036]取氨基化的二氧化硅包覆的MnO纳米粒子10mg，用无水N，N- 二甲基甲酰胺洗涤3次后用15mL溶解待用；取一只10mL单口烧瓶加入15mL无水N，N-二甲基甲酰胺，称取40mg2-羧乙基三苯基溴化磷加入单口烧瓶中，磁力搅拌均勻；称取50mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐加入烧瓶中，搅拌条件下室温充分反应40min，再加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺，反应40min。将15mL分散有纳米粒子的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到单口烧瓶中，称取5mg异硫氰酸荧光异构体1.95%加入到反应体系中，搅拌均匀；插入两个气球通氮气排除空气，最后再插一个氮气球起保护作用，并用锡箔纸进行避光处理。反应12小时过程中注意避光，用乙醇洗涤3次。终产物的--Μ图片如图2所示，其粒径约为46.2nm，呈现出分散性较好。干燥后红外图谱如4所示，可见在修饰2-羧乙基三苯基溴化磷后，在1636CHT1处峰增强，为酰胺键的特征峰，在MnOOS12-PPh3+的红外图谱中1568cm-1处氨基的峰减弱，一步法制备FITC和2-羧乙基三苯基溴化磷之后MnOOS12 (FITC) -PPh3+的红外图谱中氨基峰基本消失。将双功能磁性纳米粒子分散在水中后测得紫外图谱如图5所示，修饰FITC之后在449和487nm处出现了 FITC的特征吸收峰；荧光光谱图如图6所示，可以看到修饰FITC后在521nm处出现了 FITC的荧光特征发射峰。说明了 FITC修饰成功。
[0037]实施例4
[0038]将荧光标记的具备线粒体靶向功能的磁性纳米粒子MnOOS12 (FITC) -PPh3+用RPM1-1640配成浓度为0，25，50，100 μ g/mL的样品，加入事先铺好HeLa细胞的6孔板中，其中每孔细胞数目为2 X 16个，共孵育4h后用PBS润洗一次，消化离心收集并用细胞培养液分散均匀后在流式细胞仪上上样分析。实验结果如图7，随着纳米粒子浓度的增加，纳米粒子在HeLa中的表达量逐渐增加，在纳米粒子浓度为100 μ g/mL时最高可达66.8%。表明该材料具备生物标记功能。
[0039]实施例5
[0040]将准备好的HeLa细胞用胰酶消化后，离心收集铺于共聚焦培养品中，孵育过夜后加入100 μ g/mL的MnOOS12 (FITC) -PPh3+纳米粒子，孵育4h后加入线粒体活体染料MitoTracker Red CMXRos，在避光条件下孵育15min之后用4 %多聚甲醛固定细胞，再加入台盼蓝染液对细胞外部荧光材料进行荧光淬灭，使用激光共聚焦进行观察。MnOOS12(FITC)-PPh3+纳米粒子使用的激发波长为488nm，接收波长为510_540nm，MitoTrackerRed CMXRos使用的激发波长为543nm，接收波长为600_630nm。结果如图8所示，图8a明场中黑色灰色部分为细胞核，其被台盼蓝染成深色。图8b红色部分为线粒体被MitoTrackerRed CMXRos染成红色，图8c绿色部分为MnOOS12 (FITC) -PPh3+所发出的荧光，图8d叠加图中黄橙色光为纳米粒子对线粒体靶向后产生的红光和绿光叠加而产生的，说明材料对细胞中线粒体存在明显的靶向效果。
[0041]上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料，其特征在于:结构式为MnOOS12 (FITC)-PPh3+,该磁性纳米材料以MnO纳米粒子为核，S12为壳层，并在壳层表面修饰FITC荧光标记分子和三苯基膦线粒体靶向阳离子。
2.权利要求1所述的线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤包括: (A)制备MnO纳米粒子,用二氧化娃包覆MnO纳米粒子并氨基化,用乙醇配成l_2mg/mL的溶液； (B)取步骤(A)所得纳米粒子用无水N，N-二甲基甲酰胺洗涤3-4次后用无水N，N- 二甲基甲酰胺配成0.67-lmg/mL的溶液； (C)取无水N，N-二甲基甲酰胺和2-羧乙基三苯基溴化磷按照3-4mL:8mg的比例混合均匀； (D)向步骤(C)所得混合液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌条件下室温反应30-40min,再加入N-轻基琥拍酰亚胺反应30_40min ； (E)步骤⑶所得混合液与步骤⑶所配溶液混合，再加入异硫氰酸荧光异构体1.95%，搅拌均匀； (F)将混合液密闭，避光条件下通入氮气排除空气，氮气保护下用锡箔纸进行避光处理，室温下反应10-12小时后用乙醇洗涤3-4次。
3.根据权利要求2所述的线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(A)中MnOliS12-NH2纳米粒子、步骤(C)中2-羧乙基三苯基溴化磷及步骤(E)中异硫氰酸荧光素异构体1.95%的质量比为1:4-5:0.5-0.6。
4.根据权利要求2所述的线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(D)中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:2-2.5。
5.权利要求1所述的线粒体祀向突光标记磁性纳米材料用作线粒体祀向材料。
6.权利要求1所述的线粒体靶向荧光标记磁性纳米材料用作生物荧光标记物。
【文档编号】B82Y5/00GK104237503SQ201410441487
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】周治国, 于超, 王俊, 魏杰, 陶珊珊, 杨仕平 申请人:上海师范大学