吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种免疫亲和搅拌棒及其制备方法，特 别是吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的发展，人们生活水平的日益提高，对各种动物源性食品的需求量 也逐渐增大，食品安全问题自然成为大家关注的焦点。近年来关于兽药残留引起的对人身 体健康造成危害的报道屡见不鲜，相关食品安全部门也致力于检测方法的研宄。由于生物 样品的成分复杂、药物与样品成分之间易互相结合和残留药物浓度低等均给样品中药物的 提取净化带来了很大的困难，因此分析方法的选择性和灵敏度直接决定了检测的成功与 否。
[0003] 免疫亲和搅拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫亲和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一种 装置形式，将固相微萃取（Solid phase microextraction, SPME)与免疫亲和色谱 (IAC, immunoaffinity chromatography)相结合，既具有SPME易于操作、使用溶剂少和节 省时间的优点，又有免疫亲和色谱高度选择性和高亲和性的特点，使SPME在兽药残留分析 中，选择性、亲和性和灵敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 样品的萃取，尤其适用于复杂基质中痕量分析物的提取，与多种检测手段结合使用进行分 析测定，具有广阔的应用前景。
[0004] 喹暗酮类药物是一类人工合成的广谱抗菌药物，包括麻保沙星（Marbof Ioxacin, MAR)、依诺沙星（Enoxacin, ΕΝ0)、诺氟沙星（Norfloxacin，N0R)、氧氟沙星（Ofloxacin, OFL)、培氟沙星（Pefloxacin，PEF)、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM)、恩诺沙星 (Enrofloxacin, ENR)、环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP)、单诺沙星（Danofloxacin， DAN)、氟甲喹（Flumequine, FLU)、奥比沙星（Orbifloxacin, ORB)、左旋氧氟沙星 (Levofloxacin, LEV)、氟罗沙星（Flerofloxacin，FLE)、司帕沙星（Sparfloxacin)和帕珠 沙星（Pazufloxacin)。
[0005] 目前，喹诺酮类药物通过抑制DNA回旋酶使细菌DNA的复制转录、DNA、RNA和蛋白 质的合成受到干扰而发挥杀菌作用。对革兰氏阴性菌、支原体、衣原体和一些革兰氏阳性菌 具有强大的杀灭作用。对喹喏酮类药物高度敏感的病原菌主要有：大肠杆菌、肺炎链球菌、 肺炎杆菌、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肠球菌、流感杆菌、绿脓杆菌等。因为其抗菌能力 强、分布广泛、吸收迅速、生物利用度高、毒性小、价格便宜和不良反应少等特点被广泛用于 治疗人类和动物的呼吸道、消化道和泌尿系统的感染。
[0006] 养殖户为了维持牲畜的健康和保证经济效益而大量使用兽药，使可食用组织中的 药物残留量明显升高，人在食用了此食品后，会引起了一些不良反应如恶心、呕吐、头痛、睡 眠不良、影响幼儿的软骨发育、光毒性反应和眼毒性等。QNs (喹喏酮类药物)在动物性食品 中的残留不但对人类健康造成巨大威胁，也不利于养殖业的健康发展和畜禽产品的出口贸 易，研宄和发展药物残留检测技术对于提高动物性食品质量，保证食品安全，增强国际贸易 竞争力，具有重要的意义。
[0007] 近几十年来，各种食品安全监测机构、各类从事相关工作的研宄人员针对食品和 饲料中QNs的残留分析进行了深入全面的研宄。目前用于QNs残留检测的方法主要有高效 液相色谱法（HPLC)、液质联用分析法（LC/MS)高效薄层色谱法（HPTLC)、毛细管电泳测定法 (CE)、气相色谱法（GC)、气质联用分析法（GC/MS)、ELISA等。Immunoaffinity SPME技术首 次于2001年被提出，用Immunoaffinity stir bar同时吸附15种QNs目前还尚未见报道， 更无商品化的Immunoaffinity stir bar出售。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种吸附15种喹喏酮药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方 法。
[0009] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶联的恩 诺沙星鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的恩诺沙星鼠单克隆抗体的偶联长度与重 量比为I cm :2 mg;所述的单克隆抗体是将单克隆杂交瘤细胞株ENR-6D2注入小鼠腹腔，纯 化小鼠腹水得到；所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有效长度为2. 5 cm。
[0010] 单克隆杂交瘤细胞株ENR-6D2的解释如下： ENR-6D2中ENR代表恩诺沙星，6代表细胞融合过程使用第6块96孔板，D2中的字母 和数字分别代表96孔板的横纵编号，96孔板中1-12为横向编号，A-H为纵向编号。D2代 表融合后的杂交瘤细胞株在96孔板中的位置。
[0011] 本发明进一步公开了免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于按如下的步骤进 行： (1)固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水：浓硫酸= (30:70，v/v)lh， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其目的是为了进行清洁和形成粗糙表面。
[0012] (2)硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇（3-氨丙基三乙氧基硅烷，有 市售。）溶液中，其中ATPES:超纯水：无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24h ; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h ; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5%的戊二醛PBS (磷酸盐缓冲液，即I L中含有0. 2 g KH2PO4,0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4. 12H20,8.8 g NaCl 的溶液。配制缓冲液时所需的试剂 均有市售。）溶液中5 h，之后用超纯水冲洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株ENR-6D2分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0· 5 mg/mL 抗体 +0· 05 mg/mL NaN3* 4°C 轻微揽样 24 h ; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3 M)去活化I h ; (7) 稳固共价键：置于？85+0.05 11^/1^似％+0.2 11^/1^恥0他!13混合溶液中4°0反应 48 h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0013] 所述的单克隆抗体PBS溶液指的是对麻保沙星、依诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、 培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、单诺沙星、氟甲喹、奥比沙星、左旋氧氟沙星、氟 罗沙星、司帕沙星和帕珠沙星15种喹喏酮药物具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株分泌 的抗体。
[0014] 本发明更进一步公开了免疫亲和搅拌棒在制备吸附15种喹喏酮类药物方面的应 用。所述吸附15种喹喏酮类药物指的是麻保沙星、依诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙 星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、单诺沙星、氟甲喹、奥比沙星、左旋氧氟沙星、氟罗沙星、 司帕沙星和帕珠沙星。
[0015] 本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的提纯方法结合色谱 法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于15种喹喏酮类药物的含量的检测， 弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低 等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
[0016]
【主权项】
1. 一种吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶联的 恩诺沙星鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的恩诺沙星鼠单克隆抗体的偶联长度与 重量比为I cm :2 mg;所述的单克隆抗体是将单克隆杂交瘤细胞株ENR-6D2注入小鼠腹腔， 纯化小鼠腹水得到；所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有效长度为2. 5 cm 〇
2. 权利要求1所述吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于按如 下的步骤进行： (1) 固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸的混合溶液中 Ih,依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其中双氧水：浓硫酸的体积比为：30:70 ; (2) 硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水：无水 乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24h ; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h ; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5h，之后用超纯水冲 洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株ENR-6D2分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5mg/mL 抗体 +0? 05 mg/mL NaN3* 4°C 轻微揽样 24h ; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih ; (7) 稳固共价键：置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反应 48h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的固相载体表面使用双氧水：浓硫酸 的体积比为30:70混合溶液进行清洁和形成粗糙表面。
4. 权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的单克隆抗体指的是对麻保沙星、依 诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、单诺沙星、氟甲喹、 奥比沙星、左旋氧氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星和帕珠沙星15种喹喏酮药物具有交叉反应 的单克隆杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
5. 权利要求1所述吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附15种喹喏酮类药 物方面的应用。
6. 权利要求5所述的应用，其中的吸附15种喹喏酮类药物指的是麻保沙星、依诺沙星、 诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、单诺沙星、氟甲喹、奥比沙 星、左旋氧氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星和帕珠沙星。
【专利摘要】本发明公开了一种吸附喹诺酮类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用。它是由固相载体和与其偶联的恩诺沙星鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的恩诺沙星鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1 cm : 2 mg。本发明的提取方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于15种喹喏酮类药物的含量的检测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【IPC分类】G01N1-34, B01J20-24, B01D15-38, G01N1-40, B01J20-30
【公开号】CN104722278
【申请号】CN201510116393
【发明人】李存, 姚凯, 杨琳燕, 张伟, 骆鹏杰, 崔君, 何建丽
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月18日