专利名称：一种脂质体制备和收集装置及方法
技术领域：
本发明涉及脂质体制备领域，特别涉及一种脂质体制备和收集装置以及使用该装置制备和收集脂质体的方法。
背景技术：
脂质体是磷脂双分子层膜在水相中组装成内部为水相的闭合囊泡。脂质体具有双亲性、生物相容性，和细胞膜及细胞器膜具有类似结构，在美容、食品、医药和生物化学等研究领域得到广泛的应用。脂质体的粒径范围从IOnm到100 μ m，其中，粒径大于5 μ m的脂质体称为巨型脂质体。巨型脂质体可作为载体用于药物传送，也可以作为微反应器来模拟细胞或者细胞器，研究体内生物化学反应等，此外，巨型脂质体也可用于细胞膜的模拟，进行细胞膜结构、功能和膜穿孔、融合等机制的研究。现有技术的巨型脂质体制备方法主要包括传统脂质体制备法、微流控注入法、力口电制备法。其中传统脂质体制备法主要包括如下几种:1.薄膜分散法，首先将脂质材料溶解于有机相，装在圆底烧瓶内，减压或者通氮气去除有机溶剂，圆底烧瓶底壁形成脂质薄膜，然后，将水或其它含有待包封物的溶液加入到脂质薄膜上，通过振摇、旋转或者涡旋等机械分散方式使薄膜分散于水相中，脂质薄膜吸水膨胀，弯曲封闭形成脂质体，而待包封物在脂质体形成的同时即被包裹于脂质体内。此方法的缺点在于，脂质薄膜的形成受有机溶剂去除方式和机械分散方式的影响明显，难于控制脂质膜均匀分布，有机物易残留，所需时间长，粒径不均匀，巨大粒径脂质体形成的量少，重复性差。2.两相分散法，通过将脂质材料溶解于有机溶剂中，再加入水或其它含有待包封物的溶液，使有机相与水相充分接触，然后，减压将有机溶剂蒸发，在蒸发过程中，脂质材料在水相中形成脂质体，而待包封物在脂质体形成的同时即被包裹于脂质体内。此方法的缺点在于，所需时间较长，有机相对水相的成分有影响，限制了待包封物的种类，装置对反应速度控制不佳，脂质体粒径不均匀，巨大粒径脂质体形成的量少，重复性差。由于采用传统脂质体制备方法制备巨型脂质体存在上述较多问题，因此，近年来研究人员提出了利用芯片结构制备巨型脂质体的微流控注入法，还有利用电极施加电场制备巨型脂质体的电制备法，这些方法都改善了巨型脂质体制备的效果。其中，利用芯片结构制备巨型脂质体的微流控注入法由Yung-Chieh Tan等人在 2003 年提出(Yung-Chi eh Tan,Kenneth Longmuir, Abraham P.Lee.microfluidicliposome generation from monodisperse droplet emulsion-towards therealizationof artificial cells [J].2003, Summer Bioengineering Conference.),该方法是:首先，将水相注入溶解有脂质体材料的特定有机溶剂中，通过芯片结构形成一定粒径的油包水液滴；随后，将油包水液滴从芯片收集出来，进行提取，离心，再重悬于水相中，最终形成巨型脂质体。之后，研究人员对该方法进行逐步改进，现在，通过芯片结构和液体流动精确控制，整个制备过程可以在芯片上完成，最终从芯片通道输出形成的巨型脂质体。但是，该方法需要精细加工芯片，精确控制液体流动，对有机相等试剂有所限制，对实验条件要求极高，而且制备巨型脂质体的效率低。利用芯片结构施加电场制备巨型脂质体的电制备法由Angelova和Dimitrov 在 1986 年提出(M.1.Angelova,D.S.Dimitrov.Liposome Electroformation [J].1986，81:303-311.)，最早该方法是首先将脂质材料溶于有机溶剂，然后将有机相滴加到平行丝状电极上，再在氮气下去除有机溶剂，形成脂质薄膜，然后，将水或其它含有待包封物的溶液加到到电极上，施加电信号，在电极上形成巨型脂质体。之后，研究人员对该方法和所用的芯片进行逐步改进，提出用表面更大，透明易于观察的两片ITO玻璃电极片替代平行丝状电极，用PDMS做电极间的间隔结构，按照需要调整电极间间距的芯片结构；之后，提出了在非导电材料上制备脂质膜，将其作为脂质体形成的基底，置于两电极之间，在基底上形成巨型脂质体的芯片结构；以及，采用硅作为基底材料制作表面阵列电极结构，用于制备特定粒径的巨型脂质体。但是，采用非导电材料置于电极之间制备巨型脂质体，对非导电材料的限制较多，形成在非导电材料层上的巨型脂质体难于观察；采用硅作为基底材料制作阵列电极结构，光无法透过硅基底，制备过程无法在倒置显微镜下观察，此夕卜，采用硅作为基底材料制作表面阵列电极结构需要专业加工，加工昂贵且复杂。综上所述，现有的这些利用芯片结构施加电场制备巨型脂质体的电制备法均还存在一些有待解决的问题，早期的电制备法采用的芯片简单，容易加工，但是，电制备过程无法精确控制，后期提出的改进芯片可以更精确的控制制备过程，但是，存在着难于观察、价格昂贵、操作复杂等缺点。此外，所有已提出的芯片都没有包含巨型脂质体分选、收集部分，脂质体的分选和收集需要增加后处理步骤，加大了难度，增加了投入，而且影响巨型脂质体的分选效果和最后的收集率。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种高效、简单、投入少、易于实现的巨型脂质体制备和收集的装置及其使用方法，其既包含电场制备巨型脂质体的部分，又包含对所制备的巨型脂质体分选收集部分的装置和使用该装置制备巨型脂质体并收集的方法。为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下:本装置包括信号发生器和制备并收集脂质体的芯片，其中制备并收集脂质体的芯片包括制备室、收集室、废液室和微通道，所述制备室包括上下一对电极和中间的制备腔室，电极通过导电胶带与信号发生器相连，制备腔室通过上层微通道与收集室相连，所述收集室包括上层收集腔室和下层收集腔室，两层腔室间间隔一层微孔滤膜，下层收集腔室通过下层微通道与废液室相连。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的信号发生器为能够给电极提供多种交流或者直流电信号的信号源。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述芯片包括基底平面和其上的壁面材料层，所述的制备腔室、收集室、废液室共同建立在同一基底平面上的壁面材料层中。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的收集室、废液室的数量为一个或者多个，且收集室和废液室的数量相同，一对一相连。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的制备室的上下一对电极中，基底电极采用基底平面，上层电极为放置于制备腔室上方并通过壁面材料层上的固定结构固定的一矩形平板。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的制备腔室通过上层微通道与上层收集腔室相连，下层收集腔室通过下层微通道与废液室相连。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的壁面材料层为上下两层，制备室的腔室于下层壁面材料层，制备室的上层电极固定结构位于上层壁面材料层；收集室的下层收集腔室位于壁面材料层的下层，上层收集腔室及微孔滤膜位于壁面材料层的上层；废液室的腔室位于上下两层壁面材料层。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的制备室和收集室通过位于上层壁面材料层的上层微通道连接，收集室和废液室通过位于下层壁面材料层的下层微通道连接。本发明的脂质体制备和收集装置中，所述的制备室腔室形状为圆形，所述的上层电极固定结构形状为矩形，且两结构的中心在纵向上重叠，圆形的直径大于矩形的宽，会露出两侧的弓形区域。该装置的其它特点是，所述的基底平面为上表面镀有一种导电材料ITO或者金的光滑平面。所述的壁面材料层为PDMS或者硅橡胶，一种绝缘且可塑材料。所述的平板为下表面镀有一种导电材料ITO或者金的表面光滑平板。所述的微孔滤膜表面光滑，孔径精确，吸附少，无介质脱落，孔径> 5 μ m，材质为聚碳酸酯。采用上述的脂质体制备和收集装置制备和收集脂质体的方法，技术方案为:制备腔室里添加溶有脂质材料的有机溶剂，再进行抽真空处理，待有机溶剂蒸发直至脂质材料在腔室基底上形成干燥的脂质膜后；将上层电极固定于上层壁面材料层中，通过制备室腔室两侧露出的弓形区域向腔室内添加水或其它含有待包封物的溶液再通过信号发生器对制备室电极施加电信号制备脂质体；待形成所需的巨型脂质体后，关闭信号发生器，向腔室内添加水或其它用于冲洗的溶液，将所需的脂质体通过上层壁面材料层的微通道冲洗到各个上层收集腔室；通过微孔滤膜分离，所需的脂质体停留在上层收集腔室，最后用于收集，其余的残留物则进入下层收集腔室，再通过微通道流入废液室，从而实现所需脂质体的制备和收集。该装置应用了加电制备巨型脂质体的原理，通过外加电场提高了巨型脂质体制备效率，此外，本发明提出利用不同孔径的微孔滤膜在同一芯片上对所制备的脂质体进行分离，收集所需粒径的巨型脂质体，减少了不必要的中间过程，简化巨型脂质体的分选、收集步骤，提高巨型脂质体的分离效率和收集效率。除上述外，本发明还具有体积小、成本低、操作简单等优点。
图1为根据本发明的一个实施例的脂质体制备和收集装置的组成示意图。图2为根据本发明的一个实施例的脂质体制备和收集装置的组成示意图。图3和图3A是本发明的脂质体制备和收集装置的制备室部分的结构组装和分解示意图。图4和图4A是本发明的脂质体制备和收集装置的收集室部分的结构组装和分解示意图。
图5和图5A是本发明的脂质体制备和收集装置的废液室部分的结构组装和分解示意图。图6和图6A是本发明的脂质体制备和收集装置的制备室和收集室连接部分的结构图和首I]面意图。图7和图7A是本发明的脂质体制备和收集装置的收集室和废液室连接部分的结构图和首I]面意图。在图1至图7中:1_信号发生器，2-制备并收集脂质体的芯片，3-制备室，4-收集室，5-废液室，6-导电胶带，7-基底电极，8-制备腔室，9-上层固定电极结构，10-上层电极，11-下层收集腔室，12-上层收集腔室，13-微孔滤膜，14-下层废液腔室，15上层废液腔室，16-上层微通道，17-下层微通道。
具体实施例方式以下是采用本发明结构的脂质体制备和收集装置制备并收集脂质体的方法的实施例，应当理解，以下实施例仅用于说明本发明的技术方案并非限制。实施例1:本实施例的脂质体制备和收集装置如图1、图3、图3A、图4、图4A、图5、图5A、图
6、图6A、图7和图7A所示，装置包括:发出电信号的信号发生器1，制备并收集脂质体的芯片2，本实施例中的信号发生器和制备并收集脂质体的芯片通过导电胶带6连接。其中制备并收集脂质体的芯片2中制作有制备室3、收集室4、废液室5。芯片2由基底平面和其上的壁面材料层构成，壁面材料层又分为上下两层。制备室3包括基底电极7和上层电极10，电极间为中间的制备腔室8，电极通过导电胶带6与信号发生器I相连，基底电极7为基底平面，基底平面为上表面镀有导电材料ITO或者金的光滑平面，制备腔室位于下层壁面材料层中，上层电极10为放置于制备腔室上方并通过壁面材料层上的固定结构固定的一矩形平板，平板为下表面镀有导电材料ITO或者金的表面光滑平板。制备腔室8通过上层微通道16与收集室4的上层收集腔室11相连。制备腔室8的形状为圆形，上层电极10的形状为矩形，且两结构的中心在纵向上重叠，圆形的直径大于矩形的宽，露出两侧的弓形区域。收集室包括上层收集腔室12和下层收集腔室11，两层腔室间间隔一层微孔滤膜13，下层收集腔室通过下层微通道17与废液室5相连。收集室的下层收集腔室11位于壁面材料层的下层，上层收集腔室12及微孔滤膜13位于壁面材料层的上层。废液室5的腔室位于上下两层壁面材料层中，分为下层废液腔室14和上层废液腔室15。将以卵磷脂和胆固醇以5:1的质量比混合溶解于乙醚溶剂中，加入荧光染料Dil(I, I' -dioctadecyl-3, 3, 3' , 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate)将有机相进行染色处理，然后，将该有机相滴加到制备室的基底电极7上，然后，采用氮气吹5min让乙醚蒸发，再将制备并收集脂质体的芯片2放置于真空环境下2小时，让乙醚完全蒸发，在基底电极上形成干燥的脂质膜后，向制备室3的制备腔室内添加去离子水，再通过导电胶带6连接信号发生器I和上层电极10、基底电极7，对制备腔室施加施加电信号2小时，在制备腔室8形成大量所需的巨型脂质体后，关闭信号发生器1，向制备腔室添加去离子水，将制备腔室内的溶液经过上层微通道16冲洗到收集室4的上层收集腔室12内，经过微孔滤膜13 (孔径10 μ m)的过滤筛选，非巨型脂质体、巨型脂质体(粒径彡10 μ m)和脂质体碎末就流到下层收集腔室11，然后再经过下层微通道17流到废液室5，符合要求的巨型脂质体就留在上层收集腔室，最后再用与收集使用。采用本实施例方法巨型脂质体(粒径> 10 μ m)的收集率为40%。实施例2:本实施例的脂质体制备和收集装置如图1所示。将以卵磷脂和胆固醇以5:1的质量比混合溶解于乙醚溶剂中，加入荧光染料DiI(I, I' -dioctadecyl-3, 3, 3' , 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate)将有机相进行染色处理，然后，将该有机相滴加到制备室的基底电极7上，然后，采用氮气吹5min让乙醚蒸发，再将制备并收集脂质体的芯片2放置于真空环境下2小时，让乙醚完全蒸发，在基底电极上形成干燥的脂质膜后，向制备室3的制备腔室内添加含有200mM葡萄糖和20mMNacl的溶液，再通过导电胶带6连接信号发生器I和上层电极10、基底电极7，对制备腔室8施加施加电信号2小时，在制备腔室形成大量所需的巨型脂质体后，关闭信号发生器1，向`制备腔室添加含有200mM葡萄糖和20mM Nacl的溶液，将制备腔室内的溶液经过上层微通道16冲洗到收集室4的上层收集腔室12内，经过微孔滤膜13 (孔径10 μ m)的过滤筛选，非巨型脂质体、巨型脂质体(粒径< IOym)和脂质体碎末就流到下层收集腔室11，然后再经过下层微通道17流到废液室5，符合要求的巨型脂质体就留在上层收集腔室12，最后再用与收集使用。采用本实施例方法巨型脂质体(粒径> 10 μ m)的收集率为60%。实施例3:本实施例采用的脂质体制备和收集装置的结构如图2所示，其基本结构与实施例1其相同，不同之处在于收集室4和废液室5的数量各有4个，它们一对一相连，以收集不同粒径的巨型脂质体。将以卵磷脂和胆固醇以5:1的质量比混合溶解于乙醚溶剂中，加入荧光染料Dil(
I,I' -dioctadecyl-3, 3, 3' , 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate)将有机相进行染色处理，然后，将该有机相滴加到制备室的基底电极7上，然后，采用氮气吹5min让乙醚蒸发，再将制备并收集脂质体的芯片2放置于真空环境下2小时，让乙醚完全蒸发，在基底电极上形成干燥的脂质膜后，向制备室3的制备腔室内添加200mM葡萄糖和20mM Nacl的含有微球的溶液(微球粒径为I μ m、浓度为lX10~9/mL)，再通过导电胶带6连接信号发生器I和上层电极10、基底电极7，对制备腔室施加施加电信号2小时，在制备腔室8形成大量所需的巨型脂质体后，关闭信号发生器1，向制备腔室添加含有200mM葡萄糖和20mM Nacl的溶液，将制备腔室内的溶液经过上层微通道16冲洗到收集室4的上层收集腔室12内，依次经过四个收集室4中的微孔滤膜13 (孔径依次为5 μ m、8 μ m、10 μ m、12 μ m)的过滤筛选，非巨型腔室11，然后再经过下层微通道17流到废液室5，符合要求的巨型脂质体就留在上层收集腔室12，最后再用与收集使用。采用本实施例方法巨型脂质体，各收集室的巨型脂质体(粒径> 5μπι，粒径^ 8μ ,粒径彡10 μ m,粒径彡12 μ m)的收集率依次为80%、60%、60%、60%。
权利要求
1.一种脂质体制备和收集装置，其特征在于:装置包括信号发生器和制备并收集脂质体的芯片，其中所述芯片中设置有制备室、收集室、废液室和微通道；所述制备室包括上下一对电极和中间的制备腔室，电极通过导电胶带与信号发生器相连，制备腔室通过微通道与收集室相连；所述收集室包括上层收集腔室和下层收集腔室，两层腔室间间隔一层微孔滤膜，上层收集腔室通过微通道连通制备腔室，下层收集腔室通过微通道与废液室相连。
2.根据权利要求1所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述芯片包括基底平面和其上的壁面材料层，所述制备腔室、收集室、废液室和微通道制作在壁面材料层中。
3.根据权利要求1所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述信号发生器为能够给电极提供多种交流或者直流电信号的信号源。
4.根据权利要求1所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述收集室、废液室的数量为一个或者多个，且收集室和废液室的数量相同，一对一相连。
5.根据权利要求1-4之任一项所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述制备室的上下一对电极中，基底电极为基底平面，所述基底平面为上表面镀有导电材料ITO或者金的光滑平面，上层电极为放置于制备腔室上方并通过壁面材料层上的固定结构固定的一矩形平板，平板为下表面镀有导电材料ITO或者金的表面光滑平板。
6.根据权利要求5所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述的壁面材料层为PDMS或者硅橡胶，一种绝缘且可塑材料。
7.根据权利要求5所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述的壁面材料层为上下两层，制备腔室于下层壁面材料层中，制备室的上层电极固定结构位于上层壁面材料层中；收集室的下层收集腔室位于壁面材料层的下层，上层收集腔室及微孔滤膜位于壁面材料层的上层；废液室的腔室位于上下两层壁面材料层；连接制备室和收集室的微通道位于上层壁面材料层中，连接收集室和废液室的微通道位于下层壁面材料层中。
8.根据权利要求5 所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述的制备室腔室形状为圆形，所述的上层电极固定结构形状为矩形，且两结构的中心在纵向上重叠，圆形的直径大于矩形的宽，露出两侧的弓形区域。
9.根据权利要求5所述的脂质体制备和收集装置，其特征在于:所述的微孔滤膜孔径^ 5 μ m，材质为聚碳酸酯。
10.一种使用权利要求1-9之任一项所述装置的制备和收集脂质体的方法，其特征在于:首先在制备腔室里添加溶有脂质材料的有机溶剂，进行抽真空处理，待有机溶剂蒸发直至脂质材料在腔室基底上形成干燥的脂质膜后；将上层电极固定于上层壁面材料层中，通过制备室腔室两侧露出的弓形区域向腔室内添加水或其它含有待包封物的溶液，再通过信号发生器对制备室电极施加电信号制备脂质体；待形成所需的巨型脂质体后，关闭信号发生器，向腔室内添加水或其它用于冲洗的溶液，将所需的脂质体通过上层壁面材料层的微通道冲洗到各个上层收集腔室；通过微孔滤膜分离，所需的脂质体停留在上层收集腔室，最后用于收集，其余的残留物则进入下层收集腔室，再通过微通道流入废液室，从而实现所需脂质体的制备和收集。
全文摘要
本发明公开一种脂质体制备和收集装置及方法，所述装置包括信号发生器和制备及收集芯片。制备及收集芯片包括制备室、收集室、废液室，所述制备室包括电极对和制备腔室，电极对通过导电胶带连接信号发生器，所述收集室包括上层收集腔室和下层收集腔室，两层腔室之间间隔一层微孔滤膜，所述制备室，收集室和废液室之间通过微通道连接。脂质体制备及收集装置主要应用了加电制备脂质体的方法，并在同一芯片上利用微孔滤膜对脂质体进行收集处理，本发明与现有技术相比具有以下技术效果高效制备巨型空白脂质体或者载有药物、蛋白、微粒的巨型脂质体；脂质体制备及收集一体化减少中间过程；所需试剂量少。
文档编号B01L3/00GK103182333SQ20131006631
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者杨军, 王振宇, 胡宁, 郑小林, 陈曦, 林炳文, 王琼 申请人:重庆大学