一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，该方法是以硝酸锌和磷酸氢二铵为反应物，控制反应温度在0-25℃下，通过化学共沉淀法制得羟基磷酸锌纳米空心球。与现有技术相比，本发明具有工艺简单、成本低、毒性低、载药量大、进入细胞迅速、控制药物缓释等优点。
【专利说明】一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及无机空心纳米材料的合成领域，更具体地讲，涉及一种新型的作为药物载体的纳米级空心结构的无机材料。
【背景技术】
[0002]空心纳米颗粒因其具有良好的形貌、较低的密度、较大的比表面积以及广阔的应用前景在近十年来得到了极大的关注。与实心颗粒相比，空心结构有着更多突出的化学和物理特性。在众多空心颗粒中，无机空心纳米颗粒拥有光、电、磁、电化学以及催化等方面的特性，这表面了无机空心纳米颗粒与有机空心纳米颗粒相比是一种更为常见，更加多样化，更为丰富多变的一类材料。因此最几年对于具有大空腔的无机空心颗粒有着极多的研究，证明了其在催化，药物输送及医药成像等方面有广泛的应用。
[0003]在合成无机纳米空心材料方法上，模板合成法是最为常见的。模板合成法是通过修饰模板剂，使其具有诱导无机前体(盐或者醇盐)积聚在表面的能力；接着以模板为核形成无机壳后，模板必须利用某种方式加以去除，最后得到空心结构的颗粒。模板法可以分为硬模板法和软模板法两种。硬模板法是指利用刚性分子作为模板剂的合成方法。硬模板法的特点是最终产物的形状和大小都基本上取决于模板。许多化合物如聚合物、无机非金属、金属颗粒都可作为硬模板来使用。在制备空心颗粒过程中有三步是必不可缺的:1.对模板进行表面修饰/功能化以获取所需要的表面性能；2.利用不同方法和作用力在模板表面覆盖上无机壳或者无机前驱体；3.选择性地去除模板最终得到空心球(通过选择性溶解或者焙烧)。硬模板法的优势在于能够保证产物的形貌及尺寸的均一性，也能够运用于合成各种各样的无机空心材料。然而其不足也十分明显:其合成过程耗时且复杂、移除模板时能耗也很大以及移除模板时还有空心结构塌缩的风险存在。相对于硬模板法而言最大的优势在与其模板容易被移除。能作为软模板使用的不仅限于乳滴液，表面活性剂，或者其他超分子微粒，也包括高分子聚集体以及气泡。与硬模板法相比，软模板法不仅可以通过温和的条件和方法移除模板，而且作为模板使用的液滴等能够简单又有效地将具有治疗作用或者生物活性的物质引入产物的空腔内部。然而尽管在控制产物尺寸、均一性以及微结构方面已经有了较大的进步，在面对上述问题时，利用软模板法合成空心产物依旧难以完全克服。这也要归因于软模板的特性。对于生物医用材料而言，模板法工艺复杂，材料性能可控性难度大，制造成本高，不利于企业规模化生产；另一方面，模扳剂会带来潜在的生物安全性。因此，工艺简单、条件温和、绿色合成的非模板法制备无机纳米空心球倍受欢迎。
[0004]无机空心球制备的另一个重要进展是可以利用非模板的策略来合成无机纳米空心颗粒，即奥斯瓦尔德熟化过程(Ostwald ripening process),这种方法不仅结合了软/硬模板法的优势，同时也避免了软、硬模板法如模板移除困难(针对硬模板)，形貌无法很好地得到控制(针对软模板)等不足。最基础的由内向外的奥斯瓦尔德熟化机制(inside-outOsMald ripening process)有着如下的基本原理；即较大的晶体都是通过吸收溶解性较好的较小晶体来进行生长的。在一个胶态聚集体中，更小、结晶性更差、更为疏松的微晶会逐渐溶入液相中，并成为更大、结晶性更好、更为致密的微晶生长的“营养”来源。在晶体生长的过程中，因为纳米晶体的尺寸差异，晶体生长基元的浓度在母液中是各不相同的。受到表面能最小化的驱使，亚稳态的纳米颗粒因溶液过饱和度的减少而产生聚集。一旦不同尺寸的颗粒聚集在一起，较大的颗粒就会逐渐吸收较小的颗粒进一步生长，并在大的聚集体中间形成空腔，而腔体的壳厚也因为中间空腔的溶质向外扩散而不断增加。以奥斯瓦尔德熟化机制为基础的非模板法能够同时很好的解决了硬模板法中需要移除模板的问题以及软模板法产物形貌尺寸不一的问题。然而，此种特殊的效应只出现在某些特殊的化合物中，没有足够丰富的基础凭证能够进一步支持这种机理 。
[0005]无机空心颗粒最有吸引力的地方即体现在其广泛的应用上。利用其良好的形貌、超大的比表面积、低密度以及其在光、电、磁等方面的特性，无机空心颗粒在催化、锂电池、生物医药以及气体探测等领域都有重要的应用。当作为生物医药材料时，成分简单、性能可控、生物安全性好的无机空心颗粒最大的用途就是作为药载体来装载和输送药物，并控制药物在细胞和体内的释放。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，其特征在于，该方法是以硝酸锌和磷酸氢二铵为反应物，控制反应温度在0-25 °C下，通过化学共沉淀法制得羟基磷酸锌纳米空心球。
[0008]所述的化学共沉淀法具体为:将硝酸锌配制成33.4mM的溶液，加入1.0wt%的三羟甲基乙烷，调节反应温度为0-25°C，待三羟甲基乙烷溶解完全溶解后，缓慢加入与硝酸锌等体积的磷酸氢二铵溶液，采用氨水调节反应液的PH值维持在8-9，反应24h，以保证晶体生长完全，再陈化12h以上以提高沉淀的均一性和结晶性，最后产物通过离心洗涤除去多余三羟甲基乙烷至中性后，进行冷冻干燥以便进行下一阶段表征。
[0009]所述的硝酸锌和磷酸氢二铵的反应摩尔比按Zn:P为1.67:1。
[0010]所述的化学共沉淀法反应过程中通过氨水调节反应液pH值维持在8-9。
[0011]所述的羟基磷酸锌纳米空心球作为抗癌药物阿霉素的载体时的载药量> 16wt%。
[0012]与现有技术相比，本发明的积极效果在于:1.在合成制备方面，采用非模板法、低温制备空腔结构的纳米羟基磷酸锌具备合成工艺及后处理简单、成本低和可以规模化生产的特点'2.在生物医学应用方面，具备毒性低、载药量大、进入细胞迅速、控制药物缓释的特征，纳米载药领域有着潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1.不同温度下(0，20，35，50，65，80和95°〇)合成产物的XRD衍射图谱；
[0014]图2.不同温度下(0，20，35和50°C )合成产物的FTIR吸收图谱；
[0015]图3.不同温度下合成产物的SEM照片(a)O; (b) 20; (c)35; (d)50°C ;
[0016]图4.不同温度下合成产物的TGM照片(a)O; (b) 20; (c)35; (d)50°C ;
[0017]图5.在O及20°C下合成产物的氮气吸脱附等温线；[0018]图6.根据O及20°C下合成产物的氮气脱附等温线计算得到的不同微分孔容与孔径分布的关系图；
[0019]图7.不同温度合成的样品以不同浓度(lOJOyg/mL)与NIH/3T3共同培养24、48小时后的相对细胞活性数据图；以未加入任何样品培养的NIH/3T3细胞作为空白对照；[0020]图8.不同温度下合成的空心球样品(O和20°C )的蛋白吸附曲线；实验中研究的蛋白质为牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶蛋白(LSZ);
[0021]图9.不同温度下(O，20和50°C )合成所得纳米颗粒的阿霉素载药量；
[0022]图10.(a)装载阿霉素之后的样品(合成温度为20°C )TEM照片；(b)a图中区域I和区域2对应的能量色散X射线光谱；
[0023]图11.Hela细胞与装载阿霉素的样品(合成温度为0°C )在37°C下共同培养一系列时间后的激光共聚焦显微镜照片；细胞核使用Hoechst33342染色剂处理；
[0024]图12.Hela细胞与装载阿霉素的样品(合成温度为20°C )在37°C下共同培养一系列时间后的激光共聚焦显微镜照片；细胞核使用Hoechst33342染色剂处理；
[0025]图13.Hela细胞与阿霉素在37°C下共同培养一系列时间后的激光共聚焦显微镜照片；细胞核使用Hoechst33342染核剂处理。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明做详细说明，但是实例的作用仅是解释而非限定本发明。
[0027]一、实验材料和设备。
[0028]1、实验材料:
[0029]六水合硝酸锌(Zn(NO3) 2.6Η20，AR)及磷酸氢二铵((NH4) 2ΗΡ04，AR)购买于国药集团化学试剂有限公司。浓氨水(含量(以MHJ+)25%_28%，AR)购买于上海联试有限公司。1，I, 1-三轻甲基乙烧(1,1, 1-Tris (hydroxymethyl) ethane (TME), 97%)购买于 Alfa Aesar。95%乙醇(CH3CH2OH, AR)购买于常熟市杨园化工有限公司。阿霉素盐酸盐(Doxorubicinhydrochloride (D0X.HCl)，AR)购买于北京华丰联合科技公司。氢化钙(CaH2, AR)，购买于中国医药集团上海化学试剂公司。二甲亚砜(C2H6SO, Dimethyl sulfoxide (DMSO), AR)购买于国药集团化学试剂有限公司，以氢化钙(CaH2)干燥并减压蒸馏后使用。超纯水(P> 18ΜΩ)，美国 Pall 公司 Mill1-Q 纯水机制得。3-(4，5-dimethyl-thiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazoIium bromide (MTT试剂)、DMEM干粉培养基(高糖)、非必需氨基酸、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶，0.0296EDTA消化液，胎牛血清(FBS)，磷酸盐缓冲液(PBS)购买于Sigma公司。
[0030]2、主要设备:
[0031]X射线衍射仪采用德国Bruker公司的D8advance diffractometer,福射源为Cr靶。使用德国Bruker公司的EQUIN0X55型傅立叶变换红外光谱仪测定FTIR光谱，样品扫描范围4000到400CHT1，扫描模式为透射谱。电镜形貌分析采用FEI Siron200 (20kV,
1.0nm)场发射扫描电子显微镜(美国FEI公司)，以及JEM-2010HT (200kV)透射电子显微镜(日本电子株式会社)。使用ASAP2010 M+C(美国Micromeritics公司)，以Brunauer-Emmett-Teller (BET)模型分析样品比表面积，通过脱附等温线以Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方程得出孔结构数据。电感I禹合等离子体发射光谱仪采用美国 Thermo 公司的 Scientific iCAP6300 ICP Spectrometer,用于样品中的兀素锋(Zn)和磷(P)含量的定量分析。
[0032]二、实验方法
[0033]1.羟基磷酸锌纳米空心球的制备
[0034]利用简单的化学沉淀法合成羟基磷酸锌纳米空心球，在整个实验过程中溶剂都采用了超纯水。选用Zn (NO3) 2.6H20及(NH4) 2ΗΡ04为反应原料分别作为Zn2+及PO/—的供应源。具体反应步骤如下:在33.4mM Zn (NO3)2.6Η20溶液中加入1.0wt%三羟甲基乙烷(TME)后，加热温度分别设置为0°C，20°C，35°C，50°C，65 V，80°C，95°C。待TME完全溶解后，缓慢滴入与Zn(NO3)2.6H20溶液等体积的20.0mM(NH4)2HPO4溶液，这样就保证了 Zn/P的投料摩尔比为1.67。反应的pH值使用浓氨水(含MH3量25-28%)进行调控。整个反应过程持续24h以保证晶体生长完全，再陈化12h以上以提高沉淀的均一性和结晶性。最后产物通过离心洗涤除去多余TME至中性后，进行冷冻干燥以便进行下一阶段表征。
[0035]2、细胞培养
[0036]3T3细胞系培养在有10%胎牛血清的DMEM培养液(含200u/mL青霉素、链霉素)中。复苏的细胞按常规培 养操作置于37°C、5% CO2 (相对湿度95%)培养箱中培养，约2至3天更换一次培养液。
[0037]3、材料体外毒性检测
[0038]实验分组:分为实验组及空白对照组。实验组为加入在0，20，35及50°C下合成样品的细胞，空白对照组即为无添加材料培养的细胞。纳米颗粒在培养液中的浓度分别选取为:10和50 μ g/mL。传代48小时的小鼠成纤维细胞株NIH/3T3细胞生长铺满培养瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为4X104个/mL。以每孔8000个细胞/200 μ L DMEM培养基接种于96孔培养板中。37°C、5% CO2培养箱中培养24小时，观察细胞贴壁且密度适中后使用。0，20，35及50°C下合成样品以紫外灯辐照进行灭菌处理后，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline/PBS)为溶剂配置 0°C, 20°C, 35°C及 50°C下合成样品悬浊液，浓度分别为50和250 μ g/mL。超声分散均匀后，以每孔50 μ L的量加入96孔板中，每个样品每个浓度设置5个复孔，这样便得到了分别为10和50 μ g/mL不同样品的培养终浓度。在37°C、5% CO2培养箱中分别培养24、48小时后，吸出96孔板中的培养基及样品溶液，用PBS小心清洗两次后，加入200 μ L每孔DNEM培养液，再每孔加入5mg/mL的MTT液20 μ L (用PBS配制)，继续培养4小时。培养完成吸出MTT溶液后，加入200 μ L每孔的二甲亚砜(DMSO)震10分钟以溶解产生的蓝紫色结晶。选择490nm波长，在酶标仪上检测各孔的光密度值(Optical density, 0D)，以不加细胞只加培养液的为空白对照，记录OD值。OD值越高，说明NIH/3T3细胞的增殖越强。每次实验重复3次，取平均值。根据以下公式计算细胞存活率:
[0039]细胞存活率=实验组OD值/空白组OD值X 100%
[0040]4、材料的蛋白吸附特性
[0041]根据比表面积的测定结果，一定量的羟基磷酸锌(总比表面积为1.0m2)与不同浓度的蛋白溶液(从O到lmg/cm3)共混后在室温下搅拌24小时之后,将悬浮液在10, OOOrpm转速下离心10分钟，并收集离心后的上清液。上清液中蛋白质的浓度由紫外分光光度计在280nm下测得的吸光度值，以及相对应的蛋白标准曲线计算得出。通过实验前后溶液浓度的变化可得出羟基磷酸锌的蛋白吸附量。
[0042]5、材料的载药特性
[0043]将Img DOX -HCl溶解于5mL超纯水中，再将5mg样品(分别为O，20及50°C样品)加入该溶液，于室温下搅拌24h后，将沉淀离心洗涤并收集第一次离心后的上清液，待完全去除游离的阿霉素冷冻干燥后即得到装载阿霉素的样品。采用了紫外吸收进行载药量的测定。配置浓度分别为5，10，25，50，75，100，150，200mg/mL的DOX.HCl溶液进行阿霉素紫外吸收测试，得到阿霉素的紫外吸收标准曲线。根据标准曲线计算得到溶液中剩余游离阿霉素的浓度C1,已知初始的阿霉素浓度为Ctl，溶液体积为V，载药样品质量为m，则样品的载药量可以通过以下公式计算得出:
[0044]样品载药量(wt%)= ( (Cq-C1).V/m) X 100%
[0045]即样品载药量(wt%)=(装载药物质量/载药材料质量)X 100%
[0046]6、载药体系体外细胞给药
[0047]采用较为常用的激光共聚焦(confocallaser scanning microscopy (CLSM))观测样品在体外被细胞吸收的行为。因为所载药物为抗癌药物阿霉素，故选取宫颈癌细胞Hela作为实验细胞系。实验分组:分为载药材料组及纯药物对照组。实验组为加入在O及20°C载药样品的细胞，纯药物对照组即为加入纯阿霉素培养的细胞。培养时间分别为15、30,60和120min。传代48小时的Hela细胞生长铺满培养瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为5xl05个/mL。以每孔I X IO5个细胞/200 μ L DMEM培养基接种于预先放置了无菌盖玻片的12孔培养板中。37°C、5% CO2培养箱中培养24小时，观察细胞贴壁且密度适中后使用。使用纯DMEM，以10 μ g/mL阿霉素当量浓度配置载药样品及纯阿霉素溶液。除去孔内培养基，每孔加入ImL D中所配置溶液，按目标培养时间与Hela共同培养后吸出孔内药物溶液，加入PBS小心清洗三次。每孔加入400 μ L多聚甲醛将细胞固定30min后，用PBS洗去；接着每孔加入400 μ L染核剂Hoechst33342进行染核处理lOmin，再用PBS洗去染核剂，最后用封片剂将生长有细胞的盖玻片封存在载玻片上，用激光共聚焦(confocal laser scanning microscope (CLSM))仪器进行观测。
[0048]三、实验结果和讨论。
[0049]本实例使用X射线衍射仪(XRD)和红外光谱(FTIR)表征所合成的产物成分，使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)分析产物中的元素含量以及成份。同时，使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观测产物的形貌结构。在细胞毒性实验中，采用MTT法并结合酶标仪检测。在载药实验中，采用透射电镜结合能谱仪(EDX)判断药物是否进入纳米材料空腔内部。最后采用较为激光 共聚焦显微镜(CLSM)观测样品在体外被细胞吸收的行为。
[0050]图1是？!1=8.5时，在0，20，35，50，65，80，951:下合成的不同样品的乂1?图谱。801:与65°C的样品与95°C的样品一样有着Zn3 (PO4)2 (H2O)4衍射峰，只不过与95°C样品相比，80与65°C的样品衍射峰明显减弱，结晶性更差。高温下的三种产物都不是目标产物，故在之后的表征分析都不再进行。在更低的温度下(O~50°C )合成所得样品有着完全不同的结晶峰，三强峰位置分别为2 0=11.44°，19.94°和28.36°。在PDF卡片图谱库中，并没有找到与之相对应的卡片。这表明在pH=8.5、温度低于50°C的条件下，能够合成出一种结晶性良好的新型材料。以锌全取代钙合成的羟基磷酸锌是一种全新的材料，理应有着自己特殊的XRD衍射谱图。[0051]FTIR光谱是鉴别功能基团的重要方法，因此，我们用FTIR来分析样品表面基团的成分。图2展示了不同温度下合成产物的官能团红外吸收峰。在2800-3650(31^1的宽峰及1635CHT1左右的小吸收峰都是产物本身或者吸附水中所带羟基的O-H键振动吸收峰。1430cm—1处的小峰是C=O的吸收峰，表明了样品中可能含有碳酸根(C032—)。而锌离子出现在磷灰石的表面中的确会吸收大气中的二氧化碳(CO2)。927-1160011-1处的单峰归属于磷酸根(P0/_)中P-O V 3伸缩振动。432CHT1处的的弱吸收峰及497-608CHT1处的双峰分别是由于磷酸根(P043_) v2及v4弯曲振动造成的。红外结果表明了在0，20，35，50°C下合成的样品中含有羟基及磷酸根(PO/—)，并可能含有碳酸根(CO/—)。
[0052]在反应时保证了 Zn、P元素的投料摩尔比为Zn/P=l.67,为了检验产物中的Zn、P元素摩尔比，将O，20，35，50°C下合成的样品进行了 ICP测试。
[0053]表1不同温度下合成样品的Zn和P兀素含量
【权利要求】
1.一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，其特征在于，该方法是以硝酸锌和磷酸氢二铵为反应物，控制反应温度在0-25°C下，通过化学共沉淀法制得羟基磷酸锌纳米空心球。
2.根据权利要求1所述的一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，其特征在于，所述的硝酸锌和磷酸氢二铵的投料反应摩尔比按Zn:P为1.67:1。
3.根据权利要求1所述的一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，其特征在于，所述的化学共沉淀法反应过程中通过氨水调节反应液PH值维持在8-9。
4.根据权利要求1所述的一种用于药物载体的羟基磷酸锌纳米空心球的制备方法，其特征在于，所述 的羟基磷酸锌纳米空心球作为抗癌药物阿霉素的载体时的载药量> 16wt%。
【文档编号】B82Y5/00GK103539096SQ201310465267
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】朱邦尚, 袁晓亚, 马晓飞, 朱新远, 童刚生, 苏越 申请人:上海交通大学