专利名称：真菌细胞壁结构性多糖及其制备方法和用途的利记博彩app
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本发明涉及用作吸附带负电物质、吸附重金属离子和用作生物体的吸附固定化载体的真菌细胞壁结构性多糖及其制备方法。
几丁质或壳聚糖是结构类似于纤维素的胺基多糖生物聚合物，由于它们具有丰富的自由胺基和凝胶性的特性，被广泛用作生物吸附剂，重金属离子吸附剂和包埋固定化载体，其不足之处在于几丁质含自由胺基含量少，吸附量小，性能差于壳聚糖；但壳聚糖易溶解于有机溶剂和酸性溶液，故作为生物吸附剂，其操作稳定性较差，也无法再生利用；在用作重金属离子吸附时，为提高操作稳定性，需通过交联或螯合，虽可使稳定性有所提高，但同时也失去了部分自由胺基，致使吸附量下降，还增加了成本；而利用凝胶性，用作酶、微生物或动植物细胞的包埋固定化载体，存在着传质阻力大，不利于氧和其他营养物质的及时供应(Scott，R.T.et al，Enzyme Micro.Technol.，10151-155，1988)，固定化细胞内的细胞增殖会使固定化细胞破裂，导致细胞渗漏等缺点；此外，几丁质或壳聚糖大都从虾蟹等甲壳纲动物的壳中制备而得，不仅原料来源受虾、蟹生长周期、季节、气候条件、捕捞量等因素制约，且在制备过程中需强酸强碱以及高温的作用，耗能巨大还会造成环境污染。
鉴于上述，本发明的目的是提供一种吸附量大、吸附力强、不溶于酸碱、稳定性好、易再生的真菌细胞壁结构性多糖。
本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的真菌细胞壁结构性多糖的方法。
本发明还有一个目的是将本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂、重金属离子吸附剂和生物固定化载体的应用。
本发明的真菌细胞壁结构性多糖是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，用下述方法得到1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；得到在中性或酸性溶液中呈正的表面电势的真菌细胞壁结构性多糖。这种真菌细胞壁结构性多糖以胺基已糖—葡聚糖为主，通常，为使其具有好的吸附性能，而使它的自由胺基含量不低于0.8％(重量)为好，折合成胺基己糖(几丁质或壳聚糖)不低于8％(重量)。
本发明提供的制备真菌细胞壁结构性多糖的方法是，以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，包括以下步骤1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；对于真菌菌丝体，一般来讲，真菌细胞壁通常含胺基己糖(壳聚糖和几丁质)，但以接合菌纲(如毛霉属、犁头霉属、根霉属)、子襄菌纲(黑曲霉、青霉)、担子菌纲和半知菌纲真菌细胞壁为多，其它真菌则含量较少。这些真菌可以按普通培养法进行液体悬浮培养。培养基可以是天然的(土豆汁培养基)，也可以是半合成的(蛋白胨或牛肉浸膏等加葡萄糖或蔗糖)，亦可以是完全合成培养基(碳源以葡萄糖或蔗糖或糖蜜为主，氮源以硝酸铵或硫酸铵或硝酸钠为主，再加维生素)。在温度32～37℃，通气量0.5～2.0vvm及转速300～500rpm的通气搅拌罐中，经过3～5天的培养，菌丝体得到大量繁殖。用金属丝网收集发酵液中的菌丝体。此菌丝体可用作细胞壁的原材料。当然，亦可直接采用工厂出来的真菌(如黑曲霉、米根霉及青霉等)菌丝体废料。
物理破碎可采用传统的机械法，如研磨，沙振动及高速剪切法，也可以采用超声波法及冷冻破碎法。破碎程度以100微米以下为好，这样能保证以后物化处理的完全性。破碎以后，菌丝体用水冲洗，使原生质去除干净。
2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；醇可以采用50％(v/v)的甲醇、乙醇，但以乙醇为优。去类脂效果以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。
3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；碱溶液是可溶性的氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或氨水。所用碱浓度取决于具体的真菌种类。对于根霉、梨头霉及毛霉，碱浓度以0.2～2.0N为优，而对于曲霉及青霉，碱浓度以2.0～6.0N为优，一般也以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。若采用酶，则可用蛋白酶来除蛋白质，核酸酶来除核酸。
4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；这样就可使自由壳聚糖结合于网状的细胞壁结构性多糖络合物上。
双官能团试剂可以是戊二醛、甲醛、环氧氯丙烷及甲苯二异氰酸酯等，一般，用量为5～20％(重量)，在室温下反应四小时后除去交联剂。若交联反应发生在自由胺基上，会使吸附性能大大下降，则可采用在交联反应前加入苯甲醛先进行自由胺基保护，交联反应后再用稀盐酸除去苯甲醛。因该交联发生在温和的条件下，一般情况下不需要胺基保护这一步骤。
所得真菌细胞壁结构性多糖可以长期保存在2％醋酸溶液中直接使用。若需用于上柱操作，可以通过挤压造粒及干燥后以备用，其颗粒直径以1～2mm为宜，保证兼有好的机械强度与传质性能。
本发明的真菌细胞壁结构性多糖含有相当多的自由胺基，并保持了细胞壁的多孔网状结构，它在中性或酸性溶液中呈正的表面电势，所以对带负电有机物、对重金属离子具有很好的吸附性能，此外，它不溶于酸碱溶液，具有很好的稳定性，易再生使用。
用发明的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂很容易吸附带负电的有机物或高分子物质，如蛋白质(包括酶与激素等)、核酸。由于该细胞壁结构性多糖长链上有多个吸附位点而且极为柔软易形变，在吸附的同时又能起架桥作用，这双重的作用使细胞壁结构性多糖非常有利于将悬浮颗粒去除。除此，发明的真菌细胞壁结构性多糖是天然吸附剂，不含任何有毒化学物质，特别适合于处理食品的后加工工序，如澄清饮料等。还可用于食品行业的废水处理，如鱼粉废水及屠宰废水等。当吸附了蛋白质等两性物质的真菌细胞壁结构性多糖与原溶液分离后，在搅拌的情况下用稀酸(如醋酸)或稀碱处理细胞壁结构性多糖时，吸附了的蛋白质便重新溶解到稀酸或稀碱溶液中，通过过滤或离心法将细胞壁结构性多糖与蛋白质溶液分开，就可被完全再生。
真菌细胞壁结构性多糖作为重金属离子吸附剂应用，吸附容量大，易再生。因为它主要由壳聚糖与葡聚糖络合物组成而不含其它易腐败物质，所以更易于保存与操作。
用本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为微生物或动植物细胞或酶的生物固定化载体，只需将载体放于含被固定的细胞或酶液中，轻微搅拌后，静置即可得到固定化细胞或酶。由于这些生物体带负电，很易被表面带正电的真菌细胞壁结构性多糖所吸附。载体与所固定的细胞或酶之间的结合力比较强，使固定化细胞或固定化酶能稳定于离子强度高及酸碱溶液中，并能承受激烈的搅拌环境。
以下实例将进一步说明本发明，但它们不是对本发明的限定。实例中，将真菌细胞壁结构性多糖简称为细胞壁结构性多糖。
本发明的真菌细胞壁结构性多糖的制备方法实例实例1将黑曲霉、毛霉、犁头霉及米根霉分别培养在蔗糖含量为10％的土豆汁培养基。在温度35℃，通气量1.0vvm及转速300rpm的通气搅拌罐中，经过4天的培养后，菌丝体用金属丝网收集。菌丝体用水冲洗，再置于高速破碎机中剪切6分钟。此破碎过的菌丝体用水充分淋洗，在光学显微镜下检查可见菌丝体内已无原生质。然后用乙醇萃取细胞壁半小时后，再用2.0N的氢氧化钠溶液进行两次脱蛋白质的处理，醇洗或碱洗，其温度均为50℃，搅拌转速均为300rpm。然后，用水洗至中性后，过滤，再经5.0％(重量)戊二醛交联，室温下进行交联反应四小时后，反复用蒸馏水洗去交联剂，最后得到的细胞壁结构性多糖贮存在2％的醋酸溶液中。胺基含量用酸碱法测定，表面电势用微电泳仪测得。由四种菌种培养并经物化得到的细胞壁结构性多糖，其性能见表1。表1
从以上结果可知，按表面电势及自由胺基含量来看，米根霉最为理想，胺基含量亦不低。
实例2采用乳酸生产厂得到的米根霉菌丝体为处理对象。除破碎时间和交联外，其它物化处理同实例1。交联剂选择10％(重量)甲苯二异氰酸酯，室温下进行交联反应四小时后，用丙酮洗去交联剂。随破碎程度的不同，最后得到的产品，其胺基含量及表面电势亦有所不同。结果见表2。表2
<p>本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂应用实例实例3选择一种吸附剂(活性炭)和四种絮凝剂(阳离子聚丙烯酰胺、阴离子聚丙烯酰胺、壳聚糖和ST)，与细胞壁结构性多糖(毛霉细胞壁结构性多糖，制备同实例1)作比较，以结晶牛血清白蛋白(BSA)溶液为研究对象，比较其澄清效果。溶液pH为6.5，BSA浓度分8％和4％两种。分别加入一定量絮凝剂和吸附剂到该BSA溶液，使溶液中絮凝剂浓度均为6.0mg/l左右，吸附剂浓度为12.0mg/l。BSA溶液浓度测定采用Folin-Lowry法。蛋白质去除率由下式计算去除率(％)＝100×(处理前BSA浓度-处理后BSA浓度)/处理前BSA浓度。四种絮凝剂与两种吸附剂的处理效果见表3。细胞壁结构性多糖的澄清效果接近于阳离子聚丙烯酰胺，而优于其它絮凝剂和吸附剂。表3
实例4同实例3的细胞壁结构性多糖作吸附剂来吸附BSA溶液，BSA溶液浓度仍为8％，溶液pH为6。该吸附剂重复使用，每使用一次进行再生。再生过程如下将吸附完成后的BSA-细胞壁结构性多糖沉降物置于50毫升的0.2N的醋酸溶液中，以400转/分的搅拌速率搅拌15分钟，过滤，细胞壁结构性多糖再用醋酸溶液处理一遍，过滤，用去离子水淋洗多遍，直至细胞壁结构性多糖呈中性。细胞壁结构性多糖的再生使用情况见表4。表4
细胞壁结构性多糖在吸附BSA溶液时重复使用情况良好。若采用絮凝剂进行澄清则无此性能。实例5所用细胞壁结构性多糖用米根霉菌丝体制备而成(见实例1)，果汁溶液是通过将去皮橘子用高能搅拌机搅拌4分钟后，经八层纱布过滤而成。果汁悬浊液浓度测定是由其浊度(稀释成极稀溶液的浊度)来表示的。浊度采用751分光光度计在680nm处测定。此处，澄清率是由下式来计算果汁的澄清率(％)＝100×(处理前浊度-处理后浊度)/处理前浊度。仍然采用实例3四种常规絮凝剂和活性炭与细胞壁结构性多糖相比较，果汁溶液的澄清结果见表5。表5
结果发现细胞壁结构性多糖是最好的，而且随溶液越稀，其澄清效果就越好。这儿果汁溶液浓度较高，可以预测实际处理中的澄清效果更佳。实例615克黄土溶于100毫升水中，置于高能搅拌机搅拌4分钟，静置2小时，过滤，其上清液即为泥土浑浊液。浑浊液浊度及去除率均按例4计算。细胞壁结构性多糖(米根霉细胞壁结构性多糖，制备同实例1)与其它四种絮凝剂及活性炭对泥土浑浊液的澄清效果见表6。表6
结果发现细胞壁结构性多糖的澄清效果最好，并随浓度越稀效果越好。细胞壁结构性多糖具有的多孔吸附性能捕集泥土颗粒，既优于常规吸附剂又强于常规絮凝剂。
本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为生物固定化载体的应用实例实例7啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae属)培养在如下培养基中葡萄糖150g/l，蛋白胨1g/l，尿素2g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，柠檬酸2.0g/l。培养2天后，发酵液离心分离，酵母沉降后，倾去上清液，然后用无菌去离子水清洗，离心分离除去上清液，共洗涤三次，将分离好的酵母分两部分，一部分用来测量含水率，另一部分(已知湿重量)直接与杀过菌的0.01M磷酸缓冲液混合，使100毫升该悬浊液含酵母0.25克(干重)。然后，按一定比例分别移取上述悬浊液和米根霉细胞壁结构性多糖(见实例1，用量为5.0mg/ml)于250毫升烧杯中，并加入适量的磷酸缓冲液，完全混合，出现沉降物。静置片刻，离心分离得到固定化的啤酒酵母，也就是酵母与细胞壁结构性多糖的吸附沉降物。
在吸附前后各取5毫升酵母溶液，用滤纸过滤。滤液的浊度用500nm处的吸光度来表示。那么，酵母的固定化分率可表示为固定化分率(％)＝100×(吸附前溶液的吸光度-吸附后溶液的吸光度)/吸附前溶液的吸光度啤酒酵母的固定化中，配比对固定化率的影响见表7。表7<
>从上表看出，在配比为0.5～2.0范围内，细胞能被彻底固定化，而且，搅拌的激烈程度对固定化影响不大。当配比再增加时，细胞固定化率略有下降。说明细胞壁结构性多糖作固定化载体具有相当大的负载量。
将制备得到的固定化啤酒酵母分别置于离子强度大的溶液，酸碱溶液及激烈搅拌环境中，都能相当稳定。细胞壁结构性多糖作酵母的固定化载体具有很好的应用前景。实例8用米根霉菌丝体制备的细胞壁结构性多糖(见实例1)来固定化植物细胞。这儿，采用紫草细胞为研究对象。植物细胞在培养过程中有聚集成团生长的趋势。在本培养体系中紫草细胞形成直径约2～8mm的细胞团颗粒。任何固定化方法均要求使用直径在1mm以下的细小细胞团。因此进行固定化前必须首先对细胞加以分散。细胞形成团块的原因是由于细胞在生长过程中分泌的果胶类物质将细胞彼此粘连在一起，因此采用果胶酶对果胶加以分解可以在不破坏细胞活性的情况下使细胞团得以分散。酶解条件果胶酶(E.Merk公司，1.0μ/mg)，配制浓度为2.5g/L的酶液；pH5.6的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；温度26℃；摇床转速70rpm。取培养8天的细胞进行酶解，36hr后将细胞悬液用0.7mm不锈钢网筛过滤，除去大颗粒细胞团，以直径小于0.7mm的紫草细胞进行后步的固定化操作。具体操作如下在无菌情况下，称取一定量经酶解分散的紫草细胞，放在装有无菌水的烧杯中，同时取保存在5％醋酸溶液中的真菌细胞结构性多糖置于0.1mm不锈钢网筛上用无菌水冲洗至中性，取出细胞量的5％(质量百分比)的结构性多糖放入上述细胞溶液中，用玻璃棒轻微搅拌1.5分钟，静止5分钟，固定化完成，最后将固定化细胞转移至培养基中，进行固定化培养。
固定化分率用固定化了的细胞与固定化前细胞的百分含率来表示，则达99.8％。紫草细胞很易被细胞壁结构性多糖所固定。
固定化培养采用含2.0g鲜重经酶解的分散细胞的固定化细胞，各接种于装有50mL培养基的150mL的三角烧瓶中，在培养基中添加10mL液体石蜡。培养基接种后将三角烧瓶置于转速为70r/min的摇床上，在26℃黑暗条件下进行振荡培养。对紫草细胞进行吸附固定化培养，并结合了原位萃取技术(液体石蜡-培养基双液相培养)，紫草宁的产率为0.882g/g干重细胞和1.067g/g干重接种细胞，分别为无原位萃取的悬浮培养的12.2倍和6.1倍。实例9细胞壁结构性多糖仍按实例1方法制备，只是碱洗浓度分若干等级。用相应的犁头霉细胞壁结构性多糖来固定紫草细胞。固定化方法同实例8。碱洗浓度与紫草细胞固定化分率的关系见表8。表8
碱浓度以1.25N为最适浓度，偏高或偏低皆不利于紫草细胞的固定化。碱浓度偏低，则碱洗过程中未能脱去胞壁蛋白质，使表面电势下降，不利于细胞固定化。碱浓度偏高，则影响细胞壁结构性多糖的天然网状空间结构，而不利于吸附的进行。实例10对铜绿假单胞杆菌的吸附固定化并进行培养。铜绿假单胞杆菌(购于上海微生物研究所)能产鼠李糖脂。鼠李糖脂是一种生物表面活性剂，水解可得到鼠李糖。所用培养基组成为甘油4g/l；NaNO3 3g/l；Na2HPO4·12H2O 2g/l；KH2PO4 3g/l；MgSO4 0..4g/l；pH 6.0.以实例2中的细胞壁结构性多糖为载体进行铜绿假单胞杆菌的直接固定化。将0.5克(干重)的载体直接放入培养了四天的杆菌培养液中，轻轻晃动，迅即出现杆菌与载体的沉降物。对固定化前后的培养基进行浊度分析，杆菌的固定化分率计算同例7，其值为80.2％。然后在无菌条件下，固定化细胞经70目网筛过滤，用无菌去离子水冲洗，将此固定化了的铜绿假单胞杆菌置于放有100毫升培养基的摇瓶中进行固定化培养。培养六天后，对培养液中的鼠李糖脂分析，结果为1.65克鼠李糖/升培养基或5.8克鼠李糖脂/升培养基。
本发明的真菌细胞壁结构性多糖作为重金属离子吸附剂的应用实例实例11采用细胞壁结构性多糖对重金属离子(铜、镍、铬及铁离子)的吸附。细胞壁结构性多糖所具有的胺基能与重金属离子发生螯合作用，吸附溶液中的重金属离子。实例2中的破碎程度为100μm细胞壁结构性多糖经挤压造粒，干燥成1毫米左右的颗粒。吸附是在250转/分的装有100毫升重金属离子溶液的250毫升摇瓶中进行。其中，吸附时间为6小时。重金属浓度采用分光光度法测定，细胞结构性多糖与其它生物吸附剂相比较的吸附量见表9。平衡吸附量的计算式如下平衡吸附量＝(吸附前重金属离子浓度-吸附后重金属离子浓度)/细胞壁结构性多糖用量。表9
真菌菌丝体的胞壁含丰富的几丁质或壳聚糖，该几丁质或壳聚糖与葡聚糖构成细胞壁的空间网状结构，因而从真菌胞壁得到的细胞壁结构性多糖既有丰富的吸附官能团又有很好的稳定性。因此，细胞壁结构性多糖对重金属离子的吸附量比其它生物吸附剂要高得多。可见，真菌细胞壁结构性多糖具有很高的吸附容量。
权利要求
1.真菌细胞壁结构性多糖，其特征是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，用下述方法得到1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶液去除交联剂；得到在中性或酸性溶液中呈正的表面电势的真菌细胞壁结构性多糖。
2.按权利要求1所述的真菌细胞壁结构性多糖，其特征是它的自由胺基含量不低于0.8％(重量)。
3.权利要求1所述的真菌细胞壁结构性多糖的制备方法，其特征是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，包括以下步骤1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶液去除交联剂；
4.按权利要求3所述的制备方法，其特征是对真菌菌丝体的物理破碎程度在100微米以下。
5.按权利要求3所述的制备方法，其特征是醇洗的温度为40～60℃，搅拌速度为200～500转/分。
6.按权利要求3所述的制备方法，其特征是用碱溶液除去细胞壁蛋白质及核酸的温度为40～60℃，搅拌速度为200～500转/分。
7.按权利要求3所述的制备方法，其特征是在交联反应前加入苯甲醛，交联反应后再用稀盐酸除去苯甲醛。
8.按权利要求3所述的制备方法，其特征是所说的真菌菌丝体是根霉、犁头霉及毛霉真菌菌丝体，用于去除蛋白质及核酸的碱浓度为0.2～2.0N。
9.按权利要求3所述的制备方法，其特征是所说的真菌菌丝体是曲霉及青霉真菌菌丝体，用于去除蛋白质及核酸的碱浓度为2.0～6.0N。
10.用真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂或重金属离子吸附剂或生物固定化载体。
全文摘要
本发明涉及用作吸附带负电物质、吸附重金属离子和用作生物体的吸附固定化载体的真菌细胞结构性多糖,它是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料,通过破碎,醇洗,碱洗及加双官能团试剂交联等一系列物化处理得到的,在中性或酸性溶液中呈正的表面电势,含有相当多的自由胺基,并持有天然的多孔网状结构,其吸附量大,吸附力强,又不溶于酸碱溶液,具有很好的稳定性,易再生使用。
文档编号B01J20/22GK1273249SQ99104670
公开日2000年11月15日 申请日期1999年5月6日 优先权日1999年5月6日
发明者孟琴, 吕德伟 申请人:浙江大学