肝素官能亲合性载体的利记博彩app

专利名称：肝素官能亲合性载体的利记博彩app
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本发明涉及表面具有酰肼官能配位体的聚合物和由这一类酰肼官能高聚物制备的肝素官能高聚物，和这两种高聚物的制备及使用方法。发明背景固定化肝素在以生物活性物质的纯化、制备、分离和检测为目的的亲合层析中被广泛用作配位体。利用多种已知方法可将肝素固定在固相载体上用于层析。可参见，例如，G.Mitra，E.Hall和I.Mitra的“固定化肝素在人抗凝血酶III的分离中的应用”，Biotechnologyand Bioengineering，Vol.XXVIII，pp.217—222(1986)。
东德专利No.276,814Al描述了在pH小于或不大于3.8的水性缓冲液中，非衍生肝素与酰肼-衍生的聚丙烯酰胺颗粒的偶联。该专利将偶联效率的提高、偶联连接的较高的稳定性和载体较高的机械强度归因于它所用的方法。但是，它所提出的载体的机械稳定性仍然较差，而且不适用于所期望的多用途和高流速的大规模分离过程。另外，用于制备载体的酸性条件会导致肝素分子的某种程度的脱硫和水解，这样会减低它用于亲合层析生物特异性和效用。
美国专利NO.5,116,962描述了一种将衍生后的肝素与含有活性氨基的物质偶联的方法。但是，这种方法需要使用碱金属硼氢化物来生成偶联产物。这类硼氢化物昂贵、有毒而且危险，并被认为对环境有害。而且，制造这种肝素官能载体产物的反应时间非常长，以12至16天为宜，这使之成为一个生产率很低的方法。
所以，可以看到，为提供改进型肝素官能亲合层析载体而进行的现有努力不很成功，期望着有更好的载体和方法。
肝素官能亲合层析载体之用于抗凝血酶III的纯化是为人所熟知的(参见，如，美国专利No.3,842,061)，而且是为提供治疗用抗凝血酶III所选用的方法。由于抗凝血酶III是用于心血管疾病治疗中一种非常重要但却十分昂贵的物质，其分离和纯化方法上的任何重大改进都具有重要的潜在价值。本发明的目的之一就是要提供生成纯抗凝血酶III和带有对肝素具特异亲合性基团的其它分子，即肝素-相互作用分子的组合物和方法。发明概述虽然多年前就已知使用固定化肝素的优点，但是现有方法和已被报道或销售的产品中仍存在许多缺点。
所以需要改进型的载体，它具有a)肝素与载体的高偶联效率；b)偶联肝素的化学键的高稳定性；c)具有高生物活性的肝素配位体；d)除靶分子外的其它分子与肝素或载体基质的低非特异性结合；和e)肝素官能亲合层析载体对用于去除与肝素或载体结合的非靶蛋白的试剂的高稳定性。
本发明提供了改进型肝素官能高聚物和衍生自吖内酯官能高聚物的酰肼官能高聚物。
更具体地说，本发明提供了改进型肝素官能亲合层析载体。这种载体以衍生自吖内酯官能载体的酰肼官能载体为基础。本发明载体具有靶分子与肝素官能载体间极高的结合效率，稳定的偶联键，使肝素变性减到最小的温和反应条件和对用于从肝素载体上去除非靶分子对碱的高稳定性。
广义地说，本发明还描述了一种提供肝素官能表面的方法，它包括与肼反应衍生吖内酯官能的高聚物表面以提供酰肼，和再与肝素反应来进行衍生。
广义地说，本发明还描述了一种令肝素-相互作用分子与肝素官能表面进行反应的方法，它包括提供一个表面(该表面为一吖内酯官能高聚物，该高聚物与肼反应进行衍生以形成酰肼后再与肝素反应衍生该酰肼)和令该表面与肝素-相互作用分子接触。
上述“表面”一词广义地定义为物质的外部或顶端界面。
“肝素”一词在此申请中全文通用并包括了天然肝素、衍生肝素、肝素盐、低分子量肝素、会与酰肼官能团反应的各种化学改性肝素和合成的类肝素分子。本领域熟练技术人员都明白，羰基官能肝素和羰基官能类肝素分子都具有本发明的部分或全部优点。在本发明大多数实施例中所用的肝素是购自Diosynth Laboratories Inc.，(Chica-go，IL)的醛官能的肝素钠。其它适用的可购得的肝素可购自SigmaChemical Co.，Calbiochem，和Scientific Protein Laboratories。
本发明提供了分离和纯化生物活性靶分子的改进方法。更具体地说，描述了一种具有极大改进的纯化抗凝血酶III的方法。具体描述以1989年10月4日在美国申请的U.S.Serial No.07/335,835为基础的欧洲专利No.0392,735A2描述了可用于包括提供生物活性载体在内的多种目的的吖内酯官能高聚物的应用。本发明中用于酰肼官能的活性高聚物，例如聚合载体，可通过诸如欧洲专利No.0392,735A2所描述的那些已知的吖内酯官能高聚物，例如聚合物载体，与肼反应来制备。反应在极温和的条件，例如，在环境温度(约25℃)下进行并迅速达到完全(如，1至24小时，在实验室条件下则以1至3小时为宜)。
用于本发明的一种优选载体是可购自3M，St.Paul，MN.的EmphazeBiosupport Medium AB 1。这种生物载体介质是由可购得的亚甲基二(丙烯酰胺单体)和上述欧洲专利中概要描述的2-乙烯基-4，4-二甲基吖内酯制备的。
该反应通常在水(优选)和/或非反应性溶剂中进行。宜使用过量的肼。如果要求加速反应则可采用温热，但是外部温热通常是不需要的。虽然该反应通常以吖内酯官能的珠形式进行，但吖内酯官能高聚物并不必须是珠形式的，而可以是如膜、片、隔膜、带涂层的隔膜、包含有机或无机底基的其它带涂层结构等任何其它形式。1991年10月11日申请的美国专利07/776,601，1992年6月9日申请的美国专利07/896,107，PCT公开WO93/06925描述了吖内酯官能膜和片。本发明所用的吖内酯官能高聚物载体也可以原位制备后再与肼反应。
虽然如本文所述，酰肼官能高聚物特别有用于与肝素的反应，酰肼基团也有助于与其它带醛基的分子和带酮基的分子发生反应。
本发明的酰肼官能高聚物可根据已知方法(参见，如，欧洲专利0392,735A2和美国专利07/776,601及07/896,107)制成载体和其它有用的形式，如珠、膜、片、隔膜、或有机或无机底基上的涂层。
衍生自吖内酯官能高聚物载体的酰肼官能活性载体的制备可利用以任何已知的具有结构式I所示吖内酯官能团的吖内酯官能载体为基础的活性载体进行 结构式I其中，R1和R2相互独立地为具有1至14个碳原子的烷基，具有3至14个碳原子的环烷基，具有5至12个环原子的芳基，具有6至26个碳原子和0至3个S，N，和非过氧化O杂原子的芳基，或者，R1和R2以及与它们相连的那个碳原子连成一个具有4至12个环原子的碳环，n是整数0或1，Su表示载体。
吖内酯官能载体与肼的反应生成结构式如下的酰肼官能载体 其中R1、R2和n同上文结构式I中所述。
通过R1和R2为甲基而n为0的结构式I所示的吖内酯与肼反应生成如下所示的酰肼官能活性载体来制备优选的载体基团。 上述酰肼官能活性载体在很温和的条件下，例如在环境条件(如25℃)、在缓冲溶液中，与肝素反应以形成肝素与酰肼基团间的共价连接。适用的缓冲液提供了一个5至10的pH范围，如它们是含或不含硫酸钠类的盐的乙酸钠、磷酸钠和碳酸钠。反应速度相当快，虽然少量反应持续较长时间，如可长达144小时，但通常在100小时内基本达到完全。反应时间最好是24至72小时或更少。如果需要，可通过加热来加速反应。
用于形成本发明肝素官能亲合层析载体的肝素含有如醛基之类的活性羰基。含有醛基的肝素制剂可以购得，而且其中的某一些无需进一步处理而可直接用于与酰肼官能活性载体的反应。或者，可通过本领域所述的简单的肝素氧化作用，例如利用某种过氧酸盐来增加所购得的天然肝素中的羰基数量。某些购得的肝素制剂进行了化学改性以增加醛基数量。
酰肼官能载体与肝素的反应生成结构式如下的肝素官能载体，其中的Hep是一个肝素残基。 它或者可以被还原成 其中R1、R2和n同上述结构式I中所述。
优选产物如下所示 另一种产物如下所示，其中肝素连接键中的双键被以与硼氢化钠反应之类的常规方法所还原。 以本发明方法制备的肝素官能高聚物的使用形式可以是诸如膜、隔膜、带涂层的隔膜、珠或片或诸如有机或无机载体等任何合乎需要的载体上的涂层等任何合适的形式，但最合适的是以珠形式用于亲合柱层析。
以上述及本文实施例中所述的方法制备的肝素官能珠呈装在常规的玻璃、金属、或塑料层析柱中的浆状物，并用缓冲液如用购得的处于或接近于中性pH(如pH7.4)的三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液(其中通常加有例如0.1至0.5M，最好是0.15M氯化钠)平衡。然后先用一定体积的含0.15M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液(进样缓冲液)，再用等体积的含4.0M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液，最后用等体积的进样缓冲液盐洗该珠柱。
得自美国红十字会的纯抗凝血酶III(AT III)被用来测定柱对该物质的容量。由于柱中珠子上的肝素装载量，与在相同条件下容量为3.86的购得的层析柱相比，可观察到高达11.10mg/mL的肝素容量。
本发明肝素官能亲合层析载体有助于大规模地用于生产大型柱中工业用量的AT III。
本发明肝素官能亲合层析柱还被发现可用于纯化人生长因子。
已知肝素官能层析载体会逐渐被非靶分子如蛋白质之类的分子所污染。据说，这种非靶分子会发生非特异性结合从而逐渐封闭肝素结合位点。本发明载体被发现，与某些购得的载体相比，明显地不易于发生非特异性结合，即本发明载体具有低非特异性结合率。通常用有机或无机碱来从肝素载体上清除非特异性分子。优选使用无机碱，因为它们较易从靶分子上被去除。本发明载体被发现在用如氢氧化钠水溶液之类的无机碱洗涤时表现出极好的稳定性，用0.1N的氢氧化钠水溶液洗涤时可保留大于90％的结合容量，当用1.0N的氢氧化钠水溶液洗涤时可保留大于80％结合容量。
以下实施例被用于说明本发明，而不是象权利要求那样对本发明进行限定。实施例1由亚甲基(二)丙烯酰胺聚合物上的吖内酯官能团衍生而来的酰肼官能珠的制备称取3.0g具有以下结构式所示反应单元的吖内酯官能珠 其中的Su代表聚合物载体介质(亚甲基二丙烯酰胺)，它可根据公开为欧洲专利0392,735A2的美国专利申请No.335,835中的实施例4E的方法加以改动(将在下文实施例2中加以描述)来制备并可以EmphazeBiosupport Medium AB 1购自3M Company，加入一50mL的离心管中，并加入30mL 64％的肼水溶液。在加入过程中略微温热混合物以引发反应并在一旋转混合仪上搅拌2小时。然后过滤分离出珠子，用蒸馏水反复洗涤直至洗出液根据pH试纸测定为中性，将珠子保存于冰箱中。实施例2酰肼官能珠的另一制备方法将由348mL庚烷，188mL甲苯和0.13g欧洲专利申请0392,735A2的实施例4E中所述的聚合物稳定剂组成的有机溶液搅拌加热至35℃。于氮气氛并搅拌条件下在该溶液中加入0.27mL 2-乙烯基-4，4-二甲基吖内酯单体。将13.33g购自Sigma Chemical Compa-ny的亚甲基二(丙烯酰胺)、90mL异丙醇、和60mL去离子水在低温加热条件下搅拌直至溶解成水溶液，然后加入0.55g过硫酸钠并搅拌此混合物直至其溶解。
将有机溶液和水溶液混合5分钟，然后加入0.55ml四甲基亚乙基二胺。在吖内酯官能珠形成过程中持续搅拌2小时。这些珠子可以被分离并用作合成中间体，但在本方法中，则再向反应混合物中加入了20g肼并继续加以搅拌。1.5小时后过滤分离得酰肼官能珠，用蒸馏水彻底洗涤珠子直至洗出液对pH试纸显中性，然后保存于冰箱中。实施例3酰肼官能珠的制备-肼浓度研究称取多份Emphaze Biosupport Medium AB 1珠(125mg)分别装入4根Bio-Rad Poly-Prep聚丙烯柱中，并与5mL肼的去离子水溶液反应2小时，期间在一旋转混合仪上搅拌。除去每根柱上的断开接头，排去过量的肼溶液，并用去离子水洗涤衍生后的珠子直至洗出液对pH试纸显中性。根据G.T.Hermanson，A.K.Mallia和P.K.Smith在“固定化亲合配位体技术”，Academic Press，SanDiego，CA，1992，pp.287中所描述的方案测定珠子中的酰肼含量。下表列出了衍生用肼溶液的浓度和测得的相应的衍生后的珠子中的酰肼含量。
肼浓度对珠子官能度的影响表I
1两次测量的平均值2得自Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA.的工业用酰肼官能珠本实施例显示，即使在衍生时使用低至0.2M的肼浓度仍可获得非常高的酰肼官能度。利用相似的方法，可由如欧洲专利申请0392,735A2的实施例5中所述的其它吖内酯官能载体制备酰肼官能载体。实施例4优选酰肼官能珠的制备在2.5分钟内向搅拌着的由32mL无水肼在968mL蒸馏水中形成的溶液中缓慢加入63g实施例1所用的吖内酯官能珠。搅拌该混合物2小时又20分钟，然后用烧结玻璃漏斗过滤分离得珠子并用蒸馏水洗涤直至洗出液对pH试纸显中性。将珠子与水混合成浆状，静置30分钟后倒去上清液以去除不需要的过分细小的珠子。重复该过程。第三次重复该过程时可得到不含细珠的澄清上清液。测得的酰肼含量为22.4μmol/mL珠。把合乎要求的酰肼官能珠保存于冰箱中。实施例5肝素官能珠的制备向5mL含0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)和5mg/mL肝素钠(以Batch No.129得自Diosynth，Chicago，IL)的溶液中加入1mL得自实施例1的酰肼官能珠。反应2小时后，过滤分离得珠子，依次以5mL 0.1M乙酸钠缓冲液、10mL含1M氯化钠的20mM磷酸钠(pH7.0)缓冲液和蒸馏水洗涤。
为了检测肝素加合物的形成，将一些珠子样品与5mL甲苯胺蓝水溶液(1％(重量))混合。当用蒸馏水反复洗涤洗去了过量的甲苯胺蓝后，紫红色的珠子表明发生了肝素-甲苯胺蓝特征反应。
重复上述肝素与酰肼官能珠的反应，所不同的是反应物的比为5mL缓冲过的肝素与2mL酰肼官能珠。对得到的肝素官能珠进行定性鉴定并发现它们能够结合抗凝血酶III。实施例6肝素官能珠的制备由购得的EmphazeBiosupport Medium AB 1如实施例4所述制得的酰肼官能珠通过加入与酰肼官能珠等体积的肝素溶液在三种不同的肝素浓度(25，50和75mg/mL)进行反应。25℃，在pH5.0的乙酸钠缓冲液中搅拌以进行该反应。72小时后弃去溶液的上清液，依次用10体积的水、10体积的2.0M中性pH的氯化钠漂洗，再用10体积的水洗涤两次。实施例7肝素官能珠的抗凝血酶III容量的测定制备不同的柱以测定实施例6中制备的珠子的抗凝血酶III容量并将它们与购得的heprin—SepharoseCL一6B珠(购自Phar-macia Biotech，Piscataway，NJ)进行比较。
肝素珠呈浆状地被装入玻璃柱中(3mm×5cm)，并用pH7.4的，含0.15M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液(购自Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO)进行平衡和进样。每根装有珠子的柱都在—FPLC液相层析仪(购自Pharmacia)中依次以进样缓冲液(3.5mL)，3.5mL pH为7.4的含4.0M氯化钠的0.05M TRIS漂洗，并用3.5mL的进样缓冲液进行再平衡。
将得自美国红十字会的纯抗凝血酶III在0.15M氯化钠-0.05M TRIS缓冲液中稀释至1.0mg/mL。在每一根FPLC系统上的柱上以100至200cm/hr的线速度进样20倍于柱体积的(7.0mL)抗凝血酶III。为了回复到基线吸收率，令3.5mL(10倍于柱体积)进样缓冲液流经层析柱。为了从柱上洗脱被吸收的抗凝血酶III，进行7.0mL的氯化钠线性梯度洗脱，以含0.15M氯化钠的TRIS缓冲液开始和以含2.0M氯化钠的TRIS缓冲液结束，使用进样缓冲液和洗脱缓冲液(含4.0M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液，pH7.4)的计算比。收集洗出液组份并由在280nm处的紫外吸收读数来对抗凝血酶III容量进行定量。被结合的抗凝血酶III的洗脱开始于0.45M的氯化钠，洗脱峰值出现在约0.9M。
测得的抗凝血酶III(ATIII)容量为表II
实施例8用各种浓度的氢氧化钠水溶液洗涤时的肝素官能珠的稳定性测定根据实施例6方法以100mg/mL肝素溶液衍生而制备的肝素官能珠于4℃，在各种浓度的氢氧化钠水溶液中混合浸泡2小时后被用于装备玻璃层析柱(3mm×5cm)。浸泡后用水将这些珠子洗涤三次(5mL水/0.5mL珠)，然后装入柱中测定抗凝血酶III容量。如实施例7所述(使用FRLC装置)将纯抗凝血酶III通过每根柱。对单独制备的一根装有肝素官能珠的柱进行测定，它曾被浸在20％的乙醇中以表明其对抑菌介质的稳定性。以一根用pH7.4，含0.15M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液单独制备的肝素官能珠柱作为对照。
结果列于表III。
表III
将某些上述柱中的珠子卸下，在4℃与某处理液混合2小时，如上所述地用水漂洗，重新装柱并再次测定抗凝血酶III容量，如此进行第二次处理。结果列于表IV。
表IV
本试验表明本发明珠子对氢氧化钠洗涤具有优良的稳定性。实施例9对用于制备肝素官能珠的其它肝素源及这些珠子的抗凝血酶III容量的测定由Scientific Protein Laboratories(Waunakee，WI)得到四种肝素产品(其说明见表V)。将这些肝素盐溶解在pH5.0的0.1M乙酸缓冲液中，浓度为100mg/mL，并以珠∶肝素溶液为1∶3的体积比与实施例4制得的酰肼官能珠在25℃反应72小时，并搅拌。根据实施例6漂洗这些肝素官能珠制剂。
将这些肝素官能珠装成3mm×5cm的层析柱并如实施例7所述测定其ATIII容量。测得的ATIII容量如下
表V
实施例10肝素官能珠上非特异性结合率的测定如实施例7所述用进样缓冲液和洗脱缓冲液漂洗肝素官能载体(heparin-Emphaze载体)珠(100mg/mL的肝素与如实施例6所述制得的酰肼官能珠在最适反应条件下反应93小时)层析柱(3mm×5cm)。冷冻的人血浆(美国红十字会，Rockville，MD)在4℃解冻，离心去除低温沉淀物，并以0.8μm和0.2μm的筛滤去外加颗粒物。在层析柱上以200cm/hr进样10.0mL血浆(29倍于柱体积)，然后以10.0mL进样缓冲液漂洗该柱。用7.0ml(20倍于柱体积)pH7.4，含0.30M氯化钠的0.05M TRIS缓冲液去除非特异性结合的蛋白质。利用氯化钠梯度洗脱中1.0M氯化钠这一步，及为了确保完全去除残留蛋白质而在其后进行的2.0M氯化钠和4.0M氯化钠漂洗来进行ATIII的洗脱。收集每一步的洗出液组份。
以0.30M氯化钠洗出液的吸收读数作为非特异性结合蛋白的表征。在与以相同条件处理的heparin-SepharoseCL-6B的并列比较中，heparin-Emphaze载体上的非特异性结合蛋白减少了35％。在色谱示踪中可明显地看到这一定性结果，因为heparin-Emphaze载体在进样后回复到基线吸收更快，在用0.30M氯化钠漂洗时的洗脱蛋白峰更小。1.0M氯化钠洗出组份显示一条与用用于鉴定ATIII的考马斯亮蓝染色法进行的标准SDS-PAGE分析所得的ATIII一致的单独的蛋白质条带。以2.0M氯化钠和4.0M氯化钠进行的处理未洗出外加蛋白质。实施例11肝素偶联反应的时间进程根据实施例5的条件(pH5.0，25℃，0.1M乙酸钠缓冲液)，根据实施例4制备的酰肼活化的EmphazeBiosupport Medium AB 1珠与5mg/mL或150mg/mL测试剂量的肝素(得自Diosynth)反应。按表IV所示的时间增量令珠子与肝素反应4天，期间在每次间隙用水和高盐溶液漂洗珠子以中断偶联反应。将由此得到的肝素衍生的珠子装成层析柱，以2mg或7mg ATIII为靶分子，如实施例7所述测定ATIII容量。
得到以下结果
表VI
+＝2mg ATIII/柱*＝7mg ATIII/柱实施例12pH和盐对肝素与酰肼官能珠偶联的影响在三种pH值和克分子浓度逐步增加的硫酸钠溶液中进行肝素与根据实施例4制备的酰肼活化的EmphazeBiosupport MediumAB 1珠的偶联反应，肝素测试浓度为100mg/mL，偶联时间为48小时。使用的缓冲液取决于所需的pH值偶联时分别使用pH5.07的乙酸钠缓冲液，pH7.0的磷酸钠缓冲液，pH10.0的碳酸钠缓冲液。
得到以下结果表VII
本试验表明，就产生高ATIII容量而言，肝素偶联反应的效率在pH5或pH7时比pH10时高。盐的影响随pH值不同而异。
权利要求
1.一种肝素官能高聚物，其特征在于，它含有共价结合于由肼与某种吖内酯官能高聚物反应而成的一个酰肼官能团上的生物活性肝素。
2.根据权利要求1所述的肝素官能高聚物，其特征还在于，它的结构式选自 和 其中，Su代表载体，n是0或1，Hep是一个肝素残基，R1和R2各自相互独立地为一个具有1至14个碳原子的烷基，具有3至14个碳原子的环烷基，具有5至1 2个环原子的芳基，具有6至26个碳原子和0至3个S、N、非过氧化O杂原子的芳基(arenyl)，或者R1和R2及与它们相连的那个碳原子共同构成一个具有4至12个环原子的碳环。
3.根据权利要求1所述的肝素官能高聚物，其特征还在于，在用1N氢氧化钠洗涤载体后，结合于载体上的肝素保留大于80％的抗凝血酶III结合活性。
4.根据权利要求1所述的肝素官能高聚物，其特征还在于，其中的高聚物可结合多于5mg/mL的抗凝血酶III。
5.一种酰肼官能层析载体，其特征在于，它含有 其中，n是0或1，R1和R2各自相互独立地为一个具有1至14个碳原子的烷基，具有3至14个碳原子的环烷基，具有5至12个环原子的芳基，具有6至26个碳原子和0至3个S、N、非过氧化O杂原子的芳基(arenyl)，或者R1和R2及与它们相连的那个碳原子共同构成一个具有4至12个环原子的碳环，Su是载体。
6.根据权利要求5所述的所述的肝素官能载体，其特征还在于，其结构式选自 和 其中，Su是载体，Hep是一个肝素残基。
7.一种进行某种肝素-相互作用分子与肝素官能表面之间相互反应的方法，其特征在于，它包括以下步骤i)提供一个含有吖内酯官能高聚物的表面，该高聚物先与肼反应衍生形成酰肼，再与肝素反应以衍生此酰肼；ii)令该表面与肝素-相互作用分子接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征还在于，其中的肝素-相互作用分子是抗凝血酶III或某种人生长因子。
全文摘要
本发明描述了由吖内酯官能高聚物与肼反应得到的酰肼官能高聚物。该酰肼官能高聚物可与肝素之类的羰基官能物质反应以提供可用于生物活性物质的纯化、制备、分离和检测的肝素官能高聚物。还描述了作为用于纯化抗凝血酶III的具有重大改进的亲合层析载体(如珠)的肝素官能高聚物的制造和使用方法。
文档编号B01J20/30GK1130386SQ94193121
公开日1996年9月4日 申请日期1994年8月12日 优先权日1993年8月19日
发明者J·K·拉斯马森, R·A·柯里, M·M·沃克 申请人:美国3M公司