用于分子诊断的微流体盒、使用微流体盒的对接站、以及用于分析生物样品的方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测样品的一种核酸的微流体盒，该微流体盒包括多个功能体积，这些功能体积分为多个功能区域和微通道的流体网络。根据本发明，至少三个功能区域通过一个或多个中枢连接的微通道流体地连接至流体的中央分配中枢，所述中央分配中枢能够将流体通过穿过所述中央分配中枢而从第一功能区域泵送并且注射至第二功能区域；并且其中中枢连接的微通道的至少三个阀被安排为使得所述至少三个阀被适配为由单个外部凸轮驱动致动器机械地致动。本发明进一步涉及使用这种微流体盒的对接站，并且涉及用于分析生物样品的方法，该方法涉及根据本发明的对接站和微流体盒。
【专利说明】用于分子诊断的微流体盒、使用微流体盒的对接站、以及用于分析生物样品的方法
[0001 ]本发明涉及用于进行分子诊断或生物诊断的微流体装置的领域。
[0002 ]本发明更具体地涉及用于分析包含在生物样品中的至少一种核酸的微流体盒。
[0003]本发明还涉及被设计为使用并且操作这种微流体盒的对接站。
[0004]本发明最终涉及实施这种微流体盒而分析生物样品的方法。
[0005]被设计用于搜寻并且分析包含在生物样品中的至少一种核酸或一种核苷酸序列的微流体装置结合了不同工具，以便:制备生物样品以从所述样品提取核酸;使用标准扩增技术，像例如聚合酶链式反应(也称为“PCR”)，从提取的核酸扩增至少一种靶核酸;并且使用已知的分子识别机制，像例如杂交，检测(例如光学地)并且分析靶核酸。
[0006]因此，为了进行样品的至少一种核酸的分析，所述样品需要顺序地在微流体盒的不同功能区域中转移，每个功能区域用于对样品的具体操作。
[0007]例如文件WO 2009/049268和US 2012/115738描述了包括以下多个功能区域的微流体装置:用于提取核酸的样品制备的区域，一系列的核酸扩增的区域、以及扩增的核酸的表面分析和检测的区域。所述检测区域可能是生物芯片。
[0008]在那些文件中，微流体盒特征在于非常复杂的结构，以便是模块化的，并且允许容易并且迅速的重构，从而适合不同应用。具体地，在微流体盒的每个功能区域内实施具有共用阀结构的很多栗，以将流体从一个功能区域转移至另一个功能区域。
[0009]因此，文件2009/049268和US 2012/115738的盒呈现了大体积，并且流体的转移不能以简单方式以限制数目的致动器操作。
[0010]这些装置的广泛使用，尤其是在人体内分子诊断的背景下，由于盒必须在每次使用后丢弃，所以受限于这一技术中固有的复杂性和高成本。此外，这些装置，例如在US2012/0034705中描述的装置，通常由多种用于实现分析的不同阶段的很多元件组成，它们极其易碎并且难以操纵。
[0011]因此希望微流体盒是大量可生产的、便宜的、并且最优选是一次性的。然而，因为此类微流体装置整合了分子分析的复杂步骤，所以会难以适当地协调常规微流体装置的不同任务。因此还希望微流体盒易于操作并且很多或基本上所有的流体加工步骤都是在该微流体盒上直接自动化。
[0012]出于此目的，本发明提出了一种微流体盒，一方面，该微流体盒使得可能在后者内不仅整合其操作所需的所有流体，而且还整合完整的微流体回路、微通道和阀、反应室和生物芯片，并且另一方面，使得可能以减小的体积并且借助紧凑的外部致动器进行流体按简单方式的转移和运动。
[0013]更确切地说，本发明提供了用于检测样品的至少一种核酸的微流体盒，所述微流体盒包括:
[0014]-多个功能体积，分为多个功能区域，例如至少样品制备区域、核酸扩增区域、核酸分析区域、废物区域、以及
[0015]-微通道的流体网络，
[0016]其中:
[0017]-至少三个功能区域通过一个或多个中枢连接的微通道流体地连接至流体分配的一个中央分配中枢，所述中枢连接的微通道的每一个具有中枢端和区域端，所述中央分配中枢能够将流体通过穿过所述中央分配中枢而从所述至少三个功能区域的第一功能区域栗送并且注射至第二功能区域，所述第二功能区域与所述第一功能区域是相同或不同的，并且
[0018]-各自位于中枢连接的微通道上的至少三个阀被安排在所述微流体盒中，这样使得所述至少三个阀被适配为由单个外部凸轮驱动致动器机械地致动。
[0019]因此，根据本发明的微流体盒具有优点，归因于使用流体的中央分配中枢，从而协助流体从第一功能区域转移至第二功能区域。这使得可能仅使用一个简单流体置换系统(典型地是栗送系统)，用于微流体盒的大部分流体运动，用于诱导降压和加压，以便将来自功能体积或区域的流体置换为另一种流体，并且减小微流体盒的体积。
[0020]与现有技术的盒相比，该微流体盒包括更少的活动元件，并且其成本因此降低。
[0021]此外，与US2012/0034705中披露的系统相比，用于致动连接至中央中枢的微通道的阀的系统还可以更紧凑并且更简单，这归因于这些阀在微流体盒中的安排。
[0022]在一个实施例中，连接至中央分配中枢的至少三个功能区域是样品制备区域和废物区域。
[0023]在一个实施例中，该至少三个功能区域包括核酸分析区域、和/或核酸扩增区域。
[0024]在另一个实施例中，该至少三个功能区域包括样品制备区域、核酸分析区域、和废物区域。
[0025]在另一个实施例中，该至少三个功能区域包括微流体盒的所有功能区域。
[0026]在一个实施例中，该微流体盒进一步包括由线性致动器致动的并且独立于凸轮驱动致动器的至少两个阀。
[0027]根据本发明的微流体盒可以被视为“芯片实验室(lab-on-a-chip)”，其可以进行样品的完整核酸分析，从样品收集至读取结果，典型地是在诊断学或在微生物学实验室中进行的。
[0028]在样品中，对其序列是特异性针对感兴趣基因的核酸或分子标记的存在进行的检测被理解为本申请中的分子诊断。
[0029]该微流体盒通常在数个平方厘米上整合了进行常规使用若干实验仪器做出的复杂分析的的若干个专门化功能区域和体积。优点是这些操作可以被自动化同时消耗低试剂体积。
[0030]此外，以下描述了根据本发明的微流体盒的其他有利的并且非限制性的特征。所述特征对应于可以单独地或组合地采用的本发明的不同实施例。
[0031]该至少三个阀在空间上被安排在该微流体盒中，这样使得它们被适配为由单个外部凸轮驱动致动器同时地致动。在本发明的具体实施例中，所述至少三个阀被线性地或环形地安排在该微流体盒中。
[0032]典型地，所述至少三个阀是中枢连接的微通道的阀，这些中枢连接的微通道将样品制备区域、核酸分析区域、和废物区域连接至中央中枢。
[0033]优先地，所述阀定位为接近或在所述中枢连接的微通道的区域端，所述区域端是转向对应的功能区域的该中枢连接的微通道的两端中的一个。相反，中枢端是转向流体的中央分配中枢的中枢连接的微通道的两端中的一个。
[0034]在本发明的一个实施例中，每个中枢微通道包括定位为接近或在其区域端的一个阀。优先地将所述阀在空间上安排为使得由如上所述的外部凸轮驱动致动器同时地致动。
[0035]该多个功能区域中的至少两个功能区域还可以通过一个或多个区域连接微通道直接彼此流体地连接，所述区域连接微通道中的每一个具有优先由独立于凸轮驱动致动器的线性致动器致动的至少一个阀。
[0036]例如，所述两个功能区域是核酸扩增区域和核酸分析区域。
[0037]在另一个实例中，所述两个功能区域是核酸分析区域和废物区域。
[0038]典型地，根据本发明的微流体盒是一次性的并且包括:
[0039]-盒板，该盒板包括:
[0040]-基板，该基板具有第一面和第二面、与第一表面或第二表面齐平的多个凹槽、和连接所述第一表面和第二表面的多个通孔，以及
[0041]-结合在该盒板的所述基板的第一面上的第一膜，与该第一面齐平的所述凹槽由所述第一膜密封以形成中枢连接的微通道，所述第一膜是被适配为通过外部致动器变形的第一可变形膜，
[0042]-与所述基板的第二表面上的盒板接触的盒体，所述盒体包括:
[0043]-从所述基板的第二表面延伸的一个侧壁、以及
[0044]-限定了所述盒体的多个功能体积的多个内壁，以及
[0045]-被适配为封闭不同功能体积的盒盖。
[0046]在一个实施例中，盒板包括结合在盒板的基板的第二面上的第二膜，与第二面齐平的多个凹槽由所述第二膜密封以形成区域连接的微通道。
[0047]典型地，盒板包括形成在基板中并且从第一面延伸的至少一个凹陷腔。
[0048]还典型地，结合在基板的第一面上的第一膜封闭所述至少一个凹陷腔，以形成用于核酸扩增的至少一个反应室。
[0049]在一个优选实施例中，结合在基板的第一面上的微阵列载玻片(或生物芯片)封闭所述至少一个凹陷腔，以形成用于核酸分析的至少一个检测室。
[0050]在一个优选实施例中，该微流体盒包括盒体和盒盖之间的半透膜，该半透膜被适配为让空气通过它的同时阻止液体从这些功能体积漏出。
[0051]典型地，盒体的功能体积涵盖若干功能区域(例如至少一个样品制备区域、核酸扩增区域、核酸分析区域和废物区域)。所述功能体积是多个容器，这些容器被适配为接收管、流体(例如样品)、试剂产品、或纯化柱。
[0052]在一个实施例中，流体分配的中央中枢包括中枢体和被适配为滑进和滑出该中枢体的活塞密封件，以栗送来自所述微流体盒的功能区域的流体或注射这些功能区域中的流体通过中枢连接的微通道。
[0053]在另一个实施例中，流体分配的中央中枢还包括具有活塞的注射器，该活塞密封件附接至该活塞上。
[0054]微流体盒被适配为插入在设计为进行至少以下功能的设备内的对接站中:热控制、流体流动的控制、阀致动和光学检测。
[0055]本发明还提出了旨在使用并且操作例如如上所述的微流体盒的对接站。
[0056]因此，本发明提供了被适配为接收根据本发明的微流体盒的对接站，该对接站包括:
[0057]-凸轮驱动致动器，其被适配为同时致动中枢连接的微通道的至少三个阀，
[0058]-用于对所述盒的微阵列载玻片进行光激发的工具，以及
[0059]-用于对代表由该盒分析的样品中的所述核酸的光信号进行光学检测的工具。
[0060]在一个实施例中，对接站还包括致动工具，该致动工具被适配为致动所述微流体盒的线性/独立致动阀。
[0061 ]在一个具体实施例中，凸轮驱动致动器是旋转运动致动器。
[0062]在另一个具体实施例中，凸轮驱动致动器是线性运动致动器。
[0063]优先地，对接站的凸轮驱动致动器被设计为在连接至中央中枢的微通道的多个阀中，至多打开所述阀中的仅一个。
[0064]在一个优选实施例中，根据本发明的对接站包括滑动工具，该滑动工具被适配为使中央中枢的注射器滑动进出该中枢体，以栗送来自所述微流体盒的功能区域的流体或注射这些功能区域中的流体通过中枢连接的微通道。
[0065]本发明的目标还在于提供用于分析生物样品的仪器，该仪器包括根据本发明的这种对接站和微流体盒，用于分析样品的至少一种核酸。
[0066]此外，根据本发明的微流体盒具体地被适配为用于:用于分析生物样品的方法。
[0067]因此，本发明的另一个目标是提出用于分析生物样品的方法，该方法包括以下步骤:
[0068]a)将所述生物样品提供进入根据本发明的微流体盒的样品制备区域的至少一个功能体积中，
[0069]b)通过致动控制微通道的流体流动的至少一个阀，允许所述生物样品与存在于该样品制备区域的另一个功能体积中的至少一种试剂和/或一个纯化柱接触，
[0070]c)回收步骤b生成的产物，以获得分离的DNA样品，
[0071 ] d)将该分离的DNA样品转移至该核酸扩增区域的至少一个功能体积中，
[0072]e)允许所述分离的DNA样品与用于扩增的至少一种试剂接触，并且关闭该扩增区域的功能体积的这些阀，
[0073]f)进行DNA扩增，
[0074]g)回收在步骤f)获得的扩增的DNA，并且将其通过致动控制微通道的流体流动的至少一个阀转移至该杂交区域的另一个功能体积中，
[0075]h)在杂交室中允许所述扩增的DNA和能够与所述DNA杂交的至少一种化合物接触，并且
[0076]i)获得微阵列图像并且对其进行自动分析。
[0077]现在将参考附图详细地描述本发明的一个实施例，其中:
[0078]-图1是在本发明的优选实施例中的微流体盒的透视图；
[0079]-图2是图1的微流体盒的分解图，使得盒板、盒体和盒盖可见；
[0080]-图3是用于用图1的微流体盒分析的生物样品的制备管的示意图；
[0081]-图4是可以用于图1的微流体盒以栗送并且注射流体的注射器的分解示意图；
[0082]-图5是待插入图1的微流体盒中的“扩增混合物”管的示意图；
[0083]-图6是图2的盒体的详图；
[0084]-图7是图2的盒板的详图；
[0085]-图8是图7的盒板的底视图；
[0086]-图8A是根据剖面A-A的图8的截面图；
[0087]-图8B是根据剖面B-B的图8的截面图；
[0088]-图9是参考图8中的I的区域的详图；
[0089]-图9A是根据剖面A-A的图9的截面图；
[0090]-图10是参考图8中的I的区域的详图；
[0091 ]-图1OA是根据截面线B-B的图10的截面图；
[0092]-图11是图7的盒板的俯视图；
[0093]-图12是在优选实施例中的对接站中，图1的微流体盒的安装的示意图(仅机械部分)；
[0094]-图13是使用球来致动微流体盒的阀的旋转运动凸轮驱动致动器的示意图；
[0095]-图14是允许将图13的凸轮驱动致动器的球保持在适当位置的穿孔致动器板的示意图；
[0096]-图15是具有在图13的凸轮驱动致动器的机构中运行的止动装置的圆板的示意图；
[0097]-图16是盒板的另一实例的详图。
[0098]在图1和图2中已经分别示出，根据本发明的一个优选实施例的微流体盒I的装配图和分解图，其中微流体盒I在此是一次性盒。借此它的意思是，微流体盒I旨在被处理并且放置在旨在用于接收生物废物的容器中。
[0099]如图1和2所示，微流体盒I包括三个主要元件，S卩盒板10、盒体20和盒盖30。
[0100]微流体盒I还包括:包含样品^的样品管40，至少一个扩增混合物管50和注射器60。
[0101]以下将详细描述微流体盒I的这些不同元件。
[0102]微流体盒I的盒板1首先包括基板100，例如，在图7中详细示出的基板。
[0103]基板100基本上具有薄板叶的形状，并且具有第一面101和第二面102。第二面102是当该盒被装配时转向盒体20的面(参见图1和2)。
[0104]可以有利地通过热塑性聚合物材料，例如环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)的注射模制而制造盒板1。优选地，在此盒板1由聚丙烯(PP)制成。COC和COP是基于生物相容性是优异的环烯烃的无定形并且透明的材料。这些材料允许用膜和/或粘性补片制造密封连接。具体地，它们可以在下组中选择，该组包括:聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚甲基-甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、聚氯乙烯(PVC)。
[0105]优选地，盒板1的基板100的纵长和横向的尺寸大约是:长包括在50和150mm之间，优先在85和125mm之间，以及宽为25和75mm之间，优先在40和60mm之间。基板100的厚度优先包括在大约I和5mm之间，优先在I和2mm之间。
[0106]—般地，微流体盒I包括微通道的流体网络，在这些微通道中，不同流体循环并且这些微通道各自包括用于控制此类流体在对应的微通道中循环的至少一个阀。
[0107]现在将对图1和2中示出的微流体盒I的具体实施例进行描述，其中参考图7至11，描述形成的这些微通道和相关的阀在何处以及怎么样，图7至11示出盒板10及其基板100的不同视图。
[0108]因此，具体地如在图7和8中所示，盒板10首先包括多个通孔，在此这些通孔是作为参考，总计三十四，并且被参考:
[0109]-Hl 至 H14，
[0110]-HOc至H5c，和H9c，H10c，以及
[0111]-!17&，!1713，!111&，!112&，!115&至!115(1，!116&至!116(1。
[0112]所有这些通孔延伸通过基板100，在第一面101和第二面102之间，并且优选地，垂直于这两个面11、102 (针对通孔H4、H4C以及通孔H8、Hl 6a分别参见例如图9A和1A)。
[0113]这些通孔，在第一面和第二面101、102的每一个上开口，从任一面将元件彼此流体地连接。借此它的意思是，流体可以如在另一个方向一样以一个方向在这些通孔中循环。
[0114]为了正确理解，将在以下描述中，在三个不同类型的通孔之间，进行区别(参见图7至 10A):
[0115]-具有凹陷的通孔:这些是参考号为Hl至H14的通孔(参见8、9和9A)，通过它们的流动是由多个阀致动
[0116]-中央通孔:这些是参考号为HOc至H5c、H9c和HlOc的通孔，以及
[0117]-对应于剩余通孔以及参考号为!173、!1713、!1113、!1123、!1153至!115(1、!1163至!116(1的简单通孔。
[0118]具有凹陷的通孔，在图7和8中参考号为Hl至H14，各自具有在图7和8中在其转向基底100的第一面101的端部的对应地参考号为Rl至R14的凹陷，该凹陷是圆柱形形状，形成在基底100的第一面101的表面上。例如，在图9A和1A中说明了这一点，这些图是基板100的部分截面图，其中通孔H4 (图9A)和H8 (图10A)被示出具有对应的凹陷R4和R8。
[0119]凹陷Rl至R14具有:
[0120]-包括在Imm和1mm之间的直径，优先在2mm和8mm之间，优选是约4mm，以及
[0121 ]-包括在0.02mm和0.4mm之间的深度，优先在0.05mm和0.15mm之间，优选是约0.1mm0
[0122]彼此接近的、参考号为H0c、Hlc、H2c、H3c、H4c、H5c、H9c和HlOc(参见例如图8)的中央通孔在此以圆形安排。以下将会看到这种安排的意义。
[0123]另外，盒板10包括第一多个的十六个凹槽，参考号为图8至1A中的Gl至G16。这些第一凹槽Gl至G16以与此第一面101齐平的这种方式，形成在基板100的第一面101附近。这可以例如在图9A和1A中观察到，其中示出了凹槽G4(图9A)和G8、G16。
[0124]有利地，这些凹槽Gl至G16平行于基板100的第一面101，具有总体上包括在0.0lmm和0.5mm之间、优先在0.2mm和0.4mm之间、优选约0.3mm的深度。
[0125]在此这些凹槽Gl至G16的宽度等于约0.5mm。
[0126]在图1中示出的微流体盒I的具体实施例中，观察到这些第一凹槽Gl至Gl6延伸(参见图8):
[0127]-在中央通孔H0c、Hlc、H2c、H3c、H4c、H5c、H9c、H10c与凹陷Rl至RlO之间:这是凹槽GI至G1的情况(针对在中央孔H4c和具有其凹陷R4的通孔G4之间的凹槽G4，参见例如图9A);
[0128]-或在中央通孔HOc与简单通孔Hlla、H12a之间，这是凹槽Gll和G12的情况；
[0129]-或在两个简单通孔之间:这是分别在通孔H15a和H15c之间，以及通孔H16a和H16c之间延伸的凹槽G15和G16的情况。关于这些具体的凹槽G15、G16，还观察到，它们分别在其通路上包括简单通孔Hl 5b、Hl 6b。
[0130]凹槽66、67、68、611和612共享将这些凹槽66、67、68、611，和612连接至中央孔!100的公用部分，并且以此方式形成分支结构。
[0131]如图7和11中所示，盒板10最终包括第二多个的八个凹槽Glla、G12a、G13a、G14a、G15a、G15b、G16a、G16b。这些第二凹槽 Glla、G12a、G13a、G14a、G15a、G15b、G16a、G16b 以与该第二面102齐平的这种方式，形成在基板100的第二面102附近。这可以例如在图1OA中观察至IJ，其中示出了凹槽G16a。
[0132]关于第一凹槽61至616，这些第二凹槽611&、6123、6133、614&、6153、61513、616&、G16b有利地平行于基板100的第二面102。它们具有与第一凹槽Gl至G16相同的尺寸特征。
[0133]—般地，并且如可以通过观察图8(基板100的底视图)和图11(基板的俯视图)理解的，形成在基板100的第二面102上的第二凹槽611&、6123、6133、614&、6153、61513、616&、G16b延伸:
[0134]-分别在具有凹陷的通孔!16、!18、!111、!112、!113、!114与简单通孔!1153、!1163、!1113、H12a、H15b、H16b之间，这是例如第二凹槽Glla、G12a、G13a、G14a、G15a和G16a的情况(参见例如图10A);
[0135]-或在两个简单通孔H15c、H15d、H16c、H16d之间:这是例如凹槽G15b(在简单通孔Hl 5c、Hl 5d之间)和凹槽G16b (在简单通孔Hl 6c、Hl 6d之间)的情况。
[0136]在上述基板100中形成的通孔、凹陷和凹槽一方面旨在形成微通道的流体网络，并且另一方面，形成在这些微通道中的流体控制阀。
[0137]出于此目的，应理解，必须封闭如刚描述的，开向基板的第一表面101或第二表面102的通孔、凹陷和凹槽。
[0138]因此，盒板10首先包括第一膜(参见图2)，当微流体盒I被装配时(参见图1)，该膜位于盒板10的基板100的第一面101上。
[0139]此外，这一第一膜11的形成和尺寸被调节，以便(参见图8):
[0140]-符合基板100的外部轮廓103，并且
[0141]-延伸经过基板100的大半，以便覆盖第一凹槽Gl至G16、凹陷Rl至R14、和中央通孔!10(3至!15(3、!19(3、!110(3，以及简单通孔!1113、!1123、!1153至!115(3、和!1163至!116(3的全部。
[0142]优先以类似于盒板10的硬基板100的材料制成第一膜11。一般地，在此第一膜11由聚丙稀(PP)制成。
[0143]优先地，第一膜11是约0.1mm厚的热塑性膜，通过热焊接例如通过激光焊接、结合、粘附或化学连接方法而结合或焊接至基板的第一面101的表面上。第一膜11封闭第一面101并且提供微流体回路的厚度。
[0144]因此定位并且固定在基板100的第一面101上，第一膜11封闭并且紧密地密封第一凹槽61至616、凹陷1?1至1?14、和中央通孔!10(3、!11(3至!15(3、!19(3、!110(3，以及简单通孔!1113、H12a、H15a至H15c，和H16a至H16c。
[0145]换言之，第一膜11与第一凹槽、通孔和凹陷协作，以便形成多个微流体通道、或微通道和阀。
[0146]如图12中所示，因此借助存放在这一第一面101上的第一膜11，通过封闭与基板100的第一面101齐平的第一凹槽61至612、615、616，形成微通道(:1至(:12、(:15、(:16。
[0147]同样地，阀Vl至V14由可变形的第一膜11形成，该第一膜放置为与由凹陷Rl至R14形成的阀座相对，这些凹陷形成在基板100的第一面101的表面上。
[0148]以一个优选的方式，放置为与凹陷Rl至R14相对的可变形第一膜11的表面在静止时大致是平面的，并且平行于基板的第一面101，并且能够通过外部致动器变形(参见下文)。第一膜11在这一外部致动器的作用下，在凹陷Rl至R14的水平的变形允许打开或关闭阀Vl至Vl4。
[0149]更确切地说，第一膜11相对每一阀座即每一凹陷Rl至R14的偏转，允许对应的通孔Hl至H14的闭塞，这些通孔的直径远低于每一凹陷Rl至R14的直径。这允许在使用具有某一硬度的第一膜11时造成盒板10的最大闭塞。
[0150]盒板10还包括第二膜12(参见图2)、或板，当微流体盒I被装配时(参见图1)，该膜或板位于盒板10的基板100的第二面102上。
[0151]在此由类似于盒板10的硬基板100的材料制成第二膜12，并且其厚度为约0.1_。
[0152]可替代地，可以使用板。这一板可以具有包括在0.05_和2_之间的尺寸。
[0153]通过结合，第二膜12结合至基板100的第二面102。
[0154]作为一个变体，可以通过热焊接、粘附或化学连接方法，将第二膜固定在第二面上。
[0155]第二膜12封闭第二面102并且允许微流体回路的密封性。
[0156]更确切地说，该第二多个凹槽611&、6123、6133、614&、6153、61513、6163、61613被第二膜12封闭并且密封。
[0157]关于第一膜11，并且如图12中所示，因此借助存放在该第二面102上的第二膜12，通过封闭与基板100的第二面102齐平的第二凹槽Glla、G12a、G13a、G14a、G15a、G15b、G16a、616匕6，形成微通道(:113、(:123、(:13、(:14、(:153、(:1513、(:163、(:1613。
[0158]第二膜12具有矩形开口12A(参见图2)，以便允许在微流体盒I的装配期间，其通道通过盒体20。
[0159]因此，应用在盒板10的基板100上的第一膜11和第二膜12与其形成微通道Cl至C15、Clla至C16a、C15b、C16b的流体网络(参见图12)。
[0160]以下将可见，形成在盒板10中的微通道和阀如何用于运输并且转移样品分析所需的流体。
[0161]如图8和11中所示，盒板10还包括彼此隔开并且形成在基板100中的至少两个凹陷腔Rla、R2a。这两个凹陷腔Rla、R2a形成在第一面101中并且从后者延伸朝向基板100的内侧(参见图8A)。
[0162]由存放在基板100的第一面101上的第一膜11紧密地封闭这两个凹陷腔Rla、R2a，以这样一个方式形成用于核酸扩增的两个反应室，以下称为扩增室并且参考号为AMPl和AMP2(参见图12)。
[0163]分别由阀V11、V13并且由阀V12、V14控制朝向或离开这两个扩增室AMP1、AMP2的流体的循环。
[0164]由独立于凸轮驱动致动器的线性致动器致动这些控制扩增室(典型地是V13和V14)之间的流体循环的阀。优先地，由独立于凸轮驱动致动器的线性致动器致动这些控制朝向扩增室(典型地是Vl I和Vl 2))的流体循环的阀。
[0165]以相同方式，如在图8和图11中所示，盒板10包括形成在基板100中的两个其他凹陷腔 Rlb、R2b。
[0166]这两个凹陷腔Rlb、R2b的形状基本上是平行六面体的，形成在第一面101中并且从后者延伸朝向基板100的内侧。如图SB中所示，这两个凹陷腔Rlb、R2b分别具有锯齿状的倾斜的侧面105、106。
[0167]由结合在基板100的第一面101上的生物芯片110(参见图2)紧密地封闭这两个凹陷腔Rlb、R2b，以便形成用于核酸分析的两个反应室，以下称为杂交室并且参考号为HYBl和HYB2(参见图12)。
[0168]使朝向或离开这两个分析室HYBUHYB2的流体的循环分别通过通孔H7a、H15d(对于杂交室HYB1)，并且通过通孔H7b、H16d(对于杂交室HYB2)。
[0169]在一个实施例中，在每个扩增室上游，该盒可以包括计量室，该计量室位于中央中枢和每个扩增室之间。例如，通过阀Vll和V12(参见图12)，或VV8和VV14(参见图16)，所述计量室被连接至所述扩增室。典型地，例如经由微通道CU和C12，所述计量室还连接至中央中枢。可替代地，或另外地，通过微通道，所述计量室还可以直接连接至中枢连接的微通道的阀。对于校准待注射至扩增室的适当流体水平，所述计量室是有用的。
[0170]这些杂交室包括用于检测样品中的具体靶分子的存在的亲和力生物传感器。通过连接，该亲和力生物传感器与靶分子相互作用。根据本发明的盒旨在平行检测生物样品内的若干分子杂交标记的存在。在表面上的大量候选物中，扩增产物、或扩增子的捕获是本领域技术人员熟知的技术，以便进行多重检测。检测的有利模式是生物芯片。目前，生物芯片系统广泛用于复杂样品中的具体物质的检测和测量。关于这种生物芯片，通过用提供的特异性针对所述序列的探针测量靶序列的关联水平，来测量样品中靶DNA的一致性和量。在DNA生物芯片技术中，以每个探针占据一个预定位置的这种方式，将各自具有限定的序列的一组探针核酸固定在固相支持体或基板上。
[0171 ]根据本申请中示例的实施例，生物芯片110本质上包括固体基板111，该基板大致是平面的，例如玻璃板、硅板或塑料板，在其表面上固定有探针分子，这些探针分子的序列特异性针对革E核酸。作为实例，适合本发明的盒的生物芯片孔的大小是大约24_ X 24mm x0.1mm0
[0172]现在将参考图1、2和6，描述微流体盒I的盒体20。
[0173]优选地，分开地从盒板10制成盒体20。在这种情况下，有利地通过热塑性聚合物材料，例如聚丙烯(PP)的注射模制而以三维制造盒体20。
[0174]在一个变体中，盒体可以由环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)制成，具体地选自下组，该组包括聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚甲基-甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、聚氯乙烯(PVC)。
[0175]在一些实施例中，例如通过立体光固化成型或通过烧结，以三维制造盒体。
[0176]根据另一个有利的变体，盒体和盒板可以被制作在一起，以便形成单件。在这种情况中，例如使用被用于盒板10和用于盒体20的相同种类的材料，通过注射模制，来制造所述件。
[0177]当微流体盒I被装配时(参见图1)，这一盒体20在盒体20的第一边缘22的水平，在基板100的第二面102上，与盒板10接触。
[0178]如图2中所示，盒体20包括从这一基板100的第二面102至盒体20的第二边缘23，垂直于基板100延伸的侧壁21。
[0179]盒体20还包括多个内壁冊、￥1、￥2、￥3、￥4、￥5、￥6、￥7、￥8、￥9、￥10，这些内壁分别限定了多个功能体积CT、T1、T2、T3、T4、T5、AMP、DET、T9、T10(参见图2)。
[0180]盒体20的这些不同功能体积CT、T1、T2、T3、T4、T5、AMP、DET、T9、T10是多个容器，这些容器在使用微流体盒I用于分析样品S期间，旨在接收处理的或未处理的样品S、不同试剂产品、纯化柱，连同旨在制备、扩增和分析样品S的流体或固体。
[0181]以下将描述这些不同功能体积的功能。
[0182]另外，如在图2中所示，观察到侧壁21和六个内壁W0、W5、W6、W7、W8、W9还限定了功能体积WST，如以下将可见，该功能体积是用于来自样品S的和来自不同试剂产品的废物的体积。
[0183]当微流体盒I被装配时(参见图1)，盒体20在第二面102的水平被固定至盒板10，由基板100的第一面102在盒体20的第一边缘22的水平封闭每个功能体积Tl、T2、T3、T4、T5、T9、T10、CT、WST、AMP、DET，这样使得:
[0184]-功能体积1'1、了2、了3、了4、了5、了9、1'10分别包括通孔!11、!12、!13、!14、!15、!19、!110;
[0185]-功能体积CT围绕中央通孔H0c、Hlc、H2c、H3c、H4c、H5c、H9c、H9c、H10c的全部并且包括这些中央通孔的全部;功能体积AMP和DET分别围绕两个扩增室AMPl、AMP2，和两个检测室HYB1、HYB2;
[0186]-功能体积WST与通孔H7、H7a、和H7b处于连通。
[0187]因此，应理解(具体地参见图12)，经由阀Vl、V2、V3、V4、V5、V9、VlO控制的微通道Cl、C2、C3、C4、C5、C9、Cl O，功能体积T1、T2、T3、T4、T5、T9、Tl O各自独立地与功能体积CT处于流体连通，并且流体可以如在另一个方向一样按一个方向在这些不同功能体积之间循环。
[0188]出于此目的，功能体积CT，也称为中央管，形成了中枢体，注射器60(参见图1和2)可以滑进或滑出该中枢体。
[0189]更确切地说，如在图4中所示，注射器60包括活塞62和活塞密封件61，活塞62被固定在该活塞密封件中。例如，通过将活塞62插入包括可变形的附接工具的活塞密封件61中，活塞62可以被附接至活塞密封件61。
[0190]在相对于活塞密封件61的相对侧上，活塞62还包括平面63，该平面使得可能在这一活塞62上推或拉，以便使得注射器60在中枢体CT中滑动。
[0191]注射器60的活塞密封件61包括两个O型圈61A、61B，并且具有以这样一个方式调节的外径，一旦接合在中央管CT中，它可以紧密地在中央管CT中滑动。
[0192]以此方式，注射器60可以栗送或注射在不同功能体积T1、T2、T3、T4、T5、T9、T10中的流体，这些功能体积通过微通道Cl、C2、C3、C4、C5、C9、Cl O连接至中央管CT。
[0193]在一个优选实施例中，仅活塞密封件61是微流体盒I的盒体20的一部分。在一个优选实施例中，注射器60的活塞62是对接站1000的一部分。因此，微流体盒I中的活动件的数目减少了，它的制作成本也一样减少了。
[0194]然后将认为，中枢体CT和注射器60是流体的中央分配中枢的一部分，以下称为中央中枢并且以参考标志CH引用。
[0195]如还可以从图12理解的，这一中央中枢CH也能够栗送或注射流体:
[0196]-经由微通道C7并且归因于阀V7，来自或至废物容器WST;
[0197]-经由微流体通道(:11、(:11&、(:12、(:12&并且归因于阀￥11、￥12，来自或至扩增室AMPUAMP2；
[0198]-经由微流体通道C6、C8、C15a、C16a、C15、C16、C15b、C16b 并且归因于阀 V6、V8，来自或至检测室HYBl、HYB2。
[0199]在微流体盒的一个实施例中，与废物容器或与检测室关联的阀不位于中枢连接的微通道上，并且因此由独立于凸轮驱动致动器的线性致动器致动。
[0200]如在图和2中所示，微流体盒I的盒盖30来自并且插入盒体20，靠置在其第二边缘23上，以便封闭不同功能体积T2、T4、T5、T9、T1、WST、AMP、DET。
[0201]作为盒板10和盒体20，有利地通过热塑性聚合物材料例如聚丙烯(PP)的注射模制而制造盒盖30。
[0202]在一个变体中，可以通过热塑性聚合物材料，例如像具体地选自下组的环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)的注射模制而制造盒盖，该组包括聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚甲基-甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、聚氯乙烯(PVC)。
[0203]盒盖30包括在每个功能体积T2、T4、T5、T9、T10的水平的通气孔32，以便允许流体在中央中枢CH的这些体积中的抽吸和注射。
[0204]在一个装配配置(图1)中，在将微流体盒I用于分析样品S前，盒盖30包括紧密地覆盖完整通气孔32的保护膜31，以便在微流体盒I的运输或储存期间，保护功能体积Τ2、Τ4、Τ5、Τ9、Τ10的内容物。例如，这一保护膜31可以由塑料的或金属的(例如铝)薄片制成。
[0205]在一个实施例中，微流体盒可以进一步包括在盒体和盒盖之间的半透膜。这一半透膜在一侧包括疏水层，并且在另一侧包括粘合层，以便将该膜密封至盒体的第二边缘上。
[0206]该半透膜充当G0RETEX?织物，并且被适配为让空气通过它的同时阻止液体从功能体积漏出。因此，这一半透膜允许微流体盒的不同功能体积的通气。
[0207]如在图1和2中所示，在此微流体盒I还包括两个管40、50，在其使用期间，这两个管40、50通过分别插入盒体20的管Tl和管Τ3中而被装配在微流体盒I中。
[0208]包含样品S的第一管40是样品管，该样品管包括(参见图3)圆柱形的本体42、在该管的一侧上封闭本体42的帽41、以及位于该管的另一侧上的末端开口 43。帽41可以包含允许空气流动的同时保留液体的半透膜。
[0209]根据如在本申请中示例的实施例，在此根据类似于一次性墨盒的技术的技术，由塑料珠44封闭末端开口 43。
[0210]具体地，旨在接收样品管40的容器Tl包括抽吸头，该抽吸头被设计为推动塑料珠44，以便从其阻断位置弹出塑料珠44，其中该塑料珠阻止样品管40的内容物的流动。
[0211]在一个变体中，通过使用不具有抽吸头的管，或通过用微量移液器或注射器将样品移进专用容器中，样品可以被直接注射进该容器中。
[0212]另外，样品管40还包括放置在管40的本体42内的过滤器45，以便限制来自样品S或来自样品S的副产物的进入微流体网络的大颗粒的量。
[0213]第二管50是包括用于扩增反应的混合物的管，称为扩增混合物管，该管具有类似于第一管40的形状的形状，该第一管具有本体51、盖52、和还包括封闭珠(未示出)的末端部分53ο
[0214]上述微流体盒I旨在插入对接站1000，该对接站的一部分截面图示出在图13中。
[0215]在图13示出的实施例中，对接站1000包括旋转运动凸轮驱动致动器1100。
[0216]更确切地说，凸轮驱动致动器1100包括凸轮1120(参见图15)，在此该凸轮是围绕旋转轴线Al的环形圆柱形部分1121，该环形圆柱形部分具有基本上是平面的并且彼此平行的第一表面1121A和第二表面1121B，以及中央开口 1123。
[0217]有利地，凸轮1120在其第一表面1121上包括沿着圆柱形部分1121的半径延伸的矩形凸轮凹陷1124。考虑沿着环形部分1121的周长，这一凸轮凹陷1124的轮廓在此是弯曲的，并且在凸轮凹陷1124的底部上，具有曲率半径Re。
[0218]凸轮驱动致动器1100还包括平面引导板1110(参见图13和14)，在此穿孔有十个圆柱孔1111，这些圆柱孔环形地安排并且垂直穿过引导板1110。这些引导孔1111旨在引导凸轮驱动致动器1100的十个致动球1102(参见图13，其中仅示出一个致动球1102)，此类致动球具有被调节的球直径，这样使得它们可以滑动穿过所述引导孔1111，而在这些引导孔的壁上没有过多摩擦。
[0219]如图13所示，旋转运动凸轮驱动致动器1100的引导板1110位于凸轮1120的上方，这样使得致动球1102靠置在凸轮1120的第一表面1121A上。
[0220]另外，相对于引导板1110的厚度，圆柱孔1111的半径、以及因此致动球的直径被调节，这样使得:
[0221]-在其中致动球1102靠置在凸轮1120的第一表面1121A的平面部分上的情况下(图13的情况)，通过其对应的圆柱孔1111被维持在适当位置的致动球1102从引导板1110向上突出；
[0222]-在其中致动球1102靠置在凸轮1120的环形部分1121的凸轮凹陷1124上的情况下，由其对应的圆柱孔1111引导的致动球1102从引导板1110向下突出。
[0223]因此，当凸轮1120围绕旋转轴线Al旋转运动时，致动球1102进行平行于所述旋转轴线Al的平移运动，归因于对应的圆柱孔1111，致动球1102被引导在接合位置和脱离位置之间，在该接合位置时，致动球1102在运动远离凸轮1120时从圆柱孔1111突出，在该脱离位置时，该致动球1120运动接近凸轮1120。
[0224]在图15中示出的优选实施例中，在凸轮1120包括仅一个凸轮凹陷1124的情况下，至多一个致动球1102可以处在脱离位置，同时其他致动球1102处在接合位置。
[0225]如图13中所示，凸轮致动器1100包括一系列的十个活塞1101(每个活塞位于致动球1102上方)以及类似于第一引导板1110的另一个引导板1130，所述另一个引导板也被穿孔，以便引导活塞1101处于其平移运动中。
[0226]在凸轮驱动致动器1100中，圆柱孔1111、致动球1102和活塞1101被环形地安排。
[0227]在根据本发明的微流体盒I中，安排十个阀Vl至V10，以便一起被外部凸轮驱动致动器1100机械地致动O
[0228]更确切地说，连接至中央中枢CH的微通道Cl至ClO的阀Vl至VlO被环形地安排，这样使得存在与每个阀Vl至VlO相对的活塞1101。
[0229]如此安排，应理解:
[0230]-当致动球1102处在接合位置(图13的情况)时，它将对应的活塞1101也放置在结合位置中，其中它施加压力到盒板10的与阀Vl的阀座Rl相对的第一膜11上，以便使第一膜11变形并且密封通孔Hl，由此关闭阀Vl，并且
[0231]-与其相反，当致动球1102处在脱离位置时，活塞1101也进入脱离位置，其中它不施加任何更多压力至盒板10的第一膜11上，这样使得第一膜11在静止时与阀Vl的阀座Rl相对，这样使得然后打开阀VI。
[0232]因此，如以上所见，应理解，当微流体盒I插入对接站1000时并且当微流体站I由凸轮驱动致动器1100致动时，凸轮驱动致动器1100允许同时打开阀Vl至VlO中的至多一个。
[0233]虽然未示出，在图13中示出的实施例中的对接站1000还包括滑动工具，以便使中央中枢CH的注射器60滑进和滑出中枢体CT。
[0234]例如这些滑动工具可以包括注射器60的活塞62和捕捉注射器60的活塞62的低于平面63的叉形杠杆，以便降低或提高活塞62。
[0235]另外，如已知，对接站1000还包括:
[0236]-用于激发与两个杂交室HYBl、HYB2接触的生物芯片110的光激发工具，以及
[0237]-光学检测工具，该光学检测工具用于检测从杂交室HYBl、HYB2发射的并且代表在由微流体盒I分析的样品S中搜寻的至少一种核酸的光信号。
[0238]在其中使用检测生物芯片110的这一实施例中，用一种用于光学检测的装置进行靶分子和探针之间的相互作用的检测和量化:第一波长的光辐射激发连接至靶分子的生色团。然后由收集装置收集响应其激发光的处于第二波长的由生色团发射的光。
[0239]还特别有利的是，本发明的微流体盒1、以及因此生物芯片110的读取，适合用于以下系统，该系统用于收集响应光激发型接触成像的由生色团发射的光。
[0240]可以认为，微流体盒I旨在被放置在用于读取光学接触成像的仪器中。已经在WO2004042376、W0 2004068124、W0 2007045755、W0 2010007233和TO 2012089987中值得注意地描述了此类接触成像装置。
[0241]有利地，基板100是透明的。
[0242]在借助生物芯片110荧光检测靶核酸的情况下，会有利的是，生物芯片110的基板可以包括固定在其表面上吸收处于第一激发波长的光的并且发射处于第二波长传输的光的荧光物质，包括用于基于激发光的量而增加光发射的量的效率的工具。
[0243]现在将描述旨在由操作者实施的方法，以便分析包含在样品管40中的样品S，所述管插入在微流体盒I的功能体积Tl中(参见图2)。
[0244]由诊断机进行的操作顺序可以包括以下步骤:
[0245]-来自裂解的样品的DNA提取和纯化
[0246]-使用任何扩增方法的DNA扩增，这些扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR和恒温扩增；
[0247]-使用高度特异性探针(例如HairLoop?探针)或标准线性探针在微阵列上杂交，以便区别上至SNP辨别水平的标记。
[0248]-使用优先允许整合至例如描述于WO2004042376、W0 2004068 I 24、WO2007045755、WO 2010007233和WO 2012089987中的对接站中的接触成像装置的荧光集成读取器，通过荧光标记进行杂交检测。
[0249]在一个实施例中，在盒中的样品的注射之前，进行预裂解步骤。
[0250]可以在盒中的注射之前将裂解缓冲液和/或试剂添加至样品中，和/或作为冻干粒料储存在盒的一个功能体积中。
[0251]样品可以是溶液或在悬浮液中，具体地，样品可以是体液，例如粪便、全血、血浆、血清、尿、痰、唾液、精液、粘液和脑脊液。样品还可以是使可溶或悬浮于液体中的固体。
[0252]根据本发明，核酸旨在是指处于任何构型的任何合成的或天然存在的核酸(单链的或双链的DNA)。
[0253]应当指出，在本发明的一些实施例中，靶核酸可以处于样品中的RNA的形式，典型地是当在待分析的样品中搜寻病毒核酸时。在这种实施例中，核酸可以经历RT PCR。
[0254]在包括多个功能区域的微流体盒I的功能体积中进行这一分析方法的主要步骤，所述多个功能区域至少包括:
[0255]-包含被设计为从待分析的样品S提取具体核酸的不同功能体积的样品制备区域；
[0256]-包含被适配为进行包含在样品S中的核酸的扩增的功能体积的核酸扩增区域。根据不同实施例，核酸扩增区域包括一个或多个扩增室；
[0257]-典型地包含功能体积T9和TlO的核酸分析区域。根据不同实施例，核酸扩增区域包括一个或多个检测室；以及
[0258]-包含被设计用于废物的功能体积WST的废物区域。
[0259]在上述优选实施例中，不同功能区域是这样，使得:
[0260]-样品制备区域包括样品管40、扩增混合物管50、以及分别包含纯化柱、第一DNA洗涤缓冲液和第二 DNA洗涤缓冲液的三个功能体积T2、T4、T5;
[0261 ]-核酸扩增区域包括两个扩增室AMPl、AMP2 ；
[0262]-核酸检测区域包括两个功能体积T9和T10，这两个功能体积分别包括用于杂交的缓冲液和杂交洗涤缓冲液。
[0263]因此，根据以上参考图1和2描述的微流体盒I的实施例，样品制备区域和废物区域通过一个或多个中枢连接的微通道和一个或多个凸轮驱动致动阀，直接流体地连接至流体分配的中央中枢CH。任选地，通过一个或多个中枢连接的微通道(C15和C16 )，核酸检测区域可以直接流体地连接至中央中枢CH。
[0264]仍在参考图1和2描述的微流体盒I的实施例中，扩增区域并未直接连接至中央中枢CH，并且朝向这一区域的并且显著地至每一扩增室的流体连接是由线性致动器致动的至少一个阀控制的。
[0265]如以上解释，借助接合于中央管CT中的注射器60，中央中枢CH能够借助通过它，从多个功能区域的第一功能区域转移流体至第二功能区域。
[0266]以此方式，不同功能区域被安排在微流体盒I中，所述第二功能区域可以与所述第一功能区域是相同或不同的。
[0267]此外，用分析方法的以下描述，技术人员将理解，该多个功能区域如何彼此合作，以便分析样品S。
[0268]步骤a)
[0269]在第一步骤(步骤a)中，操作者提供生物样品S进入微流体盒I的样品制备区域的至少一个功能体积中，在此即进入插入在微流体盒I中的样品管40中。
[0270]在启动时，样品管40可以已经包含裂解缓冲液。可以通过离液盐、洗涤剂或碱变性法，实现多数细胞的破裂。典型地，当将样品S注射进这一管40时，通过已经存在于样品管40中的的裂解和蛋白酶K缓冲液，进行样品S的裂解。
[0271]—旦将微流体盒I插入对接站1000，经数分钟孵育样品S，以便通过化学裂解，完全地破坏细胞膜。蛋白酶K缓冲液完成蛋白细胞组分的消化。
[0272]在另一实施例中，裂解缓冲液和试剂(例如蛋白K缓冲液)还可以作为冻干粒料储存在盒的功能体积中。
[0273]在另一实施例中，其中样品包括难以处理的基质或微生物，则在将样品制备管插入微流体盒之前，可能需要进行以下步骤:
[0274]-例如，使用撞击珠连同具体细胞破裂缓冲液，裂解样品；
[0275]-涡旋并且在高达70°C的温度下加热数分钟，例如5分钟；
[0276]-添加结合缓冲液和潜在地允许扩增抑制剂吸收的试剂(例如InhibitEXMatrix)至样品制备管中。
[0277]步骤b)
[0278]使样品S与典型地存在于纯化柱T2中的试剂接触。
[0279]为此，由对接站1000旋转凸轮驱动致动器1100，并且将该致动器放入一个位置，以便按以下方式，相继致动阀Vl和阀V2:
[0280]-阀Vl打开并且阀V2关闭:通过对接站1000的叉形杠杆，将注射器60的活塞62滑出中央管CT，以便从样品管40栗送裂解的样品S至中央管CT;
[0281]-阀Vl关闭并且阀V2打开:通过对接站1000的叉形杠杆，将注射器60的活塞62滑进中央管CT，以便从中央管CT，注射裂解的样品S进入纯化柱T2。
[0282]纯化柱T2可以包含用于DNA结合的硅石样膜。
[0283]根据不同实施例，例如，纯化柱可以包含用于DNA结合和浓缩的凝胶、珠、或纸过滤器。作为说明，根据本发明，还可以使用琼脂糖凝胶、硅石珠和滤纸(例如纤维素)、碱纯化。
[0284]—旦结合完成，从纯化柱重新吸入样品S(阀V2打开)，并且在阀V7打开的情况下处理至废物区域，通过中央中枢CH，同时由纯化柱T2保留DNA。
[0285]步骤c)
[0286]在此步骤中，通过洗涤它，回收步骤b)生成的产物，以便去除抑制剂并且纯化DNA。
[0287]在如本申请中示例的实施例中，用一种或多种DNA洗涤缓冲液(典型地两种，如包含在功能体积T4、T5中的)依次洗涤纯化柱T2的结合膜。
[0288]为此，通过凸轮驱动致动器1100，阀V4打开(所有其他阀关闭)，并且包含在功能体积T4中的第一DNA洗涤缓冲液被中央中枢CH栗出，并且然后阀V2打开(因此，阀V4被自动关闭)，并且中央中枢CH注射纯化柱T2中的第一 DNA洗涤缓冲液。
[0289]第二，用包含在功能体积T5中的第二DNA洗涤缓冲液重复相同操作(阀V2关闭/阀V5打开并且然后阀V2打开/阀V5关闭)。
[0290]第三，用洗脱缓冲液洗脱结合至结合膜的DNA。可以将包含在扩增混合物管T3中的扩增混合物溶液用作洗脱缓冲液。为此，阀V2关闭，阀V3打开，归因于对接站1000的凸轮驱动致动器1100的旋转，并且中央中枢CH吸出扩增混合物溶液进入中央管CT中；然后阀V3关闭，阀V2打开，并且注射器60滑进中央管CT，这样使得中央中枢CH注射PCR混合物溶液进入纯化柱20中。
[0291]在步骤c)的末尾，技术人员获得分离的DNA样品。
[0292]步骤d)
[0293]在洗脱后，将分离的DNA样品扩增混合物转移进用于扩增的两个扩增室AMP1、AMP2中。
[0294]为此，将分离的DNA样品从纯化柱T2栗送(阀V2仍打开)至中央管CT中。
[0295 ] 然后，通过致动凸轮驱动致动器1100，关闭所有阀V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、VlO0
[0296]由两个标准线性致动器独立地致动的微流体盒I的阀Vll和V12打开，允许分离的DNA样品通过微通道Cl 1、Cl Ia、Cl 2、Cl 2a至两个扩增室AMPl、AMP2。
[0297]在一些实施例中，在转移至每个扩增室(AMP1和AMP2)之前，分离的DNA样品扩增混合物被转移至计量室，以便校准待注射进所述扩增室的适当体积。
[0298]步骤e)
[0299]在这一步骤期间，在已经关闭核酸扩增区域的阀Vll、V12后，使分离的DNA样品与用于扩增的试剂接触。
[0300]步骤f)
[0301]通过实现上至20个标记的非常好的灵敏性和特异性的现有技术的标准扩增方案(典型地，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR和恒温扩增的任何扩增方法)，进行扩增室AMPl、AMP2中的DNA扩增。
[0302]在每个扩增室AMPl、AMP2中，在制造过程期间，典型地已经将分开组的引物固定。当以用于DNA模板的有效扩增的最佳浓度，用典型地包含聚合酶、核苷酸和反应缓冲液的即用型溶液填充扩增室AMPl、AMP2时，重新悬浮这些引物。
[0303]在这一步骤末尾，技术人员获得扩增的DNA样品。
[0304]步骤g)
[0305]在此步骤中，将包含在功能体积VlO中的杂交缓冲液转移通过中央中枢CH至两个杂交室(也可以称为检测室)HYB1、HYB2中。
[0306]为此，对接站1000的旋转运动凸轮驱动致动器1100打开阀VlO(所有其他阀Vl至V9被关闭)，并且阀VlO被转移至中央管CT。
[0307]然后，依次打开阀V6和V8，以便必要的话，继续用杂交缓冲液预填充杂交室HYBl、HYB2o
[0308]扩增室阀被打开，并且扩增溶液被推至杂交室HYBl、HYB2。
[0309]然后当打开阀V13、V14时(典型地这些阀独立地被致动)，通过直接连接两个功能区域即核酸扩增区域和核酸杂交区域的区域连接微通道C13、C15B、C14、C16b，使扩增的DNA样品与进入杂交室HYBl、HYB2的杂交缓冲液接触。
[0310]然后，最终关闭阀V13、V14。
[0311]步骤h)
[0312]在此步骤中，样品被以这样一个方式放置为与亲和力传感器(例如生物芯片)接触，使得互补序列可以与固定的探针组合，例如通过杂交、关联或连接至探针。在消除非关联材料后，关联序列被准备好，用于检测和测量。
[0313]典型地，在此步骤中，经若干分钟，例如约30分钟，在杂交室HYBl、HYB2中，扩增的DNA样品被杂交。通过转移包含在功能体积T9中的杂交洗涤缓冲液通过中央中枢CH至杂交室HYBl、HYB2，进行杂交的DNA的回收。因此获得杂交的DNA样品。
[0314]在分析方法的变体中，可以添加在杂交末尾的DNA解链程序，并且该程序将允许检测特异性的增加。
[0315]步骤i)
[0316]在此步骤中，获得并且分析微阵列图像。应当指出，根据以下图，杂交室还可以因此称为检测室。
[0317]用光学检测装置进行靶核酸和探针之间的相互作用的检测。通过生色信号的发射，检测局部的杂交。在此，“生色信号”应被理解为在用适合的光源激发后，或化学的或酶的转化后，直接或间接发射的任何光信号。因此，以下被包括在生色信号的类别内，比色信号、光致发光信号、荧光信号、化学发光信号、生物发光信号、或其他。此类信号直接由感兴趣的分子发射，或由添加和/或接枝至其上的可检测元素(标签)发射。
[0318]因此，荧光读取器可以允许获得生物芯片表面的荧光图像。出于此目的，以激发标记靶分子的荧光团的波长，用光源照射生物芯片，并且适配的光学系统以荧光团发射的波长形成生物芯片的荧光的图像。此图像的每个点的光强涉及在生物芯片的对应点存在的荧光团的量，该量自身正比于在杂交阶段期间已经选择性附接在此位置的靶分子的数目，这使得可能收集关于样品的核酸含量的信息(通常是定量的)。如例如在文件US 7,306,766,FR 2932885、US 20050201899、PCT/FR 2011/053208中描述，优先地通过形成小型读出光学系统的接触成像，实现信号的检测。
[0319]然后生成关于生物样品的分析的微阵列图像的自动化分析和诊断报告。
[0320]很多不同配置可能在本发明的范围内，包括关于零件几何形状、材料、零件相对于彼此的装配方法和配置的变化。以上说明书意在说明并且代表本发明的一个可能的实施例，并且不应被解释为限制变化的可能范围。
[0321]例如，在图16说明的实施例中，微流体盒包括盒板2010。
[0322]在此微流体盒的盒板2010包括多个的十二个阀VVl、VV2、VV3、VV4、VV4、VV5、VV6、”7、”8、”9、”10、”1、”12、每个阀”1、”2、”3、”4、^4、”5、”6、”7、”8、”9、”10、”1、”12，这些阀位于连接至流体的中央分配中枢01的微通道0:1、0:2、0:3、0:4、0:5、0:6、CC7、CC8、CC9、CCl O、CCl 1、CCl 2上。
[0323]在此变体中，所有那些十二个阀VV1、VV2、VV3、VV4、VV4、VV5、VV6、VV7、VV8、VV9、^10、”1、”12被安排在盒板2010上的环0?上(参见图16)，以便被外部凸轮驱动致动器机械地致动。
[0324]盒板2010还包括可以由独立的线性致动器致动的两对阀”13、”14、”15、”16，以便转移流体，例如从样品制备区域至核酸扩增区域AMPl、AMP2和核酸分析区域HYBl、HYB2o
[0325]典型地在这一实施例中，该盒包括位于中央中枢和每个扩增室之间的计量室。所述计量室可以通过阀VV8和VV14被连接至所述扩增室。典型地，所述计量室还被连接至中央中枢。另外地，通过微通道，所述计量室还可以直接连接至中枢连接的微通道的阀(例如阀W9 和 W7)0
[0326]本领域技术人员将适配微流体盒的其他元件，例如盒体和盒盖，以便适配盒板2010至微流体盒的不同功能体积。
【主权项】
1.一种用于检测样品(P的至少一种核酸的微流体盒(I)，所述微流体盒(I)包括: -多个功能体积，这些^能体积分为多个功能区域，例如至少样品制备区域(Tl，T2，T3，Τ4，Τ5)、核酸扩增区域(ΑΜΡ1，ΑΜΡ2)、核酸分析区域(Τ9，Τ10，ΗΥΒ1，ΗΥΒ2)、废物区域(WST)，以及_微通道((:1，02，03，04，05，06，07，08，09，(:10，(:11，(:12，(:13，(:14，(:15，(:16，(:11&，(:12&，C15a，C15b，C16a，C16b)的流体网络， 其中: -至少三个功能区域通过一个或多个中枢连接的微通道((:1，02<3，04<5，06，07，〇8，C9，C1，C11，C12)流体地连接至流体的一个中央分配中枢(CH)，每个所述中枢连接的微通道具有中枢端和区域端，所述中央分配中枢(CH)能够将流体通过穿过所述中央分配中枢(CH)而从所述至少三个功能区域的第一功能区域栗送并且注射至第二功能区域，所述第二功能区域与所述第一功能区域是相同或不同的，并且 -各自位于中枢连接的微通道上的至少三个阀(VI，V2，V3，V4，V5，V6，V7，V8，V9，V1)被安排在所述微流体盒(I)中，这样使得所述至少三个阀(Vl，V2，V3，V4，V5，V6，V7，V8，V9，VlO)被适配为由单个外部凸轮驱动致动器(1100)机械地致动。2.根据权利要求1所述的微流体盒(I)，其中该至少三个阀(VI，V2，V3，V4，V5，V6，V7，V8，V9，Vl O)环形地安排在该微流体盒(I)中。3.根据权利要求1所述的微流体盒，其中该至少三个阀线性地安排在该微流体盒中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的微流体盒(I)，其中每个中枢连接的微通道(Cl，〇2，〇3，〇4，〇5，〇6，〇7，〇8，〇9，(:10，(:11，(:12)包括一个阀(￥1，￥2，￥3，￥4，￥5，￥6，￥7，￥8，￥9，￥10，￥11，￥12)，该阀位于所述中枢连接的微通道((:1，02，03，04<5，06<7，08，09，(:10，(:11，C12)的该区域端。5.根据权利要求1至4中任一项所述的微流体盒(I)，其中该至少三个阀(Vl，V2，V3，V4，￥5，￥6，￥7，￥8，￥9，￥10)是中枢连接的微通道((:1，02，03，04，05，06，07，08，09，(:10，(:11，(:12)的阀，这些中枢连接的微通道将该样品制备区域(1'132 33 34 35 36)、该核酸扩增区域(八1^1，41^2)、该核酸分析区域09，1'10，!^81，!^82)、和该废物区域(131')连接至该中央分配中枢(CH)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的微流体盒(I)，包括由线性致动器致动的至少一个阀(V11，V12，V13，V14)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体盒(I)，其中该多个功能区域中的两个功能区域(41^1，六1^2，了9，1'10，!^1，!^2，131')通过一个或多个区域连接微通道((:13，(:14)彼此直接流体地连接，所述区域连接微通道(Cl 3，Cl4)的每一个具有阀(Vl 3，Vl4)。8.根据权利要求7所述的微流体盒(I)，其中所述两个功能区域是所述核酸扩增区域(AMPI，AMP2)和所述核酸分析区域(T9，T1，HYBI，HYB2)。9.根据权利要求7所述的微流体盒(I)，其中所述两个功能区域是所述核酸分析区域(丁9，1'10，册81，!^82)和所述废物区域(吧1')。10.根据权利要求1至9中任一项所述的微流体盒(I)，包括: -盒板(1)，该盒板包括: -基板(100)，该基板具有第一面(101)和第二面(102)、与该第一面(101)或该第二面(102)齐平的多个凹槽(61，62，63，64，65，66，67，68，69，610，611，611&，612，612&，613&，G14a，G15，G15a，G15b，G16，G16a，G16b)、和连接所述第一面(101)和所述第二面(102)的多个通孔(111，!12，!13，!14，!15，册，!17，!18，!19，!110，!111，!112，!113，!114，!10。，!11。，!12。，!13。，!14。，H5c，H9c，H10c，H7a，H7b，Hlla，H12a，H15A，H15b，H15c，H15d，H16a，H16b，H16c，H16d)，以及 -结合在该盒板(10)的所述基板(100)的第一面(101)上的第一膜(11)，与该第一面(101)齐平的所述凹槽(61，62，63，64，65，66，67，68，69，610，611，612)由所述第一膜(11)密封以形成这些中枢连接的微通道((:1，02，03，04，05，06，07，08，09，(:10，(:11，(:12)，所述第一膜(11)是被适配为通过外部致动器(1100)变形的可变形膜， -与所述基板(100)的该第二面(102)上的该盒板(10)接触的盒体(20)，所述盒体(20)包括: -从所述基板(100)的第二面(102)延伸的侧壁(21)，以及 -多个内壁(师，￥1，￥2，￥3，￥4，耶，￥6，￥7，￥8，冊，￥10)，这些内壁限定了所述盒体(20)的多个功能体积(CT，TI，T2，T3，T4，T5，AMP，DET，WST)，以及 -适配为封闭这些不同功能体积(CT，TI，T2，T3，T4，T5，AMP，DET，WST)的盒盖(30)。11.根据权利要求1O所述的微流体盒(I)，其中该微流体盒(I)包括该盒体(20)和该盒盖(30)之间的半透膜，该半透膜被适配为让空气通过它的同时阻止液体从这些功能体积(CT，T1，T2，T3，T4，T5，AMP，DET，WST)漏出。12.根据权利要求10或11所述的微流体盒(I)，其中该盒板(10)包括结合在该盒板(10)的该基板(100)的第二面(102)上的第二膜(12)，与该第二面(102)齐平的该多个凹槽(611&，6123，6133，614&，6153，61513，6163，61613)由所述第二膜(12)密封以形成区域连接的微通道(C13，C14)。13.根据权利要求10至12中任一项所述的微流体盒(I)，其中该盒板(10)包括形成在该基板(100)中并且从该第一面(101)延伸的至少一个凹陷腔(1?1&，1?2&，1?113，1?213)。14.根据权利要求13所述的微流体盒(I)，其中结合在该基板(100)的该第一面(101)上的该第一膜(11)封闭所述至少一个凹陷腔(Rla，R2a)，以形成用于核酸扩增的至少一个反应室(AMP1，AMP2)。15.根据权利要求13所述的微流体盒(I)，其中结合在该基板(100)的该第一面(101)上的微阵列载玻片(110)封闭所述至少一个凹陷腔(Rlb，R2b)，以形成用于核酸分析的至少一个检测室(HYB1，HYB2)。16.根据权利要求10至15中任一项所述的微流体盒(I)，其中该盒体(20)的这些功能体积(CT，TI，T2，T3，T4，T5)是适配为接收管、样品(TI)、试剂产品(T3，T4，T5)、或纯化柱(T2)的容器。17.根据权利要求10至16中任一项所述的微流体盒(I)，其中流体分配的该中央分配中枢(CH)包括中枢体(CT)和活塞密封件(61)，该活塞密封件被适配为滑进和滑出该中枢体((:1')，以栗送来自所述微流体盒(1)的这些功能区域(1'132，了3 34，了5，層?141^2 39，1'10，HYBl，HYB2，WST)的流体或注射这些功能区域中的流体通过这些中枢连接的微通道(Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，Cll，C12)o18.根据权利要求17所述的微流体盒(I)，其中流体分配的该中央分配中枢(CH)包括具有活塞(62)的注射器(60)，该活塞密封件(61)附接至该活塞上。19.一种被适配为接收根据权利要求1至18中任一项所述的微流体盒(I)的对接站(1000)，包括: -适配为机械地致动中枢连接的微通道(Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，ClO，Cl I，Cl 2)的该至少三个阀(￥1，￥2，￥3，￥4，￥5，￥6，￥7，￥8，￥9，￥10)的凸轮驱动致动器(1100)， 一用于对所述微流体盒(I)的微阵列载玻片(110)进行光激发的工具，以及 一用于对代表由该微流体盒(I)分析的样品中的所述核酸的光信号进行光学检测的工具。20.根据权利要求19所述的对接站(1000)，进一步包括被适配为致动所述微流体盒(I)的其他阀(Vl I，Vl2，Vl3，Vl4)的致动工具。21.根据权利要求19或20所述的对接站(1000)，其中该凸轮驱动致动器(1100)是旋转运动致动器。22.根据权利要求19或20所述的对接站，其中该凸轮驱动致动器是线性运动致动器。23.根据权利要求19至22中任一项所述的对接站(1000)，其中该凸轮驱动致动器(1100)允许打开至多一个凸轮驱动阀(￥1，￥2，￥3，￥4，￥5，￥6，￥7，￥8，￥9，￥10)。24.根据权利要求19至23中任一项所述的对接站(1000)，包括滑动工具，该滑动工具被适配为将该中央分配中枢(CH)的该注射器(60)滑动进出该中枢体(CT)，以栗送来自所述微流体盒(I)的这些功能区域的流体或注射这些功能区域中的流体通过这些中枢连接的微通it(Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，Cll，C12)。25.—种用于分析生物样品的方法，包括以下步骤: a)将所述生物样品提供进入根据权利要求1至18中任一项所述的微流体盒的样品制备区域的至少一个功能体积中， b)通过致动控制微通道的流体流动的至少一个阀，允许所述生物样品与存在于该样品制备区域的另一个功能体积中的至少一种试剂和/或一个纯化柱接触， c)回收步骤b)生成的产物，以获得分离的DNA样品， d)将该分离的DNA样品转移至该核酸扩增区域的至少一个功能体积中， e)允许所述分离的DNA样品与用于扩增的至少一种试剂接触，并且关闭该扩增区域的功能体积的这些阀， f)进彳TDNA扩增， g)回收在步骤f)获得的扩增的DNA，并且将其通过致动控制微通道的流体流动的至少一个阀转移至该杂交区域的另一个功能体积中， h)在所述杂交室中允许所述扩增的DNA和能够与所述DNA杂交的至少一种化合物接触，并且 i)获得微阵列图像并且对其进行自动分析。
【文档编号】B01L3/00GK105828945SQ201480065075
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年11月27日
【发明人】Y·马尔西, M·阿蒂格, 夫逸 Q·雷, K·马克
【申请人】基因波公司