一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊及其制备方法，首先将含生物酶的缓冲溶液与含改性二氧化硅纳米粒子的有机溶剂乳化，形成由纳米粒子在两相界面稳定的水/油乳浊液；然后加入硅烷，硅烷水解将纳米粒子粘结固定，即制备出包封生物酶的水芯全硅壳胶体体微胶囊。本发明制备条件温和，实现了生物酶在有机溶剂中的活性稳定性。本发明制备的全硅结构胶体体微胶囊具有良好的物理和化学稳定性，解决了生物酶在有机介质中的分散问题，大大提高了生物酶在有机溶剂中的活性；并且是具有一定通透性的可调控壳壁结构，可实现生物酶在有机介质中的可控活性释放和可重复利用。该发明对生物酶在有机介质中的催化反应有着广泛的应用前景。
【专利说明】一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊及其制备方法，特别是涉及一种通过硅烷水解粘结一层或一层以上二氧化硅纳米粒子形成的可调控壳壁结构的包封生物酶的全硅水芯胶体体微胶囊及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胶体体是一种新颖的具有半通透性壳壁结构的新型微胶囊，其壳壁由自组装分散在皮克林乳液油-水界面的胶体粒子间相互作用而固化形成。胶体体包封芯材已受到医药、化妆品、食品等领域的高度关注，但仅处于起步阶段。目前，已报道的可用于制备胶体体微胶囊的胶体粒子有高分子微球(PS胶体粒子、PMMA胶体粒子、PNiPAAm胶体粒子、P(NiPAAm-C0-AAC)胶体粒子、环氧树脂微棒、纳米纤维素微棒、CPMV粒子等)和无机粒子(SiO2纳米粒子、TiO2纳米粒子、Fe3O4纳米粒子、粘土纳米粒子等)。
[0003]生物酶是具有生物催化功能的蛋白质大分子，酶催化具有催化效率高、专一性强等显著特点。生物酶催化已成为目前关注的和研究的热点，但研究过程中发现生物酶的许多重要底物水溶性较差；并且部分生物酶的催化作用在水系条件下存在主反应与水解反应竞争等问题，因此需要使用有机溶剂作为反应介质来解决上述问题。但同时也面临着生物酶在有机介质中稳定性差、易变性、活性低，并且不易分散于有机介质中。诸多问题限制了生物酶在各领域的广泛应用，尤其是在有机介质体系中的催化应用。
[0004]胶体体包封生物酶是防止外界不良环境对生物酶构象的破坏、提高生物酶稳定性和可回收重复利用性能的具有潜力和可行性的方法。目前胶体体的制备主要通过自粘法(利用粒子溶胀性、玻璃化转变等)、物理凝胶法(凝胶化水相将胶体粒子固定)、聚合法和光交联等方法固结在两相界面自组装的胶体粒子形成具有一定通透性的有机、有机/无机杂化胶体体微胶囊。上述制备方法条件剧烈(高温、紫外光照射)，易导致生物酶失去活性；制备的胶体体大多为有机、有机/无机杂化结构，其物理和化学稳定性较低，在运载、存储芯材的过程中容易破裂，从而失去对芯材的包封保护和运载作用，更不适用于实现包封生物酶有机介质中催化。
[0005]硅烷水解粘结自组装于油-水界面的二氧化硅纳米粒子形成的全硅结构胶体体具有良好的生物相容性，并且具有良好力学性能和化学稳定性，可长时分散于有机介质而保持良好形貌特征。以此全硅胶体体包封生物酶在有机介质中催化具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊及其制备方法，提出了一种以硅烷水解粘结自组装于油-水界面的二氧化硅纳米粒子而形成包封生物酶的全硅胶体体及其制备方法，本发明的方法操作简单、条件温和，适用于包封具有生物活性的生物酶。采用该制备方法制备出的可调控壳壁结构为一层或一层以上二氧化硅纳米粒子壳壁的包封生物酶的全硅胶体体，可实现生物酶在有机溶剂中的可控活性释放和重复利用。[0007]本发明的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述胶体体微胶囊为具有一层或一层以上二氧化硅纳米粒子经硅烷水解粘结形成的壳壁结构并包封生物酶的球形核-壳结构微胶囊。改性二氧化硅纳米粒子在超声乳化作用下自组装排列于水(含生物酶的缓冲溶液)-油(有机溶剂)两相界面处，形成由二氧化硅纳米粒子稳定的油包水皮克林乳液，随后加入作为粘结剂的硅烷，在水解作用下将二氧化硅纳米粒子粘结固定，形成稳定的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊。由于该胶体体微胶囊壳壁由二氧化硅纳米粒子排列组成，因此该胶体体为胶囊具有一定的半通透性，并且该壳壁半通透性可与形成壳壁的二氧化硅纳米粒子层的厚度相关。该胶体体为胶囊壳壁的半通透性赋予了包封于胶体体内部的生物酶可与外界物质接触的可能，从而可实现包封于胶体体内部的生物酶对外界物质的催化，并且包封的生物酶的催化活性可通过调整壳壁结构实现可控。同时该胶体体为全硅壳壁结构，具有良好的物理及化学稳定性，可长时间分散于有机溶剂而保持良好的形貌特征和性能。胶体体微胶囊内部的微水环境大大提高了生物酶在有机溶剂中的活性，并且包封于胶体体内部的生物酶，在胶体体微胶囊壳壁的屏蔽保护下，长时间分散于有机溶剂以让能保持较高的活性稳定性，并利于从有机溶剂分离，实现循环利用。
[0008]作为优选的技术方案:
[0009]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯为原料与醋酸酐缩聚反应形成的超支化硅烷。超支化硅烷具有更多的活性基团，有利于水解粘结二氧化硅纳米粒子，形成稳定结构。
[0010]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述生物酶为漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于缓冲溶液中，生物酶的浓度范围为0.5?50mg/mL ;所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液，所述缓冲溶液的PH值为2?10。
[0011]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述胶体体微胶囊粒径分布介于0.5?2 μ m ;所述胶体体微胶囊壳壁具有半通透性，其半通透性与胶体体微胶囊壳壁的厚度及密度相关。
[0012]本发明还提供了一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，包括以下步骤:
[0013]A)将有机硅源溶于醇溶液中，控制溶液pH值为8?12 ;
[0014]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂，并继续搅拌，得到含有改性纳米二氧化硅粒子的醇分散液；
[0015]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的醇分散液，在室温条件下离心处理，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理；重复离心处理并移除上层清液后进行溶剂交换处理的操作3?5次，最终将沉淀的改性二氧化硅分散于有机溶剂中，配制成浓度为I?10wt%的改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液；
[0016]D)将所述改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液与含生物酶的缓冲溶液混合，两者质量比为5?15:1，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液；
[0017]E)向所述乳浊液中，加入硅烷，加入量与改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液的质量比为1:50?100，室温下搅拌水解24?120h，即得到分散于有机溶剂的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊。[0018]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，步骤A)中:有机硅源与醇溶液质量比为1:10?100 ;有机硅源溶于醇溶液时，在室温下搅拌3?48h ;所述的有机硅源为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述的醇为甲醇或乙醇；控制溶液PH值采用氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氨水。
[0019]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，步骤B)中:所述改性剂的分子式为CnH2n-Si (0CmH2m+1)3，其中η为5?18，m为I?4 ;所述改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:50?100 ;所述继续搅拌的时间为24?120h。
[0020]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，步骤C)中:所述离心处理时间为15?60min。
[0021]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，所述的溶剂交换处理是指实现改性二氧化硅纳米粒子分散体系由醇溶液完全置换为有机溶剂的过程:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于醇与有机溶剂体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于醇与有机溶剂体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于有机溶剂中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于有机溶剂中至肉眼观测无大颗粒团聚物，形成改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液；所述有机溶剂为四氯化碳、四氢呋喃、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯。
[0022]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，进一步地，将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊进行抽滤处理或离心处理；
[0023]所述抽滤处理是将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊有机溶剂分散体系，室温下抽滤处理，收集沉积于滤膜上包封生物酶的全硅胶体体，并分散于有机溶剂中；如此重复3?5次抽滤和分散，以去除未被包封的生物酶；
[0024]所述离心处理是将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊有机溶剂分散体系，在3000?5000rpm转速下离心5?30min,取沉淀的包封生物酶的全娃胶体体微胶囊再次分散于有机溶剂；如此重复离心和分散3?5次，以去除未被包封的生物酶。
[0025]有益效果:
[0026]本发明首次提出通过硅烷水解粘结方式制备包封生物酶的基于二氧化硅纳米粒子的全娃胶体体方法；
[0027]本发明制备工艺简单、制备条件温和，包封生物酶的全硅结构胶体体具有良好的力学性能和化学稳定性，可长时间分散于有机介质；
[0028]本发明以硅烷水解固结二氧化硅纳米粒子制备包封生物酶的全硅胶体体可实现生物酶在有机介质中的重复利用性，并且本发明的制备方法可调控壳壁为一层及一层以上二氧化硅纳米粒子层壳壁，可实现生物酶在在有机介质中的可控活性释放。
【具体实施方式】
[0029]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0030]本发明的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述胶体体微胶囊为具有一层或一层以上二氧化硅纳米粒子经硅烷水解粘结形成的壳壁结构并包封生物酶的球形核-壳结构微I父囊。
[0031]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯为原料与醋酸酐缩聚反应形成的超支化硅烷。
[0032]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述生物酶为漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于缓冲溶液中，生物酶的浓度范围为0.5?50mg/mL ;所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液，所述缓冲溶液的PH值为2?10。
[0033]如上所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，所述胶体体微胶囊粒径分布介于0.5?2 μ m ;所述胶体体微胶囊壳壁具有半通透性，其半通透性与胶体体微胶囊壳壁的厚度相关。
[0034]实施例1
[0035]A)正硅酸乙酯与甲醇以1:10的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至12，室温下搅拌3h ；
[0036]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂CltlH2tl-Si (OC4H9) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:50，继续搅拌24h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0037]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室温条件下5000rpm离心处理60min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于甲醇与氯仿体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于甲醇与氯仿体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于氯仿中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于氯仿中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为lwt%的改性二氧化硅纳米粒子氯仿待用液；
[0038]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子氯仿待用液与含0.5mg/ml酸性蛋白酶的PH2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为15:1 ;
[0039]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子氯仿待用液的质量比为1:50的硅烷，室温下搅拌水解120h，即制备出分散于氯仿的包封酸性蛋白酶的全硅胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的酸性蛋白酶，在3000rpm条件下离心30min,去除上清液后，再次分散于氯仿中，如此重复上述操作3次，即得平均粒径为2 μ m的由一层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封酸性蛋白酶的全硅胶体体微胶囊。
[0040]实施例2
[0041]A)正硅酸乙酯与乙醇以1:100的比例混合，并加入碳酸氢钠调节该混合溶液pH值至8,室温下搅拌36h ；[0042]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C5Hltl-Si (OCH3) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:100，继续搅拌48h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0043]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下7000rpm离心处理30min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与甲苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇与甲苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为3wt%的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液；
[0044]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子甲苯待用液与含50mg/ml漆酶的pH5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ;
[0045]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液的质量比为1:100的硅烷，室温下搅拌水解48h，即制备出分散于甲苯的包封漆酶的全硅胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的漆酶，在5000rpm条件下离心lOmin，去除上清液后，再次分散于甲苯中，如此重复上述操作5次，即得平均粒径为I μ m的由一层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封漆酶的全硅胶体体微胶囊。
[0046]实施例3
[0047]A)正硅酸甲酯与乙醇以1:50的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至11，室温下搅拌IOh ；
[0048]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C18H36_Si(0C2H5)3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:60，继续搅拌120h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0049]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下13000rpm离心处理15min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与四氢呋喃体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇醇与四氢呋喃体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于四氢呋喃中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于四氢呋喃中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为5wt%的改性二氧化硅纳米粒子四氢呋喃待用液；
[0050]D)将C)步骤配制的改性二氧化硅纳米粒子四氢呋喃待用液与含30mg/ml脂肪酶的pH7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ;
[0051]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子四氢呋喃待用液的质量比为1:60的硅烷，室温下搅拌水解96h，即制备出分散于四氢呋喃的包封脂肪酶的全娃胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的脂肪酶，在4000rpm条件下离心20min,去除上清液后，再次分散于四氢呋喃中，如此重复上述操作3次，即得平均粒径为0.7 μ m的由二层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封脂肪酶的全硅胶体体微胶囊。
[0052]实施例4
[0053]A)正硅酸乙酯与甲醇以1:30的比例混合，并加入氢氧化钠调节该混合溶液pH值至12，室温下搅拌24h ；
[0054]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂CltlH2tl-Si (OCH3) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:70，继续搅拌96h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0055]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室温条件下IOOOOrpm离心处理20min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于甲醇与苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于甲醇与苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为8wt%的改性二氧化硅纳米粒子苯待用液；
[0056]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子苯待用液与含40mg/ml蛋白酶的PHlOTrish-盐酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为5:1 ；
[0057]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子苯待用液的质量比为1:70的硅烷，室温下搅拌水解72h，即制备出分散于苯的包封蛋白酶的全硅胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的蛋白酶，室温条件下抽滤分散于苯的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊后，收集沉积于滤膜上的包封蛋白酶的全硅胶体体，再次分散于苯中，如此重复上述操作3次，即得平均粒径为0.8 μ m的由二层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封蛋白酶的全硅胶体体微胶囊。
[0058]实施例5
[0059]A)正硅酸甲酯与甲醇以1:70的比例混合，并加入氢氧化钠调节该混合溶液pH值至12，室温下搅拌48h ；
[0060]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂CltlH2tl-Si (OC2H5) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:70，继续搅拌96h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液；
[0061]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室温条件下IOOOOrpm离心处理60min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于甲醇与乙酸乙酯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于甲醇与乙酸乙酯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于乙酸乙酯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于乙酸乙酯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为10wt%的改性二氧化硅纳米粒子乙酸乙酯待用液；
[0062]D)将C)步骤配制的改性二氧化硅纳米粒子乙酸乙酯待用液与含10mg/ml蛋白酶的PH5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为6:1
[0063]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子乙酸乙酯待用液的质量比为1:70的硅烷，室温下搅拌水解72h，即制备出分散于乙酸乙酯的包封蛋白酶的全硅胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的蛋白酶，室温条件下抽滤分散于苯的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊后，收集沉积于滤膜上的包封蛋白酶的全硅胶体体，再次分散于乙酸乙酯中，如此重复上述操作5次，即得平均粒径为0.5 μ m的由三层层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封蛋白酶的全硅胶体体微胶囊。
[0064]实施例6
[0065]A)正硅酸乙酯与乙醇以1:80的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至10，室温下搅拌12h ；
[0066]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C18H36-Si (OCH3) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:80，继续搅拌100h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0067]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下9000rpm离心处理30min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与甲苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇与甲苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为2wt%的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液；
[0068]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子甲苯待用液与含10mg/ml漆酶的pH5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ;
[0069]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液的质量比为1:80的硅烷，室温下搅拌水解120h，即制备出分散于甲苯的包封漆酶的全硅胶体体微胶囊；为进一步纯化，去除未被包封的漆酶，室温条件下抽滤分散于甲苯的包封漆酶的全硅胶体体微胶囊后，收集沉积于滤膜上的包封蛋白酶的全硅胶体体，再次分散于甲苯中，如此重复上述操作3次，即得平均粒径为1.5 μ m的由一层二氧化硅纳米粒子构成壳壁的包封漆的全硅胶体体微胶囊。
[0070]实施例7
[0071]A)正硅酸甲酯与乙醇以1:90的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至11，室温下搅拌IOh ；
[0072]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C12H24_Si(0C2H5)3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:60，继续搅拌120h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；[0073]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下13000rpm离心处理15min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与四氯化碳体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇醇与四氯化碳体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于四氯化碳中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于四氢呋喃中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为4wt%的改性二氧化硅纳米粒子四氯化碳待用液；
[0074]D)将C)步骤配制的改性二氧化硅纳米粒子四氯化碳待用液与含10mg/ml脂肪酶的pH7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ;
[0075]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子四氯化碳待用液的质量比为1:100的硅烷，室温下搅拌水解100h，即制备出分散于四氯化碳的包封脂肪酶的全娃胶体体微胶囊，平均粒径0.8 μ m,壳壁由二层二氧化娃纳米粒子构成。
[0076]实施例8
[0077]A)正硅酸甲酯与乙醇以1:30的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至11，室温下搅拌IOh ；
[0078]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C12H24-Si (OC2H5) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:70，继续搅拌24h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0079]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下13000rpm离心处理15min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与甲苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇醇与甲苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为5wt%的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液；
[0080]D)将C)步骤配制的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液与含50mg/ml脂肪酶的PH7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ;
[0081]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液的质量比为1:100的硅烷，室温下搅拌水解100h，即制备出分散于甲苯的包封脂肪酶的全硅胶体体微胶囊，平均粒径0.6 μ m,壳壁由二层二氧化娃纳米粒子构成。
[0082]实施例9
[0083]A)正硅酸乙酯与乙醇以1:30的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至11，室温下搅拌24h;
[0084]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂C12H24-Si (OCH3) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:70，继续搅拌24h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0085]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液，在室温条件下13000rpm离心处理15min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于乙醇与甲苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于乙醇醇与甲苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为3wt%的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液；
[0086]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子甲苯待用液与含10mg/ml蛋白酶的PHlOTris-盐酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ；
[0087]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液的质量比为1:80的硅烷，室温下搅拌水解72h，即制备出分散于甲苯的包封蛋白酶的全硅胶体体微胶囊；平均粒径I μ m,壳壁由一层二氧化娃纳米粒子构成
[0088]实施例10
[0089]A)正硅酸甲酯与甲醇以1:70的比例混合，并加入氨水调节该混合溶液pH值至11，室温下搅拌3h;
[0090]B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂CltlH2tl-Si (OCH3) 3，改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:70，继续搅拌24h，即得到含有改性纳米二氧化硅粒子的乙醇分散液；
[0091]C)将所述含改性纳米二氧化硅粒子的甲醇分散液，在室温条件下13000rpm离心处理15min，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于甲醇与甲苯体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于甲醇与甲苯体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子分散于甲苯中至肉眼观测无大颗粒团聚物，配制成浓度为7wt%的改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液；
[0092]D)将C)步骤配制的改性二氧化娃纳米粒子甲苯待用液与含20mg/ml蛋白酶的PHlOTris-盐酸缓冲溶液混合，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液，其中两者质量比为10:1 ；
[0093]E)向步骤D)制备的乳浊液中，加入与改性二氧化硅纳米粒子甲苯待用液的质量比为1:80的硅烷，室温下搅拌水解72h，即制备出分散于甲苯的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊；平均粒径0.5 μ m,壳壁由三层二氧化娃纳米粒子构成。
【权利要求】
1.一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，其特征是:所述胶体体微胶囊为具有一层或一层以上二氧化硅纳米粒子经硅烷水解粘结形成的壳壁结构并包封生物酶的球形核-壳结构微I父囊。
2.根据权利要求1所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，其特征在于，所述硅烷是指以正硅酸乙酯或正硅酸甲酯为原料与醋酸酐缩聚反应形成的超支化硅烷。
3.根据权利要求1所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，其特征在于，所述生物酶为漆酶、脂肪酶或蛋白酶；所述的生物酶分散于缓冲溶液中，生物酶的浓度范围为0.5~50mg/mL ;所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值为2~10。
4.根据权利要求1所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊，其特征在于，所述胶体体微胶囊粒径分布介于0.5~2 μ m ;所述胶体体微胶囊壳壁具有半通透性，其半通透性与胶体体微胶囊壳壁的厚度相关。
5.如权利要求1~4中任一项所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征是包括以下步骤: A)将有机硅源溶于醇溶液中，控制溶液pH值为8~12; B)在上述步骤A)所得溶液中加入改性剂，并继续搅拌，得到含有改性纳米二氧化硅粒子的醇分散液； C)将所述含改性纳米二氧化硅粒 子的醇分散液，在室温条件下离心处理，移除上层清液后，对沉淀二氧化硅进行溶剂交换处理；重复离心处理并移除上层清液后进行溶剂交换处理的操作3~5次，最终将沉淀的改性二氧化硅分散于有机溶剂中，配制成浓度为I~10wt%的改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液； D)将所述改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液与含生物酶的缓冲溶液混合，两者质量比为5~15:1，经超声乳化制备得改性二氧化硅纳米粒子稳定的油包水乳浊液； E)向所述乳浊液中，加入硅烷，加入量与改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液的质量比为1:50~100，室温下搅拌水解24~120h，即得到分散于有机溶剂的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊。
6.根据权利要求5所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤A)中:有机硅源与醇溶液质量比为1:10~100 ;有机硅源溶于醇溶液时，在室温下搅拌3~48h ;所述的有机硅源为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述的醇为甲醇或乙醇；控制溶液pH值采用氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氨水。
7.根据权利要求5所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤B)中:所述改性剂的分子式为CnH2n-Si (OCmH2m+1) 3，其中η为5~18，m为I~4 ;所述改性剂加入量与有机硅源间质量比为1:50~100 ;所述继续搅拌的时间为24~120h。
8.根据权利要求5所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤C)中:所述离心处理时间为15~60min,离心转述为5000~13000rpm。
9.根据权利要求5所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的溶剂交换处理是指实现改性二氧化硅纳米粒子分散体系由醇溶液完全交换为有机溶剂的过程:首先，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子首先分散于醇与有机溶剂体积比为7:3的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；其次，将上述离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子分散于醇与有机溶剂体积比为3:7的混合溶液中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；再次，将离心沉淀的改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于有机溶剂中至肉眼观测无大颗粒团聚物存在后，离心处理并移除上层清液；最后，将改性二氧化硅纳米粒子完全置换分散于有机溶剂中至肉眼观测无大颗粒团聚物，形成改性二氧化硅纳米粒子有机溶剂待用液；所述有机溶剂为四氯化碳、四氢呋喃、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯。
10.根据权利要求5所述的一种包封生物酶的全硅胶体体微胶囊的制备方法，其特征在于，进一步地，将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊进行抽滤处理或离心处理； 所述抽滤处理是将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊有机溶剂分散体系，室温下抽滤处理，收集沉积于滤膜上包封生物酶的全硅胶体体，并分散于有机溶剂中；如此重复3~5次抽滤和分散，以去除未被包封的生物酶； 所述离心处理是将所述步骤E)得到的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊有机溶剂分散体系，在3000~5000rpm转速下离心5~30min,取沉淀的包封生物酶的全硅胶体体微胶囊再次分散于有机溶剂； 如此重复离心和分散3~5次，以去除未被包封的生物酶。
【文档编号】B01J13/02GK103464062SQ201310401109
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】阎克路, 张弛, 胡春艳 申请人:东华大学