一种铁镍磁性微球、其制备方法及在蛋白质纯化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磁性微球，尤其涉及一种铁镍磁性微球、其制备方法及该磁性微球在 蛋白质纯化中的应用。
【背景技术】
[0002] 磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无 机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅 具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性，所以不仅能够通过共聚及表面改性等方 法赋予其表面功能基，还能在外加磁场作用下具有导向功能。目前，磁性复合微球已广泛用 于生物医学、细胞学和分离工程等诸多领域。
[0003] 磁性微球的粒径小，比表面积大，表面含有活性基团，故偶联容量大，它可以共价 结合能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，然后，将磁性微球直接放入含有目标蛋白质 的混合溶液中，待目标蛋白质与磁性微球紧密结合后，利用外部磁场进行分离。整个分离过 程不需对混合溶液的PH值、温度、离子强度和介电常数进行调整，从而避免了传统分离过 程中蛋白质的损失。总而言之，用磁珠分离细胞裂解液中的蛋白质，几乎不需要预先处理， 与其他方法相比，非特异性结合也较少。
[0004] 组氨酸标签已经广泛应用于蛋白质的生产过程，利用配位结合镍离子的琼脂糖凝 胶可以快速和高选择性地吸附带有组氨酸标签的目标蛋白质，提高了蛋白质的分离纯化速 度，降低了蛋白质的纯化成本，多种功能性蛋白质已经采用这种生产工艺完成了商品化生 产与应用。在这些功能蛋白质的生产过程中，配位结合镍离子的琼脂糖凝胶价格高，在分离 纯化过程中所占生产成本比重最大，因此，开发快速、高效、低成本的蛋白质分离纯化方法 一直是蛋白质产业发展的瓶颈。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种铁镍磁性微球、其制备方法及在蛋白质纯化 中的应用。
[0006] 本发明的发明构思是：配位结合镍离子的琼脂糖凝胶（Ni-NTA agarose)是蛋白 质生产中广泛应用的蛋白质分离材料，其分离原理是带有组氨酸标签的蛋白质能够识别凝 胶上的镍离子（Ni 2+)，并通过镍离子吸附结合在凝胶上，通过适宜的缓冲液将杂蛋白洗脱， 而带有组氨酸标签的蛋白质结合在凝胶上，达到分离纯化的目的。配位结合镍离子的琼脂 糖凝胶（Ni-NTA agarose)价格很高，故发明人一直在致力于如何获得更廉价的蛋白质分离 材料。
[0007] 发明人经过大量的研宄，终于制得了一种廉价的铁镍磁性微球，并直接用于带组 氨酸标签蛋白的纯化，本发明是这样实现的：一种铁镍磁性微球的制备方法，包括以下步 骤：
[0008] a.将可溶性铁盐、可溶性镍盐置于乙二醇中，加入醋酸钠，在80°C下于油浴锅中 搅拌30min ;
[0009] b.加入乙醇胺，队保护下于180-210°C搅拌反应6h，反应结束后，停止通\，自然 冷却至20-25 °C ;
[0010] c.将步骤b中得到的产物用去离子水洗涤5-7次，每次洗涤5分钟，制得水合磁性 微球；
[0011] d.将水合磁性微球依次采用体积百分比为20 %、40 %、60 %和80 %的乙醇水溶液 各清洗2次，再用无水乙醇洗涤5次，将洗涤后产物放入敞口容器中，室温干燥至乙醇完全 挥发，于80°C下真空干燥12h，得铁镍磁性微球。
[0012] 优选的，所述步骤a可溶性铁盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁或三者水合物中任意一 种。
[0013] 优选的，所述步骤a可溶性镍盐为硝酸镍、氯化镍、硫酸镍或三者水合物中任意一 种。
[0014] 优选的，原料的摩尔比为可溶性铁盐：可溶性镍盐：醋酸钠：乙二醇：乙醇胺=1 : 0· 5 ?2 :1· 3 ?2. 6 :100 ?250 :80 ?110。
[0015] 进一步的，原料的摩尔比为可溶性铁盐：可溶性镍盐：醋酸钠：乙二醇：乙醇胺= I :1 :1· 46 :235 :100。
[0016] 本发明还要求保护上述方法制备的铁镍磁性微球本身，该铁镍磁性微球为 NiFe2O40
[0017] 本发明的另一个目的是保护上述铁镍磁性微球在蛋白质纯化中的应用，铁镍磁性 微球制备后无需额外修饰可直接应用于带组氨酸标签的目标蛋白的分离纯化。
[0018] 经发明人的试验证实，本发明提供的磁性微球对带组氨酸标签的蛋白具有强结合 能力。将磁性微球与粗蛋白提取液混合，通过离心或磁铁吸附，分离出带有目标蛋白的磁性 微球，将带有目标蛋白的磁性微球用结合缓冲液清洗后，再用含有高浓度咪唑的洗脱缓冲 液将带有组氨酸标签的目标蛋白从磁性微球上洗脱下来。
[0019] 组氨酸标签用于蛋白质纯化的原理是：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨酸 含有一个咪唑基团，咪唑基团通过孤对电子与某些金属离子（特别是镍离子）配位结合。组 氨酸标签是蛋白质上6个连续的组氨酸区段，与镍离子有高度的亲和力能用于蛋白质的亲 和纯化。
[0020] 本发明的主要发明点在于：按照热分解法制备含镍磁性微球，磁性微球不经其他 修饰直接依靠磁性微球本身的镍离子吸附带有组氨酸标签的目标蛋白质而达到分离纯化 目的。磁性微球纯化组氨酸标签蛋白结合了固定化金属亲和色谱和磁性纳米粒子的优点， 既能利用过渡金属离子与氨基酸残基如组氨酸的咪唑基的配位作用，选择性地纯化对金属 离子有亲和力的蛋白质，又能充分发挥微球的磁性分离和高吸附容量优势，简单经济，快速 尚效。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1).本发明所合成的铁镍磁性微球可直 接用于纯化带有组氨酸标签的目标蛋白，无需在磁球表面进行其他修饰，如抗体修饰，依靠 磁性微球本身的镍离子直接用于蛋白质纯化。（2).本发明制得的微球有磁性，分散性好，而 且应用效果快速高效，便于分离，其结构和性质比较稳定，水溶液中保存二年仍具有良好磁 性。（3).本发明的制备方法简单、成本低、容易进行大规模工业生产。
【附图说明】
[0022] 图1磁性微球的透射电镜照片；
[0023] 图2为本发明实施例1磁性微球分散性检测结果图，其中：1、分散后的铁镍磁性微 球，2、外磁场作用下铁镍磁性微球；
[0024] 图3为本发明实施例1磁性微球XRD图谱；
[0025] 图4为表达带组氨酸标签绿色荧光蛋白的大肠杆菌的荧光显微镜检测结果；
[0026] 图5为应用例等质量的磁性微球和配位结合镍离子的琼脂糖凝胶结合细菌裂解 后上清液中带组氨酸标签绿色荧光蛋白的对比图，其中，1、蛋白质分子量标准，2、配位结合 镍离子的琼脂糖凝胶，3、磁性微球；
[0027] 图6为应用例磁性微球与配位结合镍离子的琼脂糖凝胶分离效果对比图，其中， l、〇. 5g磁性微球，2、0,1g配位结合镍离子的琼脂糖凝胶。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步说明，但不限于实施例。
[0029] 如无特殊说明，本发明所用原料均市售可得，作为优选，本发明所涉及的原料如 下：
[0030] NiSO4 · 6H20(国药集团化学试剂有限公司）、FeCl3 · 6H20(国药集团化学试剂有限 公司）、醋酸钠（沈阳化学试剂有限公司）、乙二醇（国药集团化学试剂有限公司）、乙醇胺 (国药集团化学试剂有限公司）。
[0031] 本发明所涉及的实验设备具体型号和生产厂家如下：
[0032] 磁力搅拌器（DF-101S型，巩义市英峪予华仪器厂），真空干燥箱（DZF-6020型，上 海一恒科学仪器有限公司）。
[0033] 实施例1
[0034] 表1实施例1的药品用量和产量
[0035]
【主权项】
1. 一种铁镍磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a. 将可溶性铁盐、可溶性镍盐置于乙二醇中，加入醋酸钠，在80°C下于油浴锅中，搅拌 30min ； b. 加入乙醇胺，队保护下于180-2KTC搅拌反应6h，反应结束后，停止通\，自然冷却 至 20-25°C ; c. 将步骤b中得到的产物用去离子水洗涤5-7次，每次洗涤5分钟，制得水合磁性微 球； d. 将水合磁性微球依次采用体积百分比为20 %、40 %、60 %和80 %的乙醇水溶液各清 洗2次，再用无水乙醇洗涤5次，将洗涤后产物放入敞口容器中，室温干燥至乙醇完全挥发， 于80°C下真空干燥12h，得铁镍磁性微球。
2. 根据权利要求1所述的一种铁镍磁性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤a可溶 性铁盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁或三者水合物中任意一种。
3. 根据权利要求1所述的一种铁镍磁性微球的制备方法，其特征在于，所述步骤a可溶 性镍盐为硝酸镍、氯化镍、硫酸镍或三者水合物中任意一种。
4. 根据权利要求1所述的一种铁镍磁性微球的制备方法，其特征在于，原料的摩尔比 为可溶性铁盐：可溶性镍盐：醋酸钠 ：乙二醇：乙醇胺=1 :〇. 5?2 :1. 3?2. 6 :100?250 : 80 ?IlO0
5. 根据权利要求4所述的一种铁镍磁性微球的制备方法，其特征在于，原料的摩尔比 为可溶性铁盐：可溶性镍盐：醋酸钠：乙二醇：乙醇胺=I :1 :1. 46 :235 :100。
6. -种铁镍磁性微球是按照权利要求1所述方法制备而得，其特征在于，铁镍磁性微 球为 NiFe2O4。
7. 按权利要求1所述的方法制得的铁镍磁性微球在蛋白质纯化中的应用，其特征在 于，铁镍磁性微球制备后无需额外修饰可直接应用于带组氨酸标签的目标蛋白的分离纯 化。
8. 根据权利要求7所述的铁镍磁性微球在蛋白质纯化中的应用，其特征在于，包括以 下步骤：将磁性微球与粗蛋白提取液混合，通过离心或磁铁吸附，分离出带有目标蛋白的磁 性微球，将带有目标蛋白的磁性微球用结合缓冲液清洗后，再用含有高浓度咪唑的洗脱缓 冲液将带有组氨酸标签的目标蛋白从磁性微球上洗脱下来。
【专利摘要】本发明提供了一种铁镍磁性微球、其制备方法及在蛋白质纯化中的应用，涉及磁性微球领域。本发明将可溶性铁盐、可溶性镍盐置于乙二醇中，加入醋酸钠于80℃下搅拌30min，再加入乙醇胺，在氮气保护下180-210℃反应6小时，降至室温后充分洗涤即得到铁镍磁性微球，所合成的镍铁微球能够直接用于纯化带有组氨酸标签的目标蛋白，本发明制得的磁性微球便于分离，结构和性质比较稳定，成本低，而且本发明的制备方法简单、容易进行大规模工业化生产，本发明为带组氨酸标签蛋白质的纯化提供了一个相对快速和易于使用的方法。
【IPC分类】B01J20-28, B01J20-06, B01J20-30, C01G53-04, B01D15-38, C07K1-22
【公开号】CN104607143
【申请号】CN201510064372
【发明人】刘宝全, 张艳梅, 范圣第
【申请人】大连民族学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月6日