专利名称：用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法。
背景技术：
羊泰勒虫病(Ovine and caprine theileriosis )是由媒介蝶传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称。羊泰勒虫病最早在1914年发现于埃及绵羊。我国最早在1958年由杨辅国等报道了四川的羊泰勒虫病，随后在青海、甘肃、辽宁、内蒙古、陕西和宁夏等地也有本病流行的报道。最近，在我国湖北、广东、浙江、贵州、新疆等省也检测到羊泰勒虫病原体。本病主要呈地方性流行，发病率高达36.0%-100%，病死率高达17.8%-75.4%。该病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊发育迟缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给全球养羊业造成重大经济损失。羊泰勒虫裂殖子的分离纯化一直是造成许多相关研究停滞不前的重要原因，任何非虫体来源的物质都有可能对其研究产生严重偏差，例如，羊泰勒虫蛋白质组全谱分析、差异蛋白分析与研究、转录组学的相关研究等，这都对羊泰勒虫的分离纯化技术提出了更高的要求。目前，国内外的学者已经建立了一些分离微小寄生虫的方法，例如，利用纤维素滤膜过滤法纯化弓形虫速殖子(方正明，2010)，虽然能分离到较纯净的虫体，但回收率太低，且存在滤膜易破、分离量少等缺点。Sugimoto等用溶血素法裂解感染瑟氏泰勒虫的牛红细胞，再通过Percoll密度梯度离心来回收牛瑟氏泰勒虫，虽然可以大量的纯化虫体，但纯化产物中往往混有较多杂质，并且虫体易破损，造成蛋白损失，严重影响后续的实验进展。利用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子(李有全，2007)，虽然纯化效果较好，但是工作量大，步骤繁琐也使得虫体的大量纯化较难进行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法。本发明的技术方案如下:—种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱的制备方法，包括以下步骤:(I)抗体的纯化:利用protein G层析柱纯化血清抗体:将填料与结合缓冲液按照1:1体积比例预混后缓慢装入层析柱中，待填料充分沉淀后按照流速I ml/min加5 ml结合缓冲液来平衡，将染虫绵羊血清按照流速I ml/min加入到制好的层析柱中，收集流出液；用30 ml结合缓冲液按照流速2 ml/min过柱,待完全清洗后,用10-15 ml洗脱缓冲液按照流速I ml/min过柱，收集流出液，SDS-PAGE验证纯化效果；用平衡缓冲液平衡柱子，以备下次使用；所述结合缓冲液:20 mmol/L磷酸氢二钠，0.15 mol/L氯化钠，pH 8.0 ；所述洗脱缓冲液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5 ；所述平衡缓冲液:Imol/L Tris-HCl, pH 8.5 ；(2)抗体的上样前处理:用20 ml偶联缓冲液清洗脱盐柱，加入3 ml纯化的IgG过柱脱盐，收集流出液，将1/10流出液质量的氧化剂偏高碘酸钠固体粉末加入到样品中进行氧化处理，室温振荡I h，立即再次进行脱盐处理；所述脱盐柱:聚丙酰胺凝胶介质；(3)抗体的偶联:吸取2 ml Aff1-Gel凝胶至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶联缓冲液，混合均匀，待凝胶完全沉淀后，移除上清液，重复上述清洗过程；清洗完成后，再次加入5 ml偶联缓冲液，将其转移至偶联柱中；加抗体至偶联柱中，室温振荡偶联24 h，收集流出液检测偶联率；用I倍柱容量的PBS清洗偶联柱，将偶联完成的偶联柱放入4°C保存备用；所述偶联缓冲液:100 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L氯化钠，pH 5.5。应用本发明的免疫亲和层析柱，从镜检图中看出，视野中分散着纯化后的羊泰勒虫裂殖子，无其他杂质存在，且细胞形态完整独立，因此本发明对于羊泰勒虫裂殖子的纯化有较好的效果。
图1:利用protein G提纯IgG后的SDS-PAGE电泳图；图2:虫体纯化后1000倍油镜镜检具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。免疫亲和层析柱的制备方法:(I)抗体的纯化:利用protein G层析柱(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)纯化血清抗体。将填料与结合缓冲液按照1:1体积比例预混后缓慢装入层析柱中。待填料充分沉淀后加5 ml结合缓冲液来平衡(流速I ml/min)。将染虫绵羊血清加入到制好的层析柱中(流速I ml/min),收集流出液。用30 ml结合缓冲液过柱(流速2 ml/min)。待完全清洗后，用10-15 ml洗脱缓冲液过柱(流速I ml/min)收集流出液，SDS-PAGE验证纯化效果。用平衡缓冲液平衡柱子，以备下次使用。结合缓冲液:20 mmol/L磷酸氢二钠，0.15 mol/L氯化钠，pH 8.0。洗脱缓冲液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5。平衡缓冲液:Imol/L Tris-HCl, pH 8.5。从附图1的SDS-PAGE电泳图中可以看出，纯化前，血清样品中含有较多的杂蛋白，纯化后，仅在25KDa (抗体轻链)及55KDa (抗体重链)处存在蛋白条带，抗体被很好的提纯出来，由此可看出protein G层析柱对于抗体的纯化有较好的效果。(2)抗体的上样前处理
用20 ml偶联缓冲液清洗脱盐柱，加入3 ml纯化的IgG过柱脱盐，收集流出液，将1/10流出液质量的氧化剂(偏高碘酸钠固体粉末)加入到样品中进行氧化处理。室温振荡I h。立即再次进行脱盐处理。(3)抗体的偶联:吸取2 ml Aff1-Gel凝胶至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶联缓冲液，混合均匀，待凝胶完全沉淀后，移除上清液，重复上述清洗过程；清洗完成后，再次加入5 ml偶联缓冲液，将其转移至偶联柱中。加抗体至偶联柱中，室温振荡偶联24 h，收集流出液检测偶联率。用I倍柱容量的PBS (pH 7.0)清洗偶联柱，将偶联完成的偶联柱放入4 °C保存备用。偶联率计算公式=(偶联前抗体量-未偶联抗体量)/偶联前抗体量偶联缓冲液:100 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L氯化钠，pH 5.5。氧化剂:偏高碘酸钠固体粉末。脱盐柱:聚丙酰胺凝胶介质(购自伯乐生物科技公司)。分离纯化羊泰勒虫裂殖子的方法:(I)样品的前处理将染虫羊通过颈动脉放血,收集抗凝血。抗凝血以3000 rpm离心10 min，去除血浆和白细胞层。加等量红细胞压积的生理盐水，PBS或培养液重新悬浮红细胞。用白细胞滤除器过滤红细胞，去除所有的白细胞。以3000 rpm离心10 min，弃上清，留红细胞压积。按1:4比例向红细胞压积中加入含7%甘油的生理盐水，室温放置30 min。以3000 rpm离心10 min，弃上清，向压积中1:4加入生理盐水，红细胞即可崩解。以4000 rpm离心10 min,弃沉淀，留上清。将上清液以10000 rpm，4°C离心30 min。尽可能的去除上清后，收集管底的白色沉淀。再以10000 rpm离心10 min反复洗漆3次。(2)裂殖子的纯化:将4°C保存的免疫亲和层析柱移至室温环境，加2 4倍柱容量的缓冲液(pH 7.0PBS)平衡。上样:用柱容积的I倍体积的PBS pH 7.0平衡柱子(流速I ml/min)。将样品加入到平衡完成的柱子中(流速I ml/min)。清洗:上样完成后，用柱容量I倍体积的PBS pH 7.0清洗柱子(流速2 ml/min)。洗脱:用柱容量0.5倍体积的0.1 mol/L醋酸、pH 3.0洗脱缓冲液B (0.1 mol/Lglycine-HCl PH 2.5)洗脱柱子上吸附的虫体(流速I ml/min)。检测:将纯化样品浓缩进行吉姆萨染色，1000倍油镜下镜检和评估羊泰勒虫裂殖子的纯化效果。从图2的镜检图中可以看出，视野中分散着纯化后的羊泰勒虫裂殖子，无其他杂质存在，且细胞形态完整独立，由此可看出本发明对于羊泰勒虫裂殖子的纯化有较好的效果O应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)抗体的纯化: 利用protein G层析柱纯化血清抗体:将填料与结合缓冲液按照1:1体积比例预混后缓慢装入层析柱中，待填料充分沉淀后按照流速I ml/min加5 ml结合缓冲液来平衡，将染虫绵羊血清按照流速I ml/min加入到制好的层析柱中，收集流出液；用30 ml结合缓冲液按照流速2 ml/min过柱,待完全清洗后,用10-15 ml洗脱缓冲液按照流速I ml/min过柱，收集流出液，SDS-PAGE验证纯化效果；用平衡缓冲液平衡柱子，以备下次使用； 所述结合缓冲液:20 mmol/L磷酸氢二钠,0.15 mol/L氯化钠，pH 8.0 ； 所述洗脱缓冲液A:0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5 ； 所述平衡缓冲液:I mol/L Tris-HCl，pH 8.5 ； (2)抗体的上样前处理: 用20 ml偶联缓冲液清洗脱盐柱，加入3 ml纯化的IgG过柱脱盐，收集流出液，将1/10流出液质量的氧化剂偏高碘酸钠固体粉末加入到样品中进行氧化处理，室温振荡I h，立即再次进行脱盐处理；所述脱盐柱:聚丙酰胺凝胶介质； (3)抗体的偶联: 吸取2 ml Aff1-Gel凝胶至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶联缓冲液，混合均匀，待凝胶完全沉淀后，移除上清液，重复上述清洗过程；清洗完成后，再次加入5 ml偶联缓冲液，将其转移至偶联柱中；加抗体至偶联柱中，室温振荡偶联24 h，收集流出液检测偶联率；用I倍柱容量的PBS清洗偶联柱，将偶联完成的偶联柱放入4°C保存备用；所述偶联缓冲液:100 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L氯化钠，pH 5.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱。
全文摘要
本发明公开了用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法，包括以下步骤(1)抗体的纯化；(2)抗体的上样前处理；(3)抗体的偶联。应用本发明的免疫亲和层析柱，从镜检图中看出，视野中分散着纯化后的羊泰勒虫裂殖子，无其他杂质存在，且细胞形态完整独立，因此本发明对于羊泰勒虫裂殖子的纯化有较好的效果。
文档编号B01J20/291GK103143332SQ201310079950
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者殷宏, 罗建勋, 李有全, 张晓 , 刘志杰, 陈泽, 杨吉飞, 关贵全, 任巧云, 刘爱红, 牛庆丽, 刘军龙, 马米玲, 岑双庆, 何海宁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所