用于一次性生物技术方法的改良深层滤器的制造方法
用于一次性生物技术方法的改良深层滤器的制造方法
【专利摘要】一种初步澄清进料的方法，所述方法包括化学处理的絮凝的进料，包含所关注的靶生物分子如mAb、哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物，使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤。所述初步澄清深层过滤装置包含多孔深层滤器，具有不同孔评级的分级多孔层。所述初步澄清深层过滤装置以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤液体进料，包括化学处理的絮凝的进料，其包含絮凝的细胞碎片和胶体颗粒，具有约0.5pm-200pm的粒径分布。还提供使用和制备所述初步澄清深层过滤装置的试剂盒和方法。
【专利说明】用于一次性生物技术方法的改良深层滤器
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年7月8日提交的美国临时专利申请第61/571，994号的权益，其全部内容援引加入本文。
【技术领域】
[0003]一般来说，本发明涉及进料的初步澄清。在某些具体实施方案中，本发明提供进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清深层过滤方法，其利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。在其他实施方案中，本发明提供化学处理的进料的初步澄清深层过滤方法，其中细胞团已絮凝为较大的聚集体。
【背景技术】
[0004]制备包括蛋白如单克隆抗体(mAb)在内的药物级别的生物分子是一个复杂的制备过程，包括设计用来制备用于患者的高质量产品的多种过滤、离心和色谱技术。细胞培养收获物和高固体原料的澄清可以是艰巨的任务，这是由于来自现代化生产批量生物反应器的大体积收获物25，000L)和高细胞密度通常在随后的色谱操作之前需要初步以及二次澄清。因此，细胞收获物和高固体原料如哺乳动物细胞和mAb的制备过程的收获和澄清是过去20年左右进行的许多演变和评价的产物。
[0005]现在通常期望哺乳动物细胞培养物和mAb的收获技术以高收率(>95%)和最小细胞破裂的方式操作。随 着产物分子滴度增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战。较高的细胞密度在澄清和无菌过滤期间造成困难。较高的产物浓度一般导致增加的杂质负荷且需要较大的色谱安装。因此，提高效率和通量形式的改良大受欢迎。
[0006]渐增的治疗性mAb需求使得人们致力于增加工业治疗性单克隆抗体生产的产品生产、质量、加工效率和成本效益。过去十年见证了生产、上游细胞培养产物滴度的大幅增长以及表征杂质和污染物的技术进步。
[0007]进料、进料流、原料、细胞培养液等(包括高固体进料，例如包含mAb和哺乳动物细胞培养原料的高固体进料)的初步澄清去除大量生物质，特别是全细胞和其他较大的细胞碎片，然后二次澄清，去除较小的胶体颗粒以及损害下游滤器容量的其他颗粒。在mAb和哺乳动物细胞培养液和原料的生产过程中，离心通常是初步澄清步骤。
[0008]mAb生产商投入了大量时间和精力增加原料的产品滴度。然而，虽然较高滴度增加细胞培养生产率，但是其还产生具有较大量生物质和细胞碎片含量的原料。包含这样较大量生物质和细胞碎片的进料可以在离心后产生高浊度离心液(centrate)。高浊度离心液常减少离心下游使用的二次澄清深层滤器和随后的无菌滤器的产量。减少的产量引起一系列问题，从增加的加工成本到加工过程的偏差，这是由于滤器的堵塞和长期加工延迟。最后，使用离心初步澄清在运行之间需要广泛的经过验证的清洁程序以试图减少批次和治疗性分子物质之间交叉污染的风险。
[0009]在期望于相对短的时间内加工多种产物的试验或临床规模的生物治疗性生产中，这特别有问题。离心清洁程序减慢试验工厂转换至生产不同生物分子的能力，并且大大增加生产运行之间交叉污染的风险。此外，在初步澄清步骤中，离心不可以有效地从这些原料去除所有颗粒和细胞碎片，因此在离心步骤之后，随后的色谱步骤之前需要利用深层过滤的二次澄清步骤。
[0010]或者，已证实连续过滤运行可用于从原料去除不同大小的细胞和细胞碎片，但是通常体积通量限制应用于较小体积(〈1000L)，其中滤器安装具有合理的大小。过滤的使用大大减少交叉污染的风险，并且在运行之间无需清洁和清洁验证，这是由于过滤装置的一次性性质。不幸的是，低通量要求大量的滤器单元，这可以减少过滤收率，因为每个连续步骤导致通过滤器装置和设备的滞留体积损失一部分的进料溶液。
[0011]为了进一步提高澄清性能、通量和下游过滤操作，已使用细胞培养收获物的絮凝。絮凝剂是这样的一类物质，其可以从溶液聚集和凝集细颗粒，导致它们从液相沉降且溶液浊度减少。
[0012]絮凝可以以各种方式完成，包括聚合物处理、化学处理(pH改变)或添加表面活性剂。使用絮凝剂沉淀可以用来选择性地去除杂质，同时将蛋白产物留在溶液中。但是，絮凝剂尚未广泛用于mAb、哺乳动物细胞和所关注的原料的其他生物分子细胞材料的澄清。
[0013]通过化学品絮凝细胞培养收获物需要使用酸如乙酸，或者聚合物如壳聚糖、多糖、多胺或聚丙烯 酰胺。絮凝已用作可选分离技术以增加离心澄清通量和离心液质量，从而改善下游过滤操作。虽然化学絮凝在团聚细胞碎片和细胞污染物(宿主细胞蛋白和DNA)中非常有效，但是所得的絮凝悬浮液一般不易于在过滤之前不使用离心而通过普通过滤方法分离。
[0014]絮凝剂沉淀细胞、细胞碎片和蛋白，这是因为蛋白上的电荷与聚合物(例如聚电解质)上的电荷的相互作用，产生不溶性复合物，并且随后通过剩余电荷相互作用或通过复合物上的疏水斑块桥接不溶性复合物以形成较大的簇集。为了去除这些大簇集，离心步骤或切向流微滤是澄清的主要模式，然后进行二次澄清步骤，其中深层过滤广泛用于在捕获色谱步骤之前澄清细胞培养液。因为离心不可以递送不含颗粒的离心液，下游需要进一步安装深层滤器(二次深层过滤)和无菌滤器。
[0015]切向流微滤(也称为交叉流微滤)与离心竞争从哺乳动物细胞培养物收获和澄清mAb和治疗性产物。这种技术提供的一个优点是产生不含颗粒的收获液，需要极少的额外过滤。但是，用于细胞培养收获物的切向流微滤膜常受到膜污染问题(无法挽回的膜通量下降)的困扰，并且通常每次使用之后对膜需要按照完全清洁方案的严格复杂的操作条件(对离心也是如此)。为了解决这个问题，使用优化的膜化学，用一般对显著污染较不敏感的更亲水的切向流微滤膜。
[0016]传统上，絮凝一般用来团聚不可变形的固体颗粒。例如，因为它们的小粒径而非常难以过滤的超微粘土或二氧化钛颗粒的稀悬浮液可以化学絮凝并由此容易地分离，因为这些超微颗粒的大小通过更快沉降的团聚絮状物的形成而大大增加，从而因为滤饼内的大流量通道而更快过滤。
[0017]但是，当化学絮凝用于mAb原料或其他生物分子/细胞原料时，因为这些生物分子材料的生物学特征的性质，所得的团聚是独特的，并且完全不同于土材料和金属氧化物的不可变形的固体颗粒。大多数固体不可变形的颗粒如土材料或金属氧化物具有远高于水的密度。因此，一旦这些小颗粒絮凝，它们的粒径大大增加，并且所得的絮状物通过重力迅速沉降(即，以分钟计)。相比之下，细胞、mAb和其他生物分子物质由氨基酸和水组成，并且具有与水的密度非常接近的密度。因此，絮凝的细胞和其他生物分子不容易沉淀，并且通常在沉降发生之前经历数小时。
[0018]另一问题是相对低密度的絮凝细胞团，其通常形成蓬松的团，占据显著部分的进料体积但不形成压实的滤饼。而且，因为颗粒的生物来源，絮状物易碎，并且往往在压力下容易分解。
[0019]为了这个原因，大多数常规的固体-液体分离方法虽然可用于固体颗粒系统，但是不能絮凝细胞团如mAb原料。
[0020]据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们非常有效地去除污染物并且是一次性形式，从而消除了与可重复使用的硬件设施相关的验证和污染问题，例如在使用离心时遇到的那些问题。但是，深层滤器目前不能操作高滴度mAb过程的典型的高固体进料流，因此常在离心后使用深层滤器。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。
[0021]但是，深层滤器目前不能操作高固体进料流的初步澄清，并且通常必须在离心或切向流微滤之后使用。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。目前，有限的通量导致深层滤器的大型设备用于初步澄清，导致收率损失，这是由于如上文所讨论的大滞留体积和放大问题。
[0022]此外，因为存在较高的生物质含量，mAb原料对于澄清和滤器是挑战性的进料流，并且在离心后导致高浊度的离心液。因为需要去除大量的生物质，高浊度的离心液缩短了澄清下游的深层滤器的寿命。需要改进mAb的澄清，从而导致较高的通量。
[0023]鉴于上述初步澄清过程，其依赖于使用初步澄清离心步骤或初步澄清微滤步骤，然后是依赖于深层过滤介质的二次澄清步骤以出去较大的颗粒，需要一次性的合理可靠且完成不会非常昂贵的初步澄清方法，其不使用初步澄清离心或微滤步骤然后额外的二次澄清步骤。
【发明内容】
[0024]根据上述需求以及与进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清过程相关的问题，本发明通过使用初步澄清深层过滤方法克服了挑战，所述方法利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
[0025]本发明涵盖一种通过深层过滤初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和胶体颗粒的进料、进料流、原料、细胞培养液等但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的方法，所述方法包括:
[0026]a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
[0027]b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和颗粒的进料流，其中所述细胞碎片和颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布；
[0028]c)使所述多孔深层滤器介质与所述进料流接触，从而所述深层滤器介质能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤具有约0.5 μ m_约200pm的粒径分布的细胞碎片和颗粒；以及
[0029]d)分离所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
[0030]本发明还涵盖一种使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过深层过滤初步澄清其中包含所关注的靶生物分子或所关注的生物治疗剂以及絮凝的细胞碎片、物质和胶体颗粒的絮凝的进料的方法，所述方法包括:
[0031]a)提供包含多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
[0032]b)提供化学絮凝剂；
[0033]c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料；
[0034]d)将所述化学絮凝剂与所述进料混合；
[0035]e)在所述进料中形成化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒，并且任选地化学絮凝所关注的靶生物分子；
[0036]f)使所述多孔深层滤器介质与包含化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料接触；以及
[0037]g)分离絮凝的所关注的 生物分子物质与多种絮凝的细胞物质但不使用离心澄清步骤或切向流微滤澄清步骤。
[0038]本发明涉及进料的初步澄清，其使用深层过滤装置但不使用初步澄清步骤或初步澄清切向流微滤步骤，所述深层过滤装置能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤包含具有约0.5 μ m-200pm的粒径分布的颗粒的高固体进料直至TMP达到20psi。本文所教导的初步澄清深层滤器包括不同空隙评级的分级多孔层。
[0039]本文提供的初步澄清多孔各向异性深层滤器介质的一个优选应用是初步澄清化学处理的絮凝的高固体进料，所述高固体进料包含所关注的生物分子物质或生物治疗剂以及多种絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
[0040]在某些实施方案中，本发明提供一种在包含mAb、哺乳动物细胞培养物、植物细胞培养物、细菌培养物、昆虫细胞培养物以及所关注的其他生物分子材料和培养物的絮凝的进料的初步澄清中使用具有多孔滤器介质的深层过滤装置的方法，通过从所关注的生物分子物质有效分离絮凝的聚集的细胞团和碎片但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过使用基于纤维的多孔深层滤器介质，其能够进行包含非常大颗粒的高体积原料的深层过滤而没有不期望的滤饼过滤效应。
[0041]在某些实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有多个分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(Pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒，其中使用絮凝剂。
[0042]在其他实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有开放分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清深层过滤，使得能够深层过滤具有0.5 μ m-200 μ m粒径的细胞碎片和胶体颗粒，从而提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应。
[0043]在某些实施方案中，本发明提供深层过滤介质:
[0044]a)具有细胞碎片的大絮状物穿透的大孔，没有不期望的滤饼过滤效应或在滤器的孔内形成絮状物桥接；
[0045]b)具有非常高的深度以分散细胞团，从而防止会导致介质中的内部滤饼过滤的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低，压力的浓度降低可以引起絮状物分解。
[0046]c)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，其匹配原料中絮状物大小的群体。对于某些具有大量细小絮状物的原料，例如从酸性絮凝代替聚合物产生的原料，深层滤器层包括复合介质，其具有毛毡材料、DE和短纤维的组合，因为需要精细去除；
[0047]d)对于平均粒径大于10 μ m的所关注的生物分子物质的初步澄清，通常絮凝剂和化学处理的进料流的初步澄清，其中深层滤器包括具有开放标称孔径评级的非织造纤维的分级层，能够过滤具有大量固体的絮凝的进料流； [0048]e)具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土(diamatoceousearth)的复合分级层，其能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料流；
[0049]f)虽然具有较大的通透性，但对聚合物絮凝剂(例如智能聚合物(SmP)、壳聚糖等)处理的进料具有良好的保持特性；
[0050]g)虽然具有较大的通透性，但是对聚合物絮凝剂(例如酸沉淀、辛酸等)处理的进料具有良好的保持特性；
[0051]h)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用；以及
[0052]i)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含絮凝的细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用。
[0053]在某些实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有〈约25pm的标称孔径，包含非织造纤维的分级层。
[0054]在其他实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有〈25约Pm的标称孔径，包含至少三层非织造纤维的分级层。
[0055]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有 > 约25pm的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的絮凝的进料流。
[0056]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有〉约25 μ m的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的聚合物絮凝的进料流。
[0057]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有〉约25 μ m的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的聚合物絮凝的进料流，从而导致〈20NTU的浊度输出。
[0058]为了克服目前与深层滤器相关的挑战，本发明涉及初步澄清深层滤器介质的开发以及使用初步澄清深层滤器介质的方法，所述初步澄清深层滤器介质可以以约10升/m2/hr (10LMH)-100升/m2/hr (100LMH)的流速过滤具有约0.5微米-200微米的粒径分布的包含高固体的液流直至TMP达到20psi。初步澄清深层滤器包括具有各种孔隙评级的分级层，应用于聚合物和化学处理的絮凝的进料的初步澄清。
[0059]本发明涉及用于一次性初步澄清方法的深层滤器。将开放分级层用于深层过滤使得能够过滤包含大簇集的进料，具有消除离心的潜力，并且使得能够过滤具有约0.5微米-约200微米的粒径的较高固体，从而提高这些未澄清的进料流的通量。
[0060]本发明的额外的特征和优势会在下文的详细描述和权利要求书中示出。本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。应当理解上文的一般描述和下文的详细描述、权利要求书以及附图仅为示例性和解释性的，并且旨在提供本发明教导的各种实施方案的解释。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0061]并入并构成本说明书的一部分的【专利附图】
【附图说明】目前考虑的本发明的实施方案，并且与说明一起用来解释本发明的原理。
[0062]图1A、1B、1C、1D、1E和IF示出本发明的初步澄清深层滤器的实例的不同原理的实施方案，其中图1A(8层)、图1C(7层)和图1E(8层)示出用于聚合物絮凝剂(智能聚合物)处理的进料的初步澄清深层滤器，而图1B、1D和IF示出用于化学处理的进料(酸处理)的具有至少8层的初步澄清深层滤器；以及
[0063]图2是如本文所述的示例性初步澄清深层滤器纯化方法的示意图。所示的纯化方法使用生物反应器用于细胞培养，然后进行以下方法步骤:初步澄清深层过滤；蛋白A结合和洗脱色谱(捕获)；病毒灭活；流过(flow-through)纯化；以及配制。如图所示，每个方法步骤采用一种或多种装置，用来达到方法步骤的预期结果。如图所示，澄清采用如本文所教导和图1A-1F所示的分级澄清深层过滤；利用连续多柱色谱(CMC)进行蛋白A结合和洗脱色谱；病毒灭活采用两个连续(in-line)静态混合器；流过纯化采用活性炭(AC)，然后阴离子交换(AEX)色谱，然后利用连续静态混合器和缓冲罐进行pH改变，然后流过阳离子交换(CEX)色谱和病毒过滤；而配制采用渗滤/浓缩切向流过滤装置，然后无菌过滤。在整个过程中还采用一个或多个无菌滤器。 【具体实施方式】
[0064]无论上文或下文引用的所有出版物、专利和专利申请整体援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物、专利或专利申请援引加入本文相同。
[0065]为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，无论是否明确指出，说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、物质的百分比或比例、反应条件的所有数目以及其他数值应理解为在所有情况下受到术语“约”修饰。术语“约” 一般指认为等同于所列举的值(即，具有相同功能或结果)的一定范围的数目。在许多情况下，术语“约”可以包括最近的有效数字左右的数目。
[0066]因此，除非有相反的指示，以下说明书和所附权利要求书中所示的数值参数为近似值，其可以根据本发明追求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图限制权利要求书的范围的等同物的原则的应用，每个数值参数应当至少根据报道的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解。
[0067]尽管示出本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是具体实例中所示的数值尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地包含在它们各自的试验测量中发现的标准差所致的必需的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包括的所有亚范围。例如，“1-10”的范围包括最小值I和最大值10之间的任何和所有亚范围(并且包括最小值I和最大值10)，即具有等于或大于I的最小值以及等于或小于10的最大值的任何和所有亚范围，例如5.5-10。
[0068]在进一步详细描述本发明之前，会定义许多术语。使用这些术语并不限制本发明的范围，而仅用来方便本发明的描述。
[0069]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所涉及的领域的技术人员通常理解的相同的含义。为了如本文所述的发明的目的定义以下术语。
[0070]如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。
[0071]如本文所用，术语“生物反应器”指支持生物活性环境的任何制造或涉及的装置或系统。在某些情况下，生物反应器是其中进行生物培养过程的容器，其包含生物体或来源于这类生物体的生物化学活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。常用的生物反应器通常是圆柱形的，大小从升到立方米，并且常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器由除钢以外的材料制成，并且是一次性或单次使用的。考虑生物反应器的总体积可以是从IOOmL到高达10，000升或更多的任何体积，这取决于具体过程。在本文所述的方法和系统的一些实施方案中，将生物反应器连接至单元操作如深层滤器。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器用`于细胞培养以及沉淀，其中可以将沉淀剂直接加入生物反应器，从而沉淀一种或多种杂质。
[0072]术语“细胞培养物”指悬浮液、滚瓶、烧瓶等中生长的细胞，以及悬浮液本身的组分，包括但不限于细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、HCP、宿主细胞蛋白(HCP)和DNA、mAb、絮凝剂。术语“细胞培养物”还涵盖大规模方法，例如生物反应器，包括在搅拌的发酵罐中粘附至微载体生长的粘附细胞。此外，在要求保护的发明的方法中可以不仅培养接触依赖性细胞，还使用悬浮培养技术。示例性微载体包括例如葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及如Butler, Spier&Griff iths, Animal cellBiotechnology3:283-303 (1988)所述的其他微载体。还可以使用多孔载体如Cytoline.RTM.或Cytopore.RTM.,以及基于葡聚糖的载体如DEAE-葡聚糖(Cytodexl.RTM.)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex2.RTM.)或基于明胶的载体如明胶包被的葡聚糖(Cytodex3.RTM.)。本发明涵盖蛋白的大规模和小规模制备的细胞培养方法。可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌釜式生物反应器系统的方法，有或无微载体，并且可选地以分批、补料分批或灌注模式操作。
[0073]术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长动物细胞如哺乳动物细胞的营养液。这样的营养液一般包括细胞粘附、生长和维持细胞环境所必需的各种因子。例如，典型的营养液可以包括基础培养基制剂、取决于细胞类型的各种补充物以及任选存在的抗生素。在一些实施方案中，营养液可以包括来自一种或多种以下物质的至少一种组分:1)能源，通常为碳水化合物如葡萄糖形式；2)所有必需氨基酸，并且通常是20种氨基酸的基本集合加上胱氨酸；3)在低浓度时需要的维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；以及5)微量元素，其中微量元素定义为通常在非常低的浓度(通常在微摩尔范围中)时需要的无机化合物或天然存在的元素。营养液可以任选地补充了来自任何以下物质的一种或多种组分:I)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷酸盐；3)核苷和碱基，例如腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及4)蛋白和组织水解物。一般来说，可以使用任何合适的细胞培养基。培养基可以包含血清,例如胎牛血清、小牛血清等。可选地，培养基可以是不含血清的，非动物的，或者不含蛋白的。
[0074]如本文所用，术语“细胞培养添加剂”指某种分子(例如，非蛋白添加剂)，将其加入细胞培养过程以促进或改善细胞培养或发酵过程。在本发明的一些实施方案中，如本文所述，刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种细胞培养添加物。示例性细胞培养添加剂包括消泡剂、抗生素、染料和营养物。
[0075]在本文中可交换使用的术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”指来源于中国仓鼠卵巢(“CH0”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP —般作为杂质存在于细胞培养基或裂解物中(例如，收获的包含所关注的蛋白或多肽(例如，CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养液)。一般来说，包含所关注的蛋白的混合物中存在的CHOP的量提供所关注的蛋白的纯度的度量。通常，蛋白混合物中CHOP的量以相对于混合物中所关注的蛋白的量的百万分比表示。应当理解当宿主细胞为另一哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞时，HCP指在宿主细胞的裂解物中找到的除靶蛋白之外的蛋白。
[0076]在本文中可交换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”指任何外源或不期望物质，包括生物大分子如DNA、RNA、一种或多种宿主蛋白(HCP或CHOP)、内毒素、病毒、脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于包含所关注的蛋白或多肽(例如，抗体)的样品中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离自一种或多种外源或不期望分子，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物从包含所关注的蛋白或以及一种或多种杂质的样品结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种杂质，从而分离所关注的多肽或蛋白与一种或多种杂质。
[0077]如本文所用， 术语“缓冲罐”指在方法步骤之间或方法步骤内(例如，当单一方法步骤包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或器皿或袋；其中来自一个步骤的产出流过缓冲罐至下一步。因此，缓冲罐不同于混合物罐(pool tank)，其并不意图盛放或收集来自步骤的整个体积的产出；而是取而代之使得来自一个步骤的产出能够连续流至下一步。在一些实施方案中，在本文所述的方法或系统的两个方法步骤之间或方法步骤内使用的缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的25%。在另一实施方案中，缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的10%。在一些其他实施方案中，缓冲罐的体积少于生物反应器中细胞培养物的整个体积的35%、或者少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%，所述生物反应器中的细胞培养物构成纯化靶分子的起始原料。
[0078]术语“静态混合器”指用于混合两种流体物质，通常为液体的装置。该装置一般由圆柱形(管)外壳中所含的混合器元件组成。总系统设计并入将两个液流递送入静态混合器的方法。当流过混合器时，非移动元件连续混合物质。完全混合取决于多个变量，包括液体的特性、管的内径、混合器元件的数量和它们的设计等。
[0079]如本文所用，术语“深层滤器”(例如，梯度-密度深层滤器)在滤器材料的深度内完成过滤。这类滤器的一种常见类型是包含连接(或者固定)的随机基质以形成流动通道的复杂的曲折迷宫的滤器。这些滤器中的颗粒分离一般由纤维基质截留或吸附指纤维基质所致。细胞培养液和其他原料的生物加工最常用的深层滤器由纤维素纤维、助滤剂如DE和带正电荷的树脂粘合剂组成。不像绝对滤器，深层滤器介质在整个多孔介质截留颗粒，允许截留大于或小于孔径的颗粒。据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们去除污染物，并且还是一次性形式，从而消除了验证问题。
[0080]如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAR0SE?或PR()SEPS,:-A的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
[0081 ] 如本文所用，术语“离子交换”和“离子交换色谱”指这样的色谱过程，其中混合物中所关注的溶质或分析物(例如，纯化的靶分子)与连接(例如通过共价连接)至固相离子交换材料的带电荷的化合物相互作用，从而所关注的溶质或分析物非特异性地与带电荷的化合物相互作用，比与混合物中的溶质杂质或污染物相互作用多或少。混合物中的污染溶质比所关注的溶质更快或更慢从离子交换材料的柱洗脱，或者相对于所关注的溶质结合至树脂或从树脂排除。
[0082]“离子交换色谱”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱。例如，阳离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fe区的靶蛋白)，然后洗脱(例如，利用阳离子交换结合和洗脱色谱或"CIEX")，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱(阳离子交换流过色谱FT-CIEX)。阴离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fe区的靶蛋白)，然后洗脱，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱，也称为负色谱。在一些实施方案中，并且如本文所示的实施例所证实的，以流过模式进行阴离子交换色谱步骤。[0083]术语“离子交换基质”指带负电荷(即，阳离子交换介质)或带正电荷(即，阴离子交换介质)的基质。电荷可以通过将一种或多种带电荷的配体例如通过共价键连接至基质来提供。可选地或额外地，电荷可以是基质的固有特性(例如，在二氧化硅的情况下，其具有总体负电荷)。
[0084]在本文中术语“阴离子交换基质”指带正电荷的基质，例如具有连接至它的一种或多种带正电荷的配体，如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAEsephadexts^pfast q sepharose?(ge Healthcare)。可以用于本文所述的方法和系统的其
他示例性材料是 Fractogel? EMD TMAE、Fractogel? EMD TMAE highcap、Eshmuno? Q和 Fractogel? EMD DEAE (EMD Millipore) ο
[0085]术语“阳离子交换基质”指带负电荷的基质，并且其具有游离的阳离子用于与基质的固相接触的水溶液中的阳离子交换。带负电荷的配体连接至固相以形成阳离子交换基质，或者树脂可以是例如羧酸盐或磺酸盐。可商购的阳离子交换基质包括羧基-甲基-纤维素、固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如，SP-SEPHAR0SE FAST FLOW?或SP-SEPHAR0SEHIGH PERFORMANCE?，来自GE Healthcare)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如来自GEHealthcare 的 S-SEPHAR0SE FAST FLOW?)。优选 Fractogel? EMD SO3、Fractogel? EMD
SE Highcap、Eshimmo? S 和Fractogel? EMD COO (EMD Millipore) O
[0086]如本文所用，术语“杂质”或“污染物”指任何外源或有害分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一种或多种宿主细胞蛋白，内毒素，脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于利用本发明的方法分离自一种或多种外源或有害分子的包含靶分子的样品中。此外，这类杂质可以包括用于在本发明的方法之前进行的步骤的任何试剂。杂质的性质可以是可溶性的或不溶性的。
[0087]如本文所用，术语“不溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体为悬浮颗粒或固体。示例性不溶性杂质包括全细胞、细胞片段和细胞碎片。
[0088]如本文所用，术语“可溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体不是不溶性杂质。示例性可溶性杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、RNA、病毒、内毒素、细胞培养基组分、脂质等。
[0089]如本文所用，术语“连续方法”指纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，从而来自一个方法步骤的产出直接流入方法中的下一方法步骤，没有中断，并且其中两个或更多个方法步骤可以在它们的持续时间的至少一部分同时进行。换句话说，在连续方法的情况下，如本文所述，不必在下一方法步骤开始之前完成方法步骤，但是一部分样品通常移动通过方法步骤。术语“连续方法”还用于方法步骤内的步骤，在这种情况下，在包括多个步骤的方法步骤进行期间，样品连续流过进行方法步骤所需的多个步骤。本文所述的这样的方法步骤的一个实例是流过纯化步骤，其包括以连续方式进行的多个步骤，例如流过活性炭，然后流过AEX介质、然后流过CEX介质，然后流过病毒过滤。
[0090]在一些实施方案中，如本文所述，深层滤器用于澄清，之后澄清的细胞培养物可以连续流指纯化过程中 的下一步，例如结合和洗脱色谱步骤(例如，蛋白A亲和色谱)。
[0091]如本文所用，术语“半连续方法”指用于纯化靶分子的一般连续方法，其中任何单一方法步骤中流体材料的输入或输出是不连续的或间歇的。例如，在本发明的一些实施方案中，方法步骤(例如，结合和洗脱色谱步骤)中的输入可以连续装载；但是输出可以间歇地收集，其中纯化过程中的其他方法步骤是连续的。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法和系统的性质是“半连续的”，其中它们包括至少一个以间歇方式操作的单元操作，而方法或系统中的其他单元操作可以以连续方式操作。
[0092]术语“连接的方法”指用于纯化靶分子的方法，其中所述方法包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，互相直接流体连通，从而流体材料在过程中连续流过方法步骤，并且在方法的普通操作期间同时与两个或更多个方法步骤接触。应当理解有时，方法中的至少一个方法步骤可以通过屏障如处于关闭位置的阀暂时从其他方法步骤分离。这种单独方法步骤的暂时分离可以是必需的，例如在加工启动或关闭期间或者在去除/置换单独单元操作期间。术语“连接的方法”还用于方法步骤内的步骤，例如，当方法步骤需要进行几个步骤以达到方法步骤的预期结果时。一个这样的实例是如本文所述的流过纯化方法步骤，其可以包括以流过模式进行的几个步骤，例如活性炭；阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和病毒过滤。
[0093]如本文所用，术语“流体连通”指两个方法步骤之间流体材料的流动或者方法步骤的步骤之间流体材料的流动，其中方法步骤通过任何合适的方式(例如，连接线或缓冲罐)连接，从而使得流体能够从一个方法步骤流至另一方法步骤。在一些实施方案中，两个单元操作之间的连接线可以被一个或多个阀中断以控制流体流过连接线。[0094]如本文所用，术语“纯化(purifying)化(purification) ”、“分开(separate)，，、“分开(separating)，，、“分开(separation) ”、“分离(isolate)，，、“分离(isolating) ”或“分离(isolation) ”指增加来自包含祀分子以及一种或多种杂质的样品的靶分子的纯度。通常，通过从样品去除(完全或部分)至少一种杂质来增加靶分子的纯度。
[0095]如本文所用，术语“沉淀(precipitate) ”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation) ”指用于澄清的方法,其中改变不期望的杂质的特性,从而它们可以更容易地从可溶性靶分子分离。这通常通过形成包含不期望的杂质的大团聚颗粒和/或不溶性复合物来完成。这些颗粒具有这样的特性(例如密度或大小)，从而它们可以更容易地例如通过过滤或离心从包含可溶性靶分子的液相分离。在某些情况下，引起相分离，从而可以更容易地从可溶性靶分子分离不期望的杂质。通过相改变沉淀可以通过添加沉淀剂如聚合物或小分子来进行。在具体实施方案中，沉淀剂为刺激响应性聚合物，也称为只能聚合物。在本文所述的一些实施方案中，沉淀剂或`沉淀试剂为絮凝剂。如本文所用，絮凝是一种进行沉淀的方式，其中性能通常取决于所用的絮凝剂浓度(“剂量依赖性”)。典型的絮凝剂是与带相反电荷的杂质络合的聚电解质，例如聚阳离子。
[0096]在本文所述的一些实施方案中，澄清采用将沉淀剂加入包含靶分子以及一种或多种杂质的样品，然后深层过滤。在某些情况下，溶液条件(例如温度、pH、盐度)的改变可以用来开始沉淀，例如在刺激响应性聚合物的情况下。去除包含一种或多种杂质以及沉淀剂的沉淀的物质，从而回收液相中的靶分子，然后通常使液体进行进一步的方法步骤以进一步纯化靶分子。
[0097]沉淀可以在包含表达待纯化的靶分子的细胞培养物的生物反应器中直接进行，其中将沉淀剂直接加入生物反应器。或者，可以在单独的容器中将沉淀剂加入细胞培养物，所述细胞培养物通常包含靶分子。
[0098]本领域技术人员已知许多方法去除沉淀的物质，例如过滤或沉降或它们的任何组
入
口 ο
[0099]如本文所用，术语“沉降”指沉淀过程，其中沉淀的物质在重力的影响下迁移至容器的底部。沉降之后可以倒出或过滤液相或上清。
[0100]如本文所用，术语“智能聚合物”(SmP)，(也称为刺激响应性聚合物或聪明聚合物(intelligent polymer)或亲和大配体(AML))表示一组聚合物,其对外部刺激如环境条件如pH、温度、光、离子强度、辐射、电压、外部压力、溶剂组成的改变或其他刺激生物、化学或物理响应。智能聚合物对小的物理或化学刺激应答，发生大的特性改变，并且可以对这些环境刺激应答，可逆地改变它们的物理或化学特性(Roy and Gupta, 2003;Kopecek，2007)。智能聚合物可以采用许多形式；它们可以溶于水溶液，吸附或移植在液体-固体界面上，或者交联以形成水凝胶[Hoffman J Controlled Release (1987) 6:297-305; HoffmanIntelligent polymers.1n:Park K，ed.Controlled drug delivery.Washington:ACSPublications， (1997)485-98;Hoffman Intelligent polymers in medicine andbiotechnology.Artif Organs (1995) 19:458-467]。通常，当剌激聚合物的临界应答时，溶液中的智能聚合物会在其相分离时表现出浊度的突然发生；表面吸附或移植的智能聚合物会塌陷，将界面由亲水转化为疏水；并且智能聚合物(以水凝胶形式交联)会表现出大幅度塌陷并释放许多其溶胀的溶液。智能聚合物可以物理地与生物分子混合或化学缀合至生物分子以获得大家族的聚合物-生物分子系统，其可以对生物以及物理和化学刺激应答。可以聚合物缀合的生物分子包括蛋白和寡肽、糖和多糖、单链和双链寡核苷酸以及DNA质粒、简单的脂质和磷脂、以及光谱的识别配体和合成药物分子。许多结构参数控制智能聚合物特异性沉淀所关注的蛋白的能力；智能聚合物应当包含配体偶联的反应基团；不与杂质强烈地相互作用；使得配体可用于与靶蛋白相互作用；并且形成紧实的沉淀。
[0101]如本文所用，短语包含“高固体”的进料表示具有约>7%固体的进料，而短语包含“低固体”的进料会有约0.1%-7%固体。
[0102]在本文中可交换使用时，术语“刺激(stimulus) ”或“刺激(stimuli) ”是指环境中的物理或化学改变，其导致本发明的刺激响应性聚合物的应答。因此，本发明提供新的聚合物，其对刺激应答，并且所述刺激导致聚合物溶解性的改变。本文所述的一种或多种聚合物应答的刺激的实例包括但不限于温度的改变、电导率的改变和/或pH的改变。在一些实施方案中，刺激包括向样品添加络合剂或络合形成盐。在各种实施方案中，一般在向样品添加聚合物之后加入刺激。然而，也可以在向样品添加聚合物期间或之前加入刺激。
[0103]如本文所用，术语“聚合物”指通过两个或更多个单体单元的共价连接形成的分子。这些单体单元可以是合成的或者在自然中出现。重复单元形成的聚合物可以是线性的或支化的。聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚烯丙基胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯和共聚物(例如聚苯乙烯-共-聚吡啶、聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯、pluronic、PF68等)。在本发明的一些实施方案中,聚合物包含聚电解质骨架。
[0104]术语“蛋白A”和“PiOt A”在本文中可交换使用，并且涵盖从其天然来源回收的蛋白A，合成制备的蛋白A (例如，通过肽合成或通过重组技术)，以及保留结合具有CH2/CH3区如Fe区的蛋白的能力的变体。蛋白A可以商购自Repligen, GE或Fermatech。蛋白A—般固定在色谱基质上。用于本发明的方法和系统的蛋白A的功能衍生物、片段或变体的特征在于对小鼠IgG2a或人IgGl的Fe区至少K=IO8M的结合常数，并且优选Κ=Ι09Μ。在本发明的上下文中，具有这样的结合常数值的相互作用柔性称为“高亲和结合”。在一些实施方案中，这样的蛋白A的功能衍生物或变体包含至少部分野生型蛋白A的功能IgG结合结构域，选自具有保留的IgG结合功能性的天然结构域E、D、A、B、C或其工程化突变体。
[0105]而且，工程化以允许单点连接至固体支持物的蛋白A衍生物或变体也可以用于要求保护的方法的亲和色谱步骤。
[0106]单点连接一般表示蛋白部分通过单一共价键连接至蛋白A亲和色谱的色谱支持材料。这样的单点连接还可以通过使用合适的反应残基来进行，将所述反应残基放置在暴露的氨基酸位置，即在环中，接近N-端或C-端或者在蛋白折叠的外周上。合适的反应基团例如疏基或氣基官能。
[0107]在一些实施方案中，变体的蛋白A衍生物通过多点连接连接至合适的色谱基质。
[0108]如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗 原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAR0SE?或PROSEPC?)-A的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
[0109]如本文所用，术语“刺激响应性聚合物”是在添加刺激后表现出物理和/或化学特性改变的聚合物。典型的刺激应答是聚合物溶解性的改变。例如，聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)在低于约35°C的温度下是水溶性的，但是在约35°C的温度下变得不溶于水。
[0110]如本文所用，术语“絮凝”指向溶液加入本文所述的絮凝剂如聚合物或化学处理(例如，酸处理)以去除一种或多种悬浮的不溶性或可溶性杂质。必须将聚合物以允许自发形成不溶性团聚物的浓度加入溶液，所述不溶性团聚物可以通过典型的固体-液体分离方法从溶液去除。
[0111]如本文所用，术语“组合物”、“溶液”或“样品”指利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化的靶分子或期望产物与一种或多种不期望的实体或杂质的混合物。在一些实施方案中，样品包含原料或细胞培养基，靶分子或期望的产物分泌至其中。在一些实施方案中，样品包含靶分子(例如，治疗性蛋白或抗体)与一种或多种杂质(例如，宿主细胞蛋白、DNA、RNA、脂质、细胞培养添加剂、细胞和细胞碎片)。在一些实施方案中，样品包含分泌至细胞培养基的所关注的靶分子。
[0112]在一些实施方案中，利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化靶分子的样品在使样品与刺激响应性聚合物接触之前是“部分纯化的”。部分纯化可以例如通过使样品进行一个或多个纯化步骤如一个或多个非亲和色谱步骤来完成。靶分子可以通过沉淀一种或多种杂质或者通过沉淀靶分子来从一种或多种不期望的实体或杂质分离。
[0113]如本文所用，术语“沉淀(precipitate) ”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation)”指 结合(例如，在与所关注的生物分子的络合物中)或未结合的聚合物或者其他可溶性物质从水性和/或可溶性状态改变为非水性和/或不溶性状态。
[0114]如本文所用，术语“所关注的生物分子”可以是期望的靶分子，例如期望的产物或所关注的多肽(例如，抗体)，或者其可以是需要从包含期望的靶分子的样品去除的不期望的实体。这类不期望的实体包括但不限于例如选自宿主细胞蛋白、DNA、RNA、蛋白聚集体、细胞培养添加剂、病毒、内毒素、全细胞和细胞碎片的一种或多种杂质。此外，所关注的生物分子还可以通过如本文所述的刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)结合并沉淀。
[0115]在本文中可交换使用的术语“靶分子”、“靶生物分子”、“期望的靶分子”和“期望的靶生物分子” 一般指所关注的多肽或产物，期望从一种或多种不期望的实体纯化或分离，例如可以存在于包含所关注的多肽或产物的样品中的一种或多种杂质。
[0116]在本文中可交换使用的术语“所关注的蛋白”、“靶多肽”、“所关注的多肽”和“靶蛋白”一般指治疗性蛋白或多肽，包括但不限于利用本发明的刺激响应性聚合物纯化的抗体。
[0117]在本文中可交换使用的术语“多肽”或“蛋白” 一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白。在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物用来从与蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种不期望的实体分离蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种实体是可以与纯化的蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种杂质。如上文所讨论的，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物在将刺激加入样品时特异性地结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，在加入刺激时，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀除所关注的蛋白或多肽以外的实体，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、全细胞、细胞碎片和细胞培养添加剂。
[0118]在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的蛋白或多肽为哺乳动物蛋白，例如治疗性蛋白或可以用于治疗的蛋白。示例性蛋白包括但不限于例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子；抗凝血因子；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和;脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如内酰胺酶；Dnase ；IgE ;细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或D蛋白；类风湿因子；神经营养因子，神经营养蛋白-3、-4、-5*-6(NT-3、NT-4、NT-5*NT-6)，或者神经生长因子如NGF-β.;血小板衍生生长因子(TOGF);成纤维细胞生长因子；表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF);胰岛素样生长因子-1和-1KIGF-1和IGF-1I)；des(l-3)-1GF-1 (脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨 形态发生蛋白(BMP);干扰素；白介素(II)，例如IL-1至IL-10 ;超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如部分AIDS包膜；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及任何上文所列的多肽的片段和/或变体。
[0119]此外，在一些实施方案中，利用本发明的智能聚合物纯化的蛋白或多肽为抗体、其功能片段或变体。在一些实施方案中，所关注的蛋白是包含免疫球蛋白的Fe区的重新蛋白。
[0120]术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β_折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH结构域”。
[0121]免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们保留，或者修饰以包含配体特异性结合结构域。术语“片段”指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的一部分或部分抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。还可以通过重组方式获得片段。当重组制备时，片段可以单独表达，或者作为称为融合蛋白的较大蛋白的部分来表达。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fe融合蛋白。[0122]一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。但是，还考虑针对非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂抗原；参见US Pat.N0.5，091，178)的抗体。当抗原为多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。
[0123]如本文所用，术语“单克隆抗体”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohleret al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，U.S.Pat.N0.4，816，567)。“单克隆抗体”还可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如 Clackson et al.，Nature352:624_628 (I99I)和 Marks et al., J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术。
[0124]单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(U.S.Pat.N0.4，816，567 ;和 Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。
[0125]“框架”或“FR”残基是那些除如本文所定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
[0126]非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。
[0127]人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见 Jones et al.，Nature321:522-525 (1986) ；Riechmann etal., Nature332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0128]在一些实施方案中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离或纯化的抗体为治疗性抗体。示例性治疗性抗体包括例如曲妥珠单抗(HERCEPTIN?, Genentech, Inc.，Carter etal (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285-4289; U.S.Pat.N0.5，725，856)；抗 CD20 抗体如嵌合的抗 CD20 “C2B8” U.S.Pat.N0.5，736，137 ;抗 IgE (Presta et al (1993) J.1mmunol.151:2623-2632;W095/19181)；抗 CD18(U.S.Pat.N0.5，622，700;W097/26912)；抗 IgE,包括 E25、E26 和 E27(U.S.Pat.N0.5, 714, 338 ;U.S.Pat.N0.5, 091, 313;W093/04173;U.S.Pat.N0.5,714, 338)；抗 Apo_2 受体抗体(W098/51793)；抗 TNF-α 抗体，包括cA2(REMICADE?)、CDP571 和 MAK-195 (U.S.Pat.N0.5，672，347 ; Lorenz et al (1996) J.1mmunol.156(4):1646-1653;Dhainaut et al (1995)Crit.Care Med.23(9):1461-1469)；抗组织因子(TF) (EP0420937B1);抗 CD4 抗体如 cM-7412 抗体(Choy et al (1996)Arthritis Rheum39 (I): 52-56)；抗 Fe 受体抗体，例如 Graziano et al (1995)J.1mmunol.155(10):4996-5002 中针对 Fe Y RI 的 M22 抗体；抗6口1113/1113 抗体 ^RSV 抗体如MED1-493 (SYNAGIS?);抗CMV抗体如PR0T0VIR?);抗HIV抗体如PR0542 ;抗肝炎抗体如抗H印B抗体0STAVIR?);抗CA125抗体OvaRex ;抗独特型⑶3表位抗体BEC2 ;抗α ν β 3抗体VITAXIN? ;抗人肾细胞癌抗体如ch-G250 ； ING-1 ;抗人17-1A抗体(3622W94);以及抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart IDlO和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
[0129]在利用本文所述的刺激响应性聚合物从包含靶分子以及一种或多种杂质的组合物或样品纯化靶分子(例如，所关注的多肽或蛋白)的上下文中，术语“分离(isolating)”、“纯化”和“分离(separating)”在本文中可交换使用。在一些实施方案中，如本文所述，通过利用刺激响应性聚合物从样品去除(完全或部分)一种或多种杂质来增加样品中的靶分子的纯度。在另一实施方案中，通过从样品中的一种或多种杂质沉淀出靶分子来增加样品中的祀分子的纯度。
[0130]在一些实施方案中，纯化方法额外地采用一个或多个“色谱步骤”。通常，如果需要，这些步骤可以在利用本发明的刺激响应性聚合物从一种或多种不期望的实体分离靶分子之后进行。
[0131]在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物分离(isolate)、分离(separate)或纯化所关注的 多肽或蛋白的“纯化步骤”可以是导致“均质”或“纯”组合物或样品的总纯化方法的部分，该术语在本文中用来指在包含所关注的蛋白的组合物中包含少于IOOppm HCP的组合物或样品，或者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于lOppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP。如本文所用，“初步澄清”包括使用絮凝剂去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(Pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒。
[0132]如本文所用，术语“澄清(clarify) ”、“澄清(clarification) ”、“澄清步骤”一般指在纯化生物分子中最初使用的一个或多个步骤。澄清步骤一般包括利用一个或多个步骤去除细胞和/或细胞碎片，所述一个或多个步骤包括任何以下单独步骤或它们的各种组合，例如澄清深层过滤、沉淀、絮凝和沉降。在一些实施方案中，本发明提供对各种纯化方案中常用的常规澄清步骤的改进。澄清步骤一般包括去除一种或多种不期望的实体，并且通常在包括捕获期望的靶分子的步骤之前进行。澄清的另一关键方面是去除样品中的可溶性和不溶性组分，所述组分后来可以导致纯化过程中无菌滤器的污染，从而使得总纯化过程更经济。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式进行，例如通过絮凝、PH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子的相改变或者这些方法的任何组合。[0133]如本文所用，术语“色谱”指任何种类的技术，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止介质的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。
[0134]术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可交换使用，并且指任何种类的相(例如，固相)，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止固相的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。各种类型的色谱介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱(monolith)。
[0135]如本文所用，术语“捕获步骤” 一般指用于用刺激响应性聚合物或色谱树脂结合靶分子的方法，其导致包含靶分子以及聚合物或树脂的沉淀物的固相。通常，随后利用洗脱步骤回收靶分子，所述洗脱步骤从固相去除靶分子，从而导致从一种或多种杂质分离靶分子。在各种实施方案中，捕获步骤可以利用色谱介质如树脂、膜或整体柱进行，或者利用聚合物如刺激响应性聚合物、聚电解质或结合靶分子的聚合物进行。 [0136]如本文所用，术语“盐”指通过酸和碱的相互作用形成的化合物。可以用于本文所述的方法中采用的各种缓冲液的各种盐包括但不限于乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、氯化物(例如氯化钠)、硫酸盐(例如硫酸钠)或钾盐。
[0137]如本文所用，术语“溶剂” 一般指能够溶解或分散一种或多种其他物质以提供溶液的液体物质。溶剂包括水性和有机溶剂，其中可用的有机溶剂包括非极性溶剂、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇和2，2-硫二甘醇。
[0138]在本文中可交换使用的术语“百万分数”或“ppm”指利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的期望的靶分子(例如，靶蛋白或抗体)的纯度的度量。因此，这个度量可以用来衡量纯化过程后存在的靶分子的量，或者衡量不期望的实体的量。在一些实施方案中，单位“ppm”在本文中用来指溶液中的杂质的量，例如，以毫克/毫升计的所关注的蛋白的以纳克/毫升计的HCP或CH0P(即，CHOP ppm= (CHOP ng/ml)/ (所关注的蛋白mg/ml)。当蛋白干燥时(例如，通过冷冻干燥)，ppm指(CHOP ng) / (所关注的蛋白mg))。
[0139]在本文中可交换使用的术语多肽的“pi”或“等电点”指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pi可以计算自连接糖的多肽的氨基酸残基或唾液酸残基的净电荷，或者可以通过等电聚焦来确定。
[0140]如本文所用，术语“结合和洗脱模式”以及“结合和洗脱方法”指分离技术，其中样品中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fe区的蛋白)结合至合适的树脂或介质(例如，亲和色谱介质或阳离子交换色谱介质)并且随后洗脱。
[0141]在本文中可交换使用的术语“流过方法”、“流过模式”和“流过操作”指分离技术，其中生物药物制剂中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fe-区的蛋白或抗体)与一种或多种杂质预期流过材料，所述材料通常结合一种或多种杂质，其中靶分子通常不结合(即，流过)。
[0142]在本文中可交换使用的术语“方法步骤”或“单元操作”指在纯化过程中使用一种或多种方法或装置以实现某种结果。在本文所述的方法和系统中可以采用的方法步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、结合和洗脱色谱、病毒灭活、流过纯化以及配制。应当理解每个方法步骤或单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该方法步骤或单元操作预期的结果。例如，在一些实施方案中，如本文所述，澄清步骤和/或流过纯化步骤可以采用一个以上的步骤或方法或装置以完成该方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，用来进行方法步骤或单元操作的一种或多种装置是一次性使用的装置，并且可以去除和/或置换而不必置换方法中的任何其他装置或甚至不必终止方法运行。
[0143]如本文所用，术语“孔径”和“标称孔径”指保留60-98%比率的大部分颗粒的孔径。
[0144]如本文所用，术语“通量”表示通过滤器过滤的体积。
[0145]如本文所用，术语“系统” 一般指整个纯化方法的物理形式，如本文所述，其包括两个或更多个方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，系统封闭在无菌环境中。
[0146]在本发明中，使用开放分级层允许较大的颗粒穿透并捕获在捕获在滤器的深层内，而不是收集在表面上(参见实施例2A和2B)。
[0147]本发明的优点是较高的通量，并且保留大的固体(0.5微米-约200微米)，同时消除滤饼形成的问题。在初步澄清滤器中使用开放孔提供这些深层滤器，其固体停留的压力线性增加，而压力没有显著增加，因此导致高通量。滤器的结构尺寸联合层的优化(孔径和厚度)给出卓越的过滤特性，其可以保留大量固体。
[0148]在本发明中，使用开放分级层允许进料流中较大的絮凝颗粒穿入滤器的深层，并且捕获在滤器的孔内，而不是收集在表面上(参见实施例9(A-E)和11 (A-J))。本文提供的初步澄清深层滤器这样排列:“开放的”顶层构成深层滤器的前置过滤区以捕获较大的絮凝颗粒，而底层构成抛光区，其捕获较小的残余的聚集的絮凝颗粒。具有这种类型的排列的初步澄清深层滤器的一个优点是较高的通量，并且保留较大的絮凝颗粒，同时还消除滤饼形成的问题。在本文所教导的初步澄清滤器中使用这类开放孔提供固体停留的压力的线性增加，而压力没有显著增加，因此导致更高、更期望的通量。
[0149]本发明的初步澄清深层滤器的实例在图1A、1B、1C、1D、1E和IF中示出。
[0150]图1C示出具有至少7层的初步澄清深层滤器，并且在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
[0151]图1A和IE示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
[0152]图1B、1D和IF示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用。
[0153]图1A所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
[0154]图1B所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约5微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0155]图1C所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约8微米厚的非织造纤维如聚丙烯的单层(底部)，约0.2cm厚。
[0156]图1D所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0157]图1E所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。[0158]图1F所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约35微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约15微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约
0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0159]本文提供的初步澄清深层滤器的结构尺寸联合初步澄清深层滤器的孔径和/或层厚度的优化导致非常有利的过滤特性，其还保留大量固体。因为深层滤器通过各种机制的组合实现滤过介质的深层，所以进料的柱体积(Vf)比介质的柱体积(Vm)示出不同滤器的有效性。
[0160]此外，各种进料具有不同量的固体，这导致深层滤器的高度可变的性能，因此(Vf)比(Vm)值给出滤器的实际“效率”的更好估计。
[0161]另一重要参数K用来描述滤器效率，同时对原料的固体含量归一化。参数K允许有效比较具有不同固体含量的进料的过滤。
[0162]如等式I所示，K参数实际上是3个可测量的参数柱通量(TP)、收集效率(η)和固体的初始浓度(Ci)的函数。
[0163]K = [TP] X [ η] X [Ci] X 100(I)
[0164]
[0165]如等式2所示，其中柱通量(TP)通过过滤的进料体积(Vf)除以介质体积(Vm)来给出，收集效率(Π)通过捕获的固体体积(Vs。)除以进料中的固体体积(Vs)来给出，而固体的初始浓度通过进料中的固体体积(Vs)除以过滤的进料体积(Vf)来给出。
【权利要求】
1.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料的方法，所述方法包括:a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料；c)使所述深层滤器介质与所述进料接触；以及d)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
2.权利要求1的方法，其还包括将化学絮凝剂加入步骤(b)的进料中，从而形成包含多种絮凝的细胞碎片和胶体颗粒的化学絮凝的进料。
3.权利要求1的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有〉约25 μ m的标称孔径评级，并且所述滤器絮凝的进料具有 > 约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
4.权利要求1的方法，其中所述澄清方法为初步澄清方法，并且所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
5.权利要求4的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
6.权利要求1的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
7.权利要求6的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布，并且平均粒径大于约10pm。
9.权利要求2的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
10.权利要求1的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
11.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
12.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
13.权利要求12的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
14.权利要求11的方法，其中所述酸为乙酸。
15.权利要求4的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
16.权利要求2的方法，其中所述深层滤器提供> 约lOOL/MVhr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200pm的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
17.权利要求1的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
18.权利要求17的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
19.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来初步澄清包含所关注的生物分子物质以及多种细胞物质的絮凝的进料的方法，所述方法包括:a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；b)提供化学絮凝剂；c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质和/或胶体颗粒的进料；d)将所述化学絮凝剂加入所述进料中；e)形成化学絮凝的进料，其包含絮凝的细胞物质和/或胶体颗粒；f)使所述深层滤器介质与所述化学絮凝的进料接触；以及g)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述絮凝的细胞物质和/或絮凝的胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤澄清步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有> 约25 μ m的标称孔径评级，并且所述絮凝的进料具有 > 约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
21.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
22.权利要求21的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
23.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
24.权利要求23的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
25.权利要求19的方法，其中所述细胞物质和胶体颗粒具有约0.5 μ m-约200 μ m的粒径分布，并且平均粒径大 于约10 μ m。
26.权利要求19的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的进料的开放标称孔径评级。
27.权利要求19的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
28.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
29.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
30.权利要求29的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
31.权利要求28的方法，其中所述酸为乙酸。
32.权利要求19的方法，其中所述深层滤器提供> 约100L/M2的通量，并且去除絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
33.权利要求19的方法，其中所述进料包括细胞培养物、转基因哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、非转基因哺乳动物细胞培养物、组织培养物、微生物发酵批次、植物提取物、生物燃料、海水培养物、淡水培养物、废水培养物、处理的污水、未处理的污水、奶培养物、血液培养物以及它们的组合。
34.权利要求19的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯。
35.权利要求19的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
36.权利要求35的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
37.一种用于初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的深层过滤装置，其包含多孔深层滤器介质，所述介质具有至少2层非织造纤维的分级层，所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度，并且所述孔具有 > 约25 μ m的标称孔径分级。
38.权利要求37的装置，其中所述介质是各向异性的。
39.权利要求37的装置，其中所述介质包含至少3层非织造纤维的分级层。
40.权利要求37的装置，其中所述介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
41.权利要求37的装置，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
42.权利要求37的装置，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5 μ m-约200 μ m的粒径分布，并且平均粒径大于约10 μ m。
43.权利要求37的装置，其中所述介质提供> 约lOOL/MVhr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200 μ m的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
44.权利要求37的装置，其中当将化学絮凝剂加入所述进料中时，滤器絮凝的进料具有〉约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
45.权利要求37的装置，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
46.一种从样品纯化靶蛋白的方法，所述方法包括:(i)提供包含靶蛋白以及一种或多种杂质的样品；(?)将沉淀剂加入所述样品中，并且利用梯度密度深层滤器去除一种或多种杂质，从而获得澄清的样品；(iii)使来自步骤(ii)的澄清的样品进行结合和洗脱色谱步骤，从而获得洗脱液；(iv)利用一个或多 个连续静态混合器或者一个或多个缓冲罐使来自步骤(iii)的洗脱液与一种或多种病毒灭活剂接触；(v)使病毒灭活步骤的输出进行流过纯化过程，其包括使用选自活性炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过滤膜的两种或更多种基质；以及(vi)以期望的浓度和缓冲条件配制来自步骤(V)的输出，其中所述方法连续进行，从而至少两个或更多个方法步骤在它们的持续时间的至少一部分期间同时进行。
【文档编号】B01D29/01GK103649297SQ201280033899
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年7月8日
【发明者】N·辛格, 程国顺 申请人:Emd密理博公司
【专利摘要】一种初步澄清进料的方法，所述方法包括化学处理的絮凝的进料，包含所关注的靶生物分子如mAb、哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物，使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤。所述初步澄清深层过滤装置包含多孔深层滤器，具有不同孔评级的分级多孔层。所述初步澄清深层过滤装置以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤液体进料，包括化学处理的絮凝的进料，其包含絮凝的细胞碎片和胶体颗粒，具有约0.5pm-200pm的粒径分布。还提供使用和制备所述初步澄清深层过滤装置的试剂盒和方法。
【专利说明】用于一次性生物技术方法的改良深层滤器
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年7月8日提交的美国临时专利申请第61/571，994号的权益，其全部内容援引加入本文。
【技术领域】
[0003]一般来说，本发明涉及进料的初步澄清。在某些具体实施方案中，本发明提供进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清深层过滤方法，其利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。在其他实施方案中，本发明提供化学处理的进料的初步澄清深层过滤方法，其中细胞团已絮凝为较大的聚集体。
【背景技术】
[0004]制备包括蛋白如单克隆抗体(mAb)在内的药物级别的生物分子是一个复杂的制备过程，包括设计用来制备用于患者的高质量产品的多种过滤、离心和色谱技术。细胞培养收获物和高固体原料的澄清可以是艰巨的任务，这是由于来自现代化生产批量生物反应器的大体积收获物25，000L)和高细胞密度通常在随后的色谱操作之前需要初步以及二次澄清。因此，细胞收获物和高固体原料如哺乳动物细胞和mAb的制备过程的收获和澄清是过去20年左右进行的许多演变和评价的产物。
[0005]现在通常期望哺乳动物细胞培养物和mAb的收获技术以高收率(>95%)和最小细胞破裂的方式操作。随 着产物分子滴度增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战。较高的细胞密度在澄清和无菌过滤期间造成困难。较高的产物浓度一般导致增加的杂质负荷且需要较大的色谱安装。因此，提高效率和通量形式的改良大受欢迎。
[0006]渐增的治疗性mAb需求使得人们致力于增加工业治疗性单克隆抗体生产的产品生产、质量、加工效率和成本效益。过去十年见证了生产、上游细胞培养产物滴度的大幅增长以及表征杂质和污染物的技术进步。
[0007]进料、进料流、原料、细胞培养液等(包括高固体进料，例如包含mAb和哺乳动物细胞培养原料的高固体进料)的初步澄清去除大量生物质，特别是全细胞和其他较大的细胞碎片，然后二次澄清，去除较小的胶体颗粒以及损害下游滤器容量的其他颗粒。在mAb和哺乳动物细胞培养液和原料的生产过程中，离心通常是初步澄清步骤。
[0008]mAb生产商投入了大量时间和精力增加原料的产品滴度。然而，虽然较高滴度增加细胞培养生产率，但是其还产生具有较大量生物质和细胞碎片含量的原料。包含这样较大量生物质和细胞碎片的进料可以在离心后产生高浊度离心液(centrate)。高浊度离心液常减少离心下游使用的二次澄清深层滤器和随后的无菌滤器的产量。减少的产量引起一系列问题，从增加的加工成本到加工过程的偏差，这是由于滤器的堵塞和长期加工延迟。最后，使用离心初步澄清在运行之间需要广泛的经过验证的清洁程序以试图减少批次和治疗性分子物质之间交叉污染的风险。
[0009]在期望于相对短的时间内加工多种产物的试验或临床规模的生物治疗性生产中，这特别有问题。离心清洁程序减慢试验工厂转换至生产不同生物分子的能力，并且大大增加生产运行之间交叉污染的风险。此外，在初步澄清步骤中，离心不可以有效地从这些原料去除所有颗粒和细胞碎片，因此在离心步骤之后，随后的色谱步骤之前需要利用深层过滤的二次澄清步骤。
[0010]或者，已证实连续过滤运行可用于从原料去除不同大小的细胞和细胞碎片，但是通常体积通量限制应用于较小体积(〈1000L)，其中滤器安装具有合理的大小。过滤的使用大大减少交叉污染的风险，并且在运行之间无需清洁和清洁验证，这是由于过滤装置的一次性性质。不幸的是，低通量要求大量的滤器单元，这可以减少过滤收率，因为每个连续步骤导致通过滤器装置和设备的滞留体积损失一部分的进料溶液。
[0011]为了进一步提高澄清性能、通量和下游过滤操作，已使用细胞培养收获物的絮凝。絮凝剂是这样的一类物质，其可以从溶液聚集和凝集细颗粒，导致它们从液相沉降且溶液浊度减少。
[0012]絮凝可以以各种方式完成，包括聚合物处理、化学处理(pH改变)或添加表面活性剂。使用絮凝剂沉淀可以用来选择性地去除杂质，同时将蛋白产物留在溶液中。但是，絮凝剂尚未广泛用于mAb、哺乳动物细胞和所关注的原料的其他生物分子细胞材料的澄清。
[0013]通过化学品絮凝细胞培养收获物需要使用酸如乙酸，或者聚合物如壳聚糖、多糖、多胺或聚丙烯 酰胺。絮凝已用作可选分离技术以增加离心澄清通量和离心液质量，从而改善下游过滤操作。虽然化学絮凝在团聚细胞碎片和细胞污染物(宿主细胞蛋白和DNA)中非常有效，但是所得的絮凝悬浮液一般不易于在过滤之前不使用离心而通过普通过滤方法分离。
[0014]絮凝剂沉淀细胞、细胞碎片和蛋白，这是因为蛋白上的电荷与聚合物(例如聚电解质)上的电荷的相互作用，产生不溶性复合物，并且随后通过剩余电荷相互作用或通过复合物上的疏水斑块桥接不溶性复合物以形成较大的簇集。为了去除这些大簇集，离心步骤或切向流微滤是澄清的主要模式，然后进行二次澄清步骤，其中深层过滤广泛用于在捕获色谱步骤之前澄清细胞培养液。因为离心不可以递送不含颗粒的离心液，下游需要进一步安装深层滤器(二次深层过滤)和无菌滤器。
[0015]切向流微滤(也称为交叉流微滤)与离心竞争从哺乳动物细胞培养物收获和澄清mAb和治疗性产物。这种技术提供的一个优点是产生不含颗粒的收获液，需要极少的额外过滤。但是，用于细胞培养收获物的切向流微滤膜常受到膜污染问题(无法挽回的膜通量下降)的困扰，并且通常每次使用之后对膜需要按照完全清洁方案的严格复杂的操作条件(对离心也是如此)。为了解决这个问题，使用优化的膜化学，用一般对显著污染较不敏感的更亲水的切向流微滤膜。
[0016]传统上，絮凝一般用来团聚不可变形的固体颗粒。例如，因为它们的小粒径而非常难以过滤的超微粘土或二氧化钛颗粒的稀悬浮液可以化学絮凝并由此容易地分离，因为这些超微颗粒的大小通过更快沉降的团聚絮状物的形成而大大增加，从而因为滤饼内的大流量通道而更快过滤。
[0017]但是，当化学絮凝用于mAb原料或其他生物分子/细胞原料时，因为这些生物分子材料的生物学特征的性质，所得的团聚是独特的，并且完全不同于土材料和金属氧化物的不可变形的固体颗粒。大多数固体不可变形的颗粒如土材料或金属氧化物具有远高于水的密度。因此，一旦这些小颗粒絮凝，它们的粒径大大增加，并且所得的絮状物通过重力迅速沉降(即，以分钟计)。相比之下，细胞、mAb和其他生物分子物质由氨基酸和水组成，并且具有与水的密度非常接近的密度。因此，絮凝的细胞和其他生物分子不容易沉淀，并且通常在沉降发生之前经历数小时。
[0018]另一问题是相对低密度的絮凝细胞团，其通常形成蓬松的团，占据显著部分的进料体积但不形成压实的滤饼。而且，因为颗粒的生物来源，絮状物易碎，并且往往在压力下容易分解。
[0019]为了这个原因，大多数常规的固体-液体分离方法虽然可用于固体颗粒系统，但是不能絮凝细胞团如mAb原料。
[0020]据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们非常有效地去除污染物并且是一次性形式，从而消除了与可重复使用的硬件设施相关的验证和污染问题，例如在使用离心时遇到的那些问题。但是，深层滤器目前不能操作高滴度mAb过程的典型的高固体进料流，因此常在离心后使用深层滤器。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。
[0021]但是，深层滤器目前不能操作高固体进料流的初步澄清，并且通常必须在离心或切向流微滤之后使用。未澄清的细胞培养上清中存在的高颗粒负荷和高浊度为通过单独的深层过滤进行初步澄清增加了挑战。目前，有限的通量导致深层滤器的大型设备用于初步澄清，导致收率损失，这是由于如上文所讨论的大滞留体积和放大问题。
[0022]此外，因为存在较高的生物质含量，mAb原料对于澄清和滤器是挑战性的进料流，并且在离心后导致高浊度的离心液。因为需要去除大量的生物质，高浊度的离心液缩短了澄清下游的深层滤器的寿命。需要改进mAb的澄清，从而导致较高的通量。
[0023]鉴于上述初步澄清过程，其依赖于使用初步澄清离心步骤或初步澄清微滤步骤，然后是依赖于深层过滤介质的二次澄清步骤以出去较大的颗粒，需要一次性的合理可靠且完成不会非常昂贵的初步澄清方法，其不使用初步澄清离心或微滤步骤然后额外的二次澄清步骤。
【发明内容】
[0024]根据上述需求以及与进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清过程相关的问题，本发明通过使用初步澄清深层过滤方法克服了挑战，所述方法利用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
[0025]本发明涵盖一种通过深层过滤初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和胶体颗粒的进料、进料流、原料、细胞培养液等但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的方法，所述方法包括:
[0026]a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
[0027]b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和颗粒的进料流，其中所述细胞碎片和颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布；
[0028]c)使所述多孔深层滤器介质与所述进料流接触，从而所述深层滤器介质能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤具有约0.5 μ m_约200pm的粒径分布的细胞碎片和颗粒；以及
[0029]d)分离所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
[0030]本发明还涵盖一种使用初步澄清深层过滤装置但不使用初步澄清过滤步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过深层过滤初步澄清其中包含所关注的靶生物分子或所关注的生物治疗剂以及絮凝的细胞碎片、物质和胶体颗粒的絮凝的进料的方法，所述方法包括:
[0031]a)提供包含多孔深层滤器介质的深层过滤装置；
[0032]b)提供化学絮凝剂；
[0033]c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料；
[0034]d)将所述化学絮凝剂与所述进料混合；
[0035]e)在所述进料中形成化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒，并且任选地化学絮凝所关注的靶生物分子；
[0036]f)使所述多孔深层滤器介质与包含化学絮凝的细胞物质、碎片和胶体颗粒的进料接触；以及
[0037]g)分离絮凝的所关注的 生物分子物质与多种絮凝的细胞物质但不使用离心澄清步骤或切向流微滤澄清步骤。
[0038]本发明涉及进料的初步澄清，其使用深层过滤装置但不使用初步澄清步骤或初步澄清切向流微滤步骤，所述深层过滤装置能够以约10升/m2/hr-约100升/m2/hr的流速过滤包含具有约0.5 μ m-200pm的粒径分布的颗粒的高固体进料直至TMP达到20psi。本文所教导的初步澄清深层滤器包括不同空隙评级的分级多孔层。
[0039]本文提供的初步澄清多孔各向异性深层滤器介质的一个优选应用是初步澄清化学处理的絮凝的高固体进料，所述高固体进料包含所关注的生物分子物质或生物治疗剂以及多种絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
[0040]在某些实施方案中，本发明提供一种在包含mAb、哺乳动物细胞培养物、植物细胞培养物、细菌培养物、昆虫细胞培养物以及所关注的其他生物分子材料和培养物的絮凝的进料的初步澄清中使用具有多孔滤器介质的深层过滤装置的方法，通过从所关注的生物分子物质有效分离絮凝的聚集的细胞团和碎片但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤，通过使用基于纤维的多孔深层滤器介质，其能够进行包含非常大颗粒的高体积原料的深层过滤而没有不期望的滤饼过滤效应。
[0041]在某些实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有多个分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(Pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒，其中使用絮凝剂。
[0042]在其他实施方案中，本发明提供一种深层过滤装置，其包括具有开放分级层的多孔深层滤器介质，用于初步澄清深层过滤，使得能够深层过滤具有0.5 μ m-200 μ m粒径的细胞碎片和胶体颗粒，从而提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应。
[0043]在某些实施方案中，本发明提供深层过滤介质:
[0044]a)具有细胞碎片的大絮状物穿透的大孔，没有不期望的滤饼过滤效应或在滤器的孔内形成絮状物桥接；
[0045]b)具有非常高的深度以分散细胞团，从而防止会导致介质中的内部滤饼过滤的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低，压力的浓度降低可以引起絮状物分解。
[0046]c)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，其匹配原料中絮状物大小的群体。对于某些具有大量细小絮状物的原料，例如从酸性絮凝代替聚合物产生的原料，深层滤器层包括复合介质，其具有毛毡材料、DE和短纤维的组合，因为需要精细去除；
[0047]d)对于平均粒径大于10 μ m的所关注的生物分子物质的初步澄清，通常絮凝剂和化学处理的进料流的初步澄清，其中深层滤器包括具有开放标称孔径评级的非织造纤维的分级层，能够过滤具有大量固体的絮凝的进料流； [0048]e)具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土(diamatoceousearth)的复合分级层，其能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料流；
[0049]f)虽然具有较大的通透性，但对聚合物絮凝剂(例如智能聚合物(SmP)、壳聚糖等)处理的进料具有良好的保持特性；
[0050]g)虽然具有较大的通透性，但是对聚合物絮凝剂(例如酸沉淀、辛酸等)处理的进料具有良好的保持特性；
[0051]h)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用；以及
[0052]i)在使用包含非织造纤维的分级层的深层滤器初步澄清包含絮凝的细胞和细胞碎片的培养物的过程中使用。
[0053]在某些实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有〈约25pm的标称孔径，包含非织造纤维的分级层。
[0054]在其他实施方案中，本发明提供深层滤器的深层过滤介质前置滤器，其具有〈25约Pm的标称孔径，包含至少三层非织造纤维的分级层。
[0055]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有 > 约25pm的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的絮凝的进料流。
[0056]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有〉约25 μ m的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的聚合物絮凝的进料流。
[0057]在其他实施方案中，本发明提供包括深层滤器的深层过滤介质，其包括至少两层分级非织造纤维，具有〉约25 μ m的标称孔径，能够过滤具有 > 约3%固体的聚合物絮凝的进料流，从而导致〈20NTU的浊度输出。
[0058]为了克服目前与深层滤器相关的挑战，本发明涉及初步澄清深层滤器介质的开发以及使用初步澄清深层滤器介质的方法，所述初步澄清深层滤器介质可以以约10升/m2/hr (10LMH)-100升/m2/hr (100LMH)的流速过滤具有约0.5微米-200微米的粒径分布的包含高固体的液流直至TMP达到20psi。初步澄清深层滤器包括具有各种孔隙评级的分级层，应用于聚合物和化学处理的絮凝的进料的初步澄清。
[0059]本发明涉及用于一次性初步澄清方法的深层滤器。将开放分级层用于深层过滤使得能够过滤包含大簇集的进料，具有消除离心的潜力，并且使得能够过滤具有约0.5微米-约200微米的粒径的较高固体，从而提高这些未澄清的进料流的通量。
[0060]本发明的额外的特征和优势会在下文的详细描述和权利要求书中示出。本领域技术人员会清楚，可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。应当理解上文的一般描述和下文的详细描述、权利要求书以及附图仅为示例性和解释性的，并且旨在提供本发明教导的各种实施方案的解释。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并不意味着以任何方式限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0061]并入并构成本说明书的一部分的【专利附图】
【附图说明】目前考虑的本发明的实施方案，并且与说明一起用来解释本发明的原理。
[0062]图1A、1B、1C、1D、1E和IF示出本发明的初步澄清深层滤器的实例的不同原理的实施方案，其中图1A(8层)、图1C(7层)和图1E(8层)示出用于聚合物絮凝剂(智能聚合物)处理的进料的初步澄清深层滤器，而图1B、1D和IF示出用于化学处理的进料(酸处理)的具有至少8层的初步澄清深层滤器；以及
[0063]图2是如本文所述的示例性初步澄清深层滤器纯化方法的示意图。所示的纯化方法使用生物反应器用于细胞培养，然后进行以下方法步骤:初步澄清深层过滤；蛋白A结合和洗脱色谱(捕获)；病毒灭活；流过(flow-through)纯化；以及配制。如图所示，每个方法步骤采用一种或多种装置，用来达到方法步骤的预期结果。如图所示，澄清采用如本文所教导和图1A-1F所示的分级澄清深层过滤；利用连续多柱色谱(CMC)进行蛋白A结合和洗脱色谱；病毒灭活采用两个连续(in-line)静态混合器；流过纯化采用活性炭(AC)，然后阴离子交换(AEX)色谱，然后利用连续静态混合器和缓冲罐进行pH改变，然后流过阳离子交换(CEX)色谱和病毒过滤；而配制采用渗滤/浓缩切向流过滤装置，然后无菌过滤。在整个过程中还采用一个或多个无菌滤器。 【具体实施方式】
[0064]无论上文或下文引用的所有出版物、专利和专利申请整体援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物、专利或专利申请援引加入本文相同。
[0065]为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，无论是否明确指出，说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、物质的百分比或比例、反应条件的所有数目以及其他数值应理解为在所有情况下受到术语“约”修饰。术语“约” 一般指认为等同于所列举的值(即，具有相同功能或结果)的一定范围的数目。在许多情况下，术语“约”可以包括最近的有效数字左右的数目。
[0066]因此，除非有相反的指示，以下说明书和所附权利要求书中所示的数值参数为近似值，其可以根据本发明追求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图限制权利要求书的范围的等同物的原则的应用，每个数值参数应当至少根据报道的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解。
[0067]尽管示出本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是具体实例中所示的数值尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地包含在它们各自的试验测量中发现的标准差所致的必需的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包括的所有亚范围。例如，“1-10”的范围包括最小值I和最大值10之间的任何和所有亚范围(并且包括最小值I和最大值10)，即具有等于或大于I的最小值以及等于或小于10的最大值的任何和所有亚范围，例如5.5-10。
[0068]在进一步详细描述本发明之前，会定义许多术语。使用这些术语并不限制本发明的范围，而仅用来方便本发明的描述。
[0069]除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所涉及的领域的技术人员通常理解的相同的含义。为了如本文所述的发明的目的定义以下术语。
[0070]如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。
[0071]如本文所用，术语“生物反应器”指支持生物活性环境的任何制造或涉及的装置或系统。在某些情况下，生物反应器是其中进行生物培养过程的容器，其包含生物体或来源于这类生物体的生物化学活性物质。这样的过程可以是需氧的或厌氧的。常用的生物反应器通常是圆柱形的，大小从升到立方米，并且常由不锈钢制成。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器由除钢以外的材料制成，并且是一次性或单次使用的。考虑生物反应器的总体积可以是从IOOmL到高达10，000升或更多的任何体积，这取决于具体过程。在本文所述的方法和系统的一些实施方案中，将生物反应器连接至单元操作如深层滤器。在本文所述的一些实施方案中，生物反应器用`于细胞培养以及沉淀，其中可以将沉淀剂直接加入生物反应器，从而沉淀一种或多种杂质。
[0072]术语“细胞培养物”指悬浮液、滚瓶、烧瓶等中生长的细胞，以及悬浮液本身的组分，包括但不限于细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、HCP、宿主细胞蛋白(HCP)和DNA、mAb、絮凝剂。术语“细胞培养物”还涵盖大规模方法，例如生物反应器，包括在搅拌的发酵罐中粘附至微载体生长的粘附细胞。此外，在要求保护的发明的方法中可以不仅培养接触依赖性细胞，还使用悬浮培养技术。示例性微载体包括例如葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及如Butler, Spier&Griff iths, Animal cellBiotechnology3:283-303 (1988)所述的其他微载体。还可以使用多孔载体如Cytoline.RTM.或Cytopore.RTM.,以及基于葡聚糖的载体如DEAE-葡聚糖(Cytodexl.RTM.)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex2.RTM.)或基于明胶的载体如明胶包被的葡聚糖(Cytodex3.RTM.)。本发明涵盖蛋白的大规模和小规模制备的细胞培养方法。可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌釜式生物反应器系统的方法，有或无微载体，并且可选地以分批、补料分批或灌注模式操作。
[0073]术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长动物细胞如哺乳动物细胞的营养液。这样的营养液一般包括细胞粘附、生长和维持细胞环境所必需的各种因子。例如，典型的营养液可以包括基础培养基制剂、取决于细胞类型的各种补充物以及任选存在的抗生素。在一些实施方案中，营养液可以包括来自一种或多种以下物质的至少一种组分:1)能源，通常为碳水化合物如葡萄糖形式；2)所有必需氨基酸，并且通常是20种氨基酸的基本集合加上胱氨酸；3)在低浓度时需要的维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；以及5)微量元素，其中微量元素定义为通常在非常低的浓度(通常在微摩尔范围中)时需要的无机化合物或天然存在的元素。营养液可以任选地补充了来自任何以下物质的一种或多种组分:I)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如钙、镁和磷酸盐；3)核苷和碱基，例如腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及4)蛋白和组织水解物。一般来说，可以使用任何合适的细胞培养基。培养基可以包含血清,例如胎牛血清、小牛血清等。可选地，培养基可以是不含血清的，非动物的，或者不含蛋白的。
[0074]如本文所用，术语“细胞培养添加剂”指某种分子(例如，非蛋白添加剂)，将其加入细胞培养过程以促进或改善细胞培养或发酵过程。在本发明的一些实施方案中，如本文所述，刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种细胞培养添加物。示例性细胞培养添加剂包括消泡剂、抗生素、染料和营养物。
[0075]在本文中可交换使用的术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”指来源于中国仓鼠卵巢(“CH0”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP —般作为杂质存在于细胞培养基或裂解物中(例如，收获的包含所关注的蛋白或多肽(例如，CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养液)。一般来说，包含所关注的蛋白的混合物中存在的CHOP的量提供所关注的蛋白的纯度的度量。通常，蛋白混合物中CHOP的量以相对于混合物中所关注的蛋白的量的百万分比表示。应当理解当宿主细胞为另一哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞时，HCP指在宿主细胞的裂解物中找到的除靶蛋白之外的蛋白。
[0076]在本文中可交换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”指任何外源或不期望物质，包括生物大分子如DNA、RNA、一种或多种宿主蛋白(HCP或CHOP)、内毒素、病毒、脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于包含所关注的蛋白或多肽(例如，抗体)的样品中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离自一种或多种外源或不期望分子，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物从包含所关注的蛋白或以及一种或多种杂质的样品结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀一种或多种杂质，从而分离所关注的多肽或蛋白与一种或多种杂质。
[0077]如本文所用， 术语“缓冲罐”指在方法步骤之间或方法步骤内(例如，当单一方法步骤包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或器皿或袋；其中来自一个步骤的产出流过缓冲罐至下一步。因此，缓冲罐不同于混合物罐(pool tank)，其并不意图盛放或收集来自步骤的整个体积的产出；而是取而代之使得来自一个步骤的产出能够连续流至下一步。在一些实施方案中，在本文所述的方法或系统的两个方法步骤之间或方法步骤内使用的缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的25%。在另一实施方案中，缓冲罐的体积不超过来自方法步骤的产出的整个体积的10%。在一些其他实施方案中，缓冲罐的体积少于生物反应器中细胞培养物的整个体积的35%、或者少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%，所述生物反应器中的细胞培养物构成纯化靶分子的起始原料。
[0078]术语“静态混合器”指用于混合两种流体物质，通常为液体的装置。该装置一般由圆柱形(管)外壳中所含的混合器元件组成。总系统设计并入将两个液流递送入静态混合器的方法。当流过混合器时，非移动元件连续混合物质。完全混合取决于多个变量，包括液体的特性、管的内径、混合器元件的数量和它们的设计等。
[0079]如本文所用，术语“深层滤器”(例如，梯度-密度深层滤器)在滤器材料的深度内完成过滤。这类滤器的一种常见类型是包含连接(或者固定)的随机基质以形成流动通道的复杂的曲折迷宫的滤器。这些滤器中的颗粒分离一般由纤维基质截留或吸附指纤维基质所致。细胞培养液和其他原料的生物加工最常用的深层滤器由纤维素纤维、助滤剂如DE和带正电荷的树脂粘合剂组成。不像绝对滤器，深层滤器介质在整个多孔介质截留颗粒，允许截留大于或小于孔径的颗粒。据认为颗粒截留包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可以包括孔阻塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层滤器是有利的，因为它们去除污染物，并且还是一次性形式，从而消除了验证问题。
[0080]如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAR0SE?或PR()SEPS,:-A的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
[0081 ] 如本文所用，术语“离子交换”和“离子交换色谱”指这样的色谱过程，其中混合物中所关注的溶质或分析物(例如，纯化的靶分子)与连接(例如通过共价连接)至固相离子交换材料的带电荷的化合物相互作用，从而所关注的溶质或分析物非特异性地与带电荷的化合物相互作用，比与混合物中的溶质杂质或污染物相互作用多或少。混合物中的污染溶质比所关注的溶质更快或更慢从离子交换材料的柱洗脱，或者相对于所关注的溶质结合至树脂或从树脂排除。
[0082]“离子交换色谱”具体包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式离子交换色谱。例如，阳离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fe区的靶蛋白)，然后洗脱(例如，利用阳离子交换结合和洗脱色谱或"CIEX")，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱(阳离子交换流过色谱FT-CIEX)。阴离子交换色谱可以结合靶分子(例如，包含Fe区的靶蛋白)，然后洗脱，或者可以主要结合杂质，而靶分子“流过”柱，也称为负色谱。在一些实施方案中，并且如本文所示的实施例所证实的，以流过模式进行阴离子交换色谱步骤。[0083]术语“离子交换基质”指带负电荷(即，阳离子交换介质)或带正电荷(即，阴离子交换介质)的基质。电荷可以通过将一种或多种带电荷的配体例如通过共价键连接至基质来提供。可选地或额外地，电荷可以是基质的固有特性(例如，在二氧化硅的情况下，其具有总体负电荷)。
[0084]在本文中术语“阴离子交换基质”指带正电荷的基质，例如具有连接至它的一种或多种带正电荷的配体，如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAEsephadexts^pfast q sepharose?(ge Healthcare)。可以用于本文所述的方法和系统的其
他示例性材料是 Fractogel? EMD TMAE、Fractogel? EMD TMAE highcap、Eshmuno? Q和 Fractogel? EMD DEAE (EMD Millipore) ο
[0085]术语“阳离子交换基质”指带负电荷的基质，并且其具有游离的阳离子用于与基质的固相接触的水溶液中的阳离子交换。带负电荷的配体连接至固相以形成阳离子交换基质，或者树脂可以是例如羧酸盐或磺酸盐。可商购的阳离子交换基质包括羧基-甲基-纤维素、固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如，SP-SEPHAR0SE FAST FLOW?或SP-SEPHAR0SEHIGH PERFORMANCE?，来自GE Healthcare)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如来自GEHealthcare 的 S-SEPHAR0SE FAST FLOW?)。优选 Fractogel? EMD SO3、Fractogel? EMD
SE Highcap、Eshimmo? S 和Fractogel? EMD COO (EMD Millipore) O
[0086]如本文所用，术语“杂质”或“污染物”指任何外源或有害分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一种或多种宿主细胞蛋白，内毒素，脂质以及一种或多种添加剂，其可以存在于利用本发明的方法分离自一种或多种外源或有害分子的包含靶分子的样品中。此外，这类杂质可以包括用于在本发明的方法之前进行的步骤的任何试剂。杂质的性质可以是可溶性的或不溶性的。
[0087]如本文所用，术语“不溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体为悬浮颗粒或固体。示例性不溶性杂质包括全细胞、细胞片段和细胞碎片。
[0088]如本文所用，术语“可溶性杂质”指包含靶分子的样品中存在的任何不期望的或有害的实体，其中所述实体不是不溶性杂质。示例性可溶性杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、RNA、病毒、内毒素、细胞培养基组分、脂质等。
[0089]如本文所用，术语“连续方法”指纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，从而来自一个方法步骤的产出直接流入方法中的下一方法步骤，没有中断，并且其中两个或更多个方法步骤可以在它们的持续时间的至少一部分同时进行。换句话说，在连续方法的情况下，如本文所述，不必在下一方法步骤开始之前完成方法步骤，但是一部分样品通常移动通过方法步骤。术语“连续方法”还用于方法步骤内的步骤，在这种情况下，在包括多个步骤的方法步骤进行期间，样品连续流过进行方法步骤所需的多个步骤。本文所述的这样的方法步骤的一个实例是流过纯化步骤，其包括以连续方式进行的多个步骤，例如流过活性炭，然后流过AEX介质、然后流过CEX介质，然后流过病毒过滤。
[0090]在一些实施方案中，如本文所述，深层滤器用于澄清，之后澄清的细胞培养物可以连续流指纯化过程中 的下一步，例如结合和洗脱色谱步骤(例如，蛋白A亲和色谱)。
[0091]如本文所用，术语“半连续方法”指用于纯化靶分子的一般连续方法，其中任何单一方法步骤中流体材料的输入或输出是不连续的或间歇的。例如，在本发明的一些实施方案中，方法步骤(例如，结合和洗脱色谱步骤)中的输入可以连续装载；但是输出可以间歇地收集，其中纯化过程中的其他方法步骤是连续的。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法和系统的性质是“半连续的”，其中它们包括至少一个以间歇方式操作的单元操作，而方法或系统中的其他单元操作可以以连续方式操作。
[0092]术语“连接的方法”指用于纯化靶分子的方法，其中所述方法包括两个或更多个方法步骤(或单元操作)，互相直接流体连通，从而流体材料在过程中连续流过方法步骤，并且在方法的普通操作期间同时与两个或更多个方法步骤接触。应当理解有时，方法中的至少一个方法步骤可以通过屏障如处于关闭位置的阀暂时从其他方法步骤分离。这种单独方法步骤的暂时分离可以是必需的，例如在加工启动或关闭期间或者在去除/置换单独单元操作期间。术语“连接的方法”还用于方法步骤内的步骤，例如，当方法步骤需要进行几个步骤以达到方法步骤的预期结果时。一个这样的实例是如本文所述的流过纯化方法步骤，其可以包括以流过模式进行的几个步骤，例如活性炭；阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和病毒过滤。
[0093]如本文所用，术语“流体连通”指两个方法步骤之间流体材料的流动或者方法步骤的步骤之间流体材料的流动，其中方法步骤通过任何合适的方式(例如，连接线或缓冲罐)连接，从而使得流体能够从一个方法步骤流至另一方法步骤。在一些实施方案中，两个单元操作之间的连接线可以被一个或多个阀中断以控制流体流过连接线。[0094]如本文所用，术语“纯化(purifying)化(purification) ”、“分开(separate)，，、“分开(separating)，，、“分开(separation) ”、“分离(isolate)，，、“分离(isolating) ”或“分离(isolation) ”指增加来自包含祀分子以及一种或多种杂质的样品的靶分子的纯度。通常，通过从样品去除(完全或部分)至少一种杂质来增加靶分子的纯度。
[0095]如本文所用，术语“沉淀(precipitate) ”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation) ”指用于澄清的方法,其中改变不期望的杂质的特性,从而它们可以更容易地从可溶性靶分子分离。这通常通过形成包含不期望的杂质的大团聚颗粒和/或不溶性复合物来完成。这些颗粒具有这样的特性(例如密度或大小)，从而它们可以更容易地例如通过过滤或离心从包含可溶性靶分子的液相分离。在某些情况下，引起相分离，从而可以更容易地从可溶性靶分子分离不期望的杂质。通过相改变沉淀可以通过添加沉淀剂如聚合物或小分子来进行。在具体实施方案中，沉淀剂为刺激响应性聚合物，也称为只能聚合物。在本文所述的一些实施方案中，沉淀剂或`沉淀试剂为絮凝剂。如本文所用，絮凝是一种进行沉淀的方式，其中性能通常取决于所用的絮凝剂浓度(“剂量依赖性”)。典型的絮凝剂是与带相反电荷的杂质络合的聚电解质，例如聚阳离子。
[0096]在本文所述的一些实施方案中，澄清采用将沉淀剂加入包含靶分子以及一种或多种杂质的样品，然后深层过滤。在某些情况下，溶液条件(例如温度、pH、盐度)的改变可以用来开始沉淀，例如在刺激响应性聚合物的情况下。去除包含一种或多种杂质以及沉淀剂的沉淀的物质，从而回收液相中的靶分子，然后通常使液体进行进一步的方法步骤以进一步纯化靶分子。
[0097]沉淀可以在包含表达待纯化的靶分子的细胞培养物的生物反应器中直接进行，其中将沉淀剂直接加入生物反应器。或者，可以在单独的容器中将沉淀剂加入细胞培养物，所述细胞培养物通常包含靶分子。
[0098]本领域技术人员已知许多方法去除沉淀的物质，例如过滤或沉降或它们的任何组
入
口 ο
[0099]如本文所用，术语“沉降”指沉淀过程，其中沉淀的物质在重力的影响下迁移至容器的底部。沉降之后可以倒出或过滤液相或上清。
[0100]如本文所用，术语“智能聚合物”(SmP)，(也称为刺激响应性聚合物或聪明聚合物(intelligent polymer)或亲和大配体(AML))表示一组聚合物,其对外部刺激如环境条件如pH、温度、光、离子强度、辐射、电压、外部压力、溶剂组成的改变或其他刺激生物、化学或物理响应。智能聚合物对小的物理或化学刺激应答，发生大的特性改变，并且可以对这些环境刺激应答，可逆地改变它们的物理或化学特性(Roy and Gupta, 2003;Kopecek，2007)。智能聚合物可以采用许多形式；它们可以溶于水溶液，吸附或移植在液体-固体界面上，或者交联以形成水凝胶[Hoffman J Controlled Release (1987) 6:297-305; HoffmanIntelligent polymers.1n:Park K，ed.Controlled drug delivery.Washington:ACSPublications， (1997)485-98;Hoffman Intelligent polymers in medicine andbiotechnology.Artif Organs (1995) 19:458-467]。通常，当剌激聚合物的临界应答时，溶液中的智能聚合物会在其相分离时表现出浊度的突然发生；表面吸附或移植的智能聚合物会塌陷，将界面由亲水转化为疏水；并且智能聚合物(以水凝胶形式交联)会表现出大幅度塌陷并释放许多其溶胀的溶液。智能聚合物可以物理地与生物分子混合或化学缀合至生物分子以获得大家族的聚合物-生物分子系统，其可以对生物以及物理和化学刺激应答。可以聚合物缀合的生物分子包括蛋白和寡肽、糖和多糖、单链和双链寡核苷酸以及DNA质粒、简单的脂质和磷脂、以及光谱的识别配体和合成药物分子。许多结构参数控制智能聚合物特异性沉淀所关注的蛋白的能力；智能聚合物应当包含配体偶联的反应基团；不与杂质强烈地相互作用；使得配体可用于与靶蛋白相互作用；并且形成紧实的沉淀。
[0101]如本文所用，短语包含“高固体”的进料表示具有约>7%固体的进料，而短语包含“低固体”的进料会有约0.1%-7%固体。
[0102]在本文中可交换使用时，术语“刺激(stimulus) ”或“刺激(stimuli) ”是指环境中的物理或化学改变，其导致本发明的刺激响应性聚合物的应答。因此，本发明提供新的聚合物，其对刺激应答，并且所述刺激导致聚合物溶解性的改变。本文所述的一种或多种聚合物应答的刺激的实例包括但不限于温度的改变、电导率的改变和/或pH的改变。在一些实施方案中，刺激包括向样品添加络合剂或络合形成盐。在各种实施方案中，一般在向样品添加聚合物之后加入刺激。然而，也可以在向样品添加聚合物期间或之前加入刺激。
[0103]如本文所用，术语“聚合物”指通过两个或更多个单体单元的共价连接形成的分子。这些单体单元可以是合成的或者在自然中出现。重复单元形成的聚合物可以是线性的或支化的。聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚烯丙基胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯和共聚物(例如聚苯乙烯-共-聚吡啶、聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯、pluronic、PF68等)。在本发明的一些实施方案中,聚合物包含聚电解质骨架。
[0104]术语“蛋白A”和“PiOt A”在本文中可交换使用，并且涵盖从其天然来源回收的蛋白A，合成制备的蛋白A (例如，通过肽合成或通过重组技术)，以及保留结合具有CH2/CH3区如Fe区的蛋白的能力的变体。蛋白A可以商购自Repligen, GE或Fermatech。蛋白A—般固定在色谱基质上。用于本发明的方法和系统的蛋白A的功能衍生物、片段或变体的特征在于对小鼠IgG2a或人IgGl的Fe区至少K=IO8M的结合常数，并且优选Κ=Ι09Μ。在本发明的上下文中，具有这样的结合常数值的相互作用柔性称为“高亲和结合”。在一些实施方案中，这样的蛋白A的功能衍生物或变体包含至少部分野生型蛋白A的功能IgG结合结构域，选自具有保留的IgG结合功能性的天然结构域E、D、A、B、C或其工程化突变体。
[0105]而且，工程化以允许单点连接至固体支持物的蛋白A衍生物或变体也可以用于要求保护的方法的亲和色谱步骤。
[0106]单点连接一般表示蛋白部分通过单一共价键连接至蛋白A亲和色谱的色谱支持材料。这样的单点连接还可以通过使用合适的反应残基来进行，将所述反应残基放置在暴露的氨基酸位置，即在环中，接近N-端或C-端或者在蛋白折叠的外周上。合适的反应基团例如疏基或氣基官能。
[0107]在一些实施方案中，变体的蛋白A衍生物通过多点连接连接至合适的色谱基质。
[0108]如本文所用，术语“亲和色谱基质”指携带适合亲和色谱的配体的色谱基质。通常配体(例如，蛋白A或者其功能变体或片段)共价连接至色谱基质材料，并且在溶液与色谱基质接触时对于靶分子是易于接近的。亲和色谱基质的一个实例是蛋白A基质。亲和色谱基质通常基于锁/钥匙机制如抗 原/抗体或酶/受体结合以高特异性结合靶分子。亲和基质的实例是携带蛋白A配体如蛋白ASEPHAR0SE?或PROSEPC?)-A的基质。在本文所述的方法和系统中，亲和色谱步骤在整个纯化过程中可以用作结合和洗脱色谱步骤。
[0109]如本文所用，术语“刺激响应性聚合物”是在添加刺激后表现出物理和/或化学特性改变的聚合物。典型的刺激应答是聚合物溶解性的改变。例如，聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)在低于约35°C的温度下是水溶性的，但是在约35°C的温度下变得不溶于水。
[0110]如本文所用，术语“絮凝”指向溶液加入本文所述的絮凝剂如聚合物或化学处理(例如，酸处理)以去除一种或多种悬浮的不溶性或可溶性杂质。必须将聚合物以允许自发形成不溶性团聚物的浓度加入溶液，所述不溶性团聚物可以通过典型的固体-液体分离方法从溶液去除。
[0111]如本文所用，术语“组合物”、“溶液”或“样品”指利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化的靶分子或期望产物与一种或多种不期望的实体或杂质的混合物。在一些实施方案中，样品包含原料或细胞培养基，靶分子或期望的产物分泌至其中。在一些实施方案中，样品包含靶分子(例如，治疗性蛋白或抗体)与一种或多种杂质(例如，宿主细胞蛋白、DNA、RNA、脂质、细胞培养添加剂、细胞和细胞碎片)。在一些实施方案中，样品包含分泌至细胞培养基的所关注的靶分子。
[0112]在一些实施方案中，利用本文所述的一种或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化靶分子的样品在使样品与刺激响应性聚合物接触之前是“部分纯化的”。部分纯化可以例如通过使样品进行一个或多个纯化步骤如一个或多个非亲和色谱步骤来完成。靶分子可以通过沉淀一种或多种杂质或者通过沉淀靶分子来从一种或多种不期望的实体或杂质分离。
[0113]如本文所用，术语“沉淀(precipitate) ”、“沉淀(precipitating)”或“沉淀(precipitation)”指 结合(例如，在与所关注的生物分子的络合物中)或未结合的聚合物或者其他可溶性物质从水性和/或可溶性状态改变为非水性和/或不溶性状态。
[0114]如本文所用，术语“所关注的生物分子”可以是期望的靶分子，例如期望的产物或所关注的多肽(例如，抗体)，或者其可以是需要从包含期望的靶分子的样品去除的不期望的实体。这类不期望的实体包括但不限于例如选自宿主细胞蛋白、DNA、RNA、蛋白聚集体、细胞培养添加剂、病毒、内毒素、全细胞和细胞碎片的一种或多种杂质。此外，所关注的生物分子还可以通过如本文所述的刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)结合并沉淀。
[0115]在本文中可交换使用的术语“靶分子”、“靶生物分子”、“期望的靶分子”和“期望的靶生物分子” 一般指所关注的多肽或产物，期望从一种或多种不期望的实体纯化或分离，例如可以存在于包含所关注的多肽或产物的样品中的一种或多种杂质。
[0116]在本文中可交换使用的术语“所关注的蛋白”、“靶多肽”、“所关注的多肽”和“靶蛋白”一般指治疗性蛋白或多肽，包括但不限于利用本发明的刺激响应性聚合物纯化的抗体。
[0117]在本文中可交换使用的术语“多肽”或“蛋白” 一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白。在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物用来从与蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种不期望的实体分离蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种实体是可以与纯化的蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种杂质。如上文所讨论的，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物在将刺激加入样品时特异性地结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，在加入刺激时，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀除所关注的蛋白或多肽以外的实体，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、全细胞、细胞碎片和细胞培养添加剂。
[0118]在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的蛋白或多肽为哺乳动物蛋白，例如治疗性蛋白或可以用于治疗的蛋白。示例性蛋白包括但不限于例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子；抗凝血因子；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和;脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如内酰胺酶；Dnase ；IgE ;细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或D蛋白；类风湿因子；神经营养因子，神经营养蛋白-3、-4、-5*-6(NT-3、NT-4、NT-5*NT-6)，或者神经生长因子如NGF-β.;血小板衍生生长因子(TOGF);成纤维细胞生长因子；表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF);胰岛素样生长因子-1和-1KIGF-1和IGF-1I)；des(l-3)-1GF-1 (脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) ;CD蛋白；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨 形态发生蛋白(BMP);干扰素；白介素(II)，例如IL-1至IL-10 ;超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如部分AIDS包膜；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及任何上文所列的多肽的片段和/或变体。
[0119]此外，在一些实施方案中，利用本发明的智能聚合物纯化的蛋白或多肽为抗体、其功能片段或变体。在一些实施方案中，所关注的蛋白是包含免疫球蛋白的Fe区的重新蛋白。
[0120]术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β_折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH结构域”。
[0121]免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们保留，或者修饰以包含配体特异性结合结构域。术语“片段”指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的一部分或部分抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。还可以通过重组方式获得片段。当重组制备时，片段可以单独表达，或者作为称为融合蛋白的较大蛋白的部分来表达。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fe融合蛋白。[0122]一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。但是，还考虑针对非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂抗原；参见US Pat.N0.5，091，178)的抗体。当抗原为多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。
[0123]如本文所用，术语“单克隆抗体”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohleret al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，U.S.Pat.N0.4，816，567)。“单克隆抗体”还可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如 Clackson et al.，Nature352:624_628 (I99I)和 Marks et al., J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术。
[0124]单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(U.S.Pat.N0.4，816，567 ;和 Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。
[0125]“框架”或“FR”残基是那些除如本文所定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
[0126]非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。
[0127]人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见 Jones et al.，Nature321:522-525 (1986) ；Riechmann etal., Nature332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0128]在一些实施方案中，利用本发明的刺激响应性聚合物分离或纯化的抗体为治疗性抗体。示例性治疗性抗体包括例如曲妥珠单抗(HERCEPTIN?, Genentech, Inc.，Carter etal (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285-4289; U.S.Pat.N0.5，725，856)；抗 CD20 抗体如嵌合的抗 CD20 “C2B8” U.S.Pat.N0.5，736，137 ;抗 IgE (Presta et al (1993) J.1mmunol.151:2623-2632;W095/19181)；抗 CD18(U.S.Pat.N0.5，622，700;W097/26912)；抗 IgE,包括 E25、E26 和 E27(U.S.Pat.N0.5, 714, 338 ;U.S.Pat.N0.5, 091, 313;W093/04173;U.S.Pat.N0.5,714, 338)；抗 Apo_2 受体抗体(W098/51793)；抗 TNF-α 抗体，包括cA2(REMICADE?)、CDP571 和 MAK-195 (U.S.Pat.N0.5，672，347 ; Lorenz et al (1996) J.1mmunol.156(4):1646-1653;Dhainaut et al (1995)Crit.Care Med.23(9):1461-1469)；抗组织因子(TF) (EP0420937B1);抗 CD4 抗体如 cM-7412 抗体(Choy et al (1996)Arthritis Rheum39 (I): 52-56)；抗 Fe 受体抗体，例如 Graziano et al (1995)J.1mmunol.155(10):4996-5002 中针对 Fe Y RI 的 M22 抗体；抗6口1113/1113 抗体 ^RSV 抗体如MED1-493 (SYNAGIS?);抗CMV抗体如PR0T0VIR?);抗HIV抗体如PR0542 ;抗肝炎抗体如抗H印B抗体0STAVIR?);抗CA125抗体OvaRex ;抗独特型⑶3表位抗体BEC2 ;抗α ν β 3抗体VITAXIN? ;抗人肾细胞癌抗体如ch-G250 ； ING-1 ;抗人17-1A抗体(3622W94);以及抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart IDlO和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
[0129]在利用本文所述的刺激响应性聚合物从包含靶分子以及一种或多种杂质的组合物或样品纯化靶分子(例如，所关注的多肽或蛋白)的上下文中，术语“分离(isolating)”、“纯化”和“分离(separating)”在本文中可交换使用。在一些实施方案中，如本文所述，通过利用刺激响应性聚合物从样品去除(完全或部分)一种或多种杂质来增加样品中的靶分子的纯度。在另一实施方案中，通过从样品中的一种或多种杂质沉淀出靶分子来增加样品中的祀分子的纯度。
[0130]在一些实施方案中，纯化方法额外地采用一个或多个“色谱步骤”。通常，如果需要，这些步骤可以在利用本发明的刺激响应性聚合物从一种或多种不期望的实体分离靶分子之后进行。
[0131]在一些实施方案中，利用本文所述的刺激响应性聚合物分离(isolate)、分离(separate)或纯化所关注的 多肽或蛋白的“纯化步骤”可以是导致“均质”或“纯”组合物或样品的总纯化方法的部分，该术语在本文中用来指在包含所关注的蛋白的组合物中包含少于IOOppm HCP的组合物或样品，或者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于lOppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP。如本文所用，“初步澄清”包括使用絮凝剂去除聚集的细胞生物质，包括大小大于约10微米(Pm)的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒或者较小的颗粒。
[0132]如本文所用，术语“澄清(clarify) ”、“澄清(clarification) ”、“澄清步骤”一般指在纯化生物分子中最初使用的一个或多个步骤。澄清步骤一般包括利用一个或多个步骤去除细胞和/或细胞碎片，所述一个或多个步骤包括任何以下单独步骤或它们的各种组合，例如澄清深层过滤、沉淀、絮凝和沉降。在一些实施方案中，本发明提供对各种纯化方案中常用的常规澄清步骤的改进。澄清步骤一般包括去除一种或多种不期望的实体，并且通常在包括捕获期望的靶分子的步骤之前进行。澄清的另一关键方面是去除样品中的可溶性和不溶性组分，所述组分后来可以导致纯化过程中无菌滤器的污染，从而使得总纯化过程更经济。此外，可以使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种方式进行，例如通过絮凝、PH调节(酸沉淀)、温度变化、由于刺激响应性聚合物或小分子的相改变或者这些方法的任何组合。[0133]如本文所用，术语“色谱”指任何种类的技术，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止介质的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。
[0134]术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可交换使用，并且指任何种类的相(例如，固相)，其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如，靶分子)。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止固相的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。各种类型的色谱介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱(monolith)。
[0135]如本文所用，术语“捕获步骤” 一般指用于用刺激响应性聚合物或色谱树脂结合靶分子的方法，其导致包含靶分子以及聚合物或树脂的沉淀物的固相。通常，随后利用洗脱步骤回收靶分子，所述洗脱步骤从固相去除靶分子，从而导致从一种或多种杂质分离靶分子。在各种实施方案中，捕获步骤可以利用色谱介质如树脂、膜或整体柱进行，或者利用聚合物如刺激响应性聚合物、聚电解质或结合靶分子的聚合物进行。 [0136]如本文所用，术语“盐”指通过酸和碱的相互作用形成的化合物。可以用于本文所述的方法中采用的各种缓冲液的各种盐包括但不限于乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、氯化物(例如氯化钠)、硫酸盐(例如硫酸钠)或钾盐。
[0137]如本文所用，术语“溶剂” 一般指能够溶解或分散一种或多种其他物质以提供溶液的液体物质。溶剂包括水性和有机溶剂，其中可用的有机溶剂包括非极性溶剂、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇和2，2-硫二甘醇。
[0138]在本文中可交换使用的术语“百万分数”或“ppm”指利用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的期望的靶分子(例如，靶蛋白或抗体)的纯度的度量。因此，这个度量可以用来衡量纯化过程后存在的靶分子的量，或者衡量不期望的实体的量。在一些实施方案中，单位“ppm”在本文中用来指溶液中的杂质的量，例如，以毫克/毫升计的所关注的蛋白的以纳克/毫升计的HCP或CH0P(即，CHOP ppm= (CHOP ng/ml)/ (所关注的蛋白mg/ml)。当蛋白干燥时(例如，通过冷冻干燥)，ppm指(CHOP ng) / (所关注的蛋白mg))。
[0139]在本文中可交换使用的术语多肽的“pi”或“等电点”指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pi可以计算自连接糖的多肽的氨基酸残基或唾液酸残基的净电荷，或者可以通过等电聚焦来确定。
[0140]如本文所用，术语“结合和洗脱模式”以及“结合和洗脱方法”指分离技术，其中样品中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fe区的蛋白)结合至合适的树脂或介质(例如，亲和色谱介质或阳离子交换色谱介质)并且随后洗脱。
[0141]在本文中可交换使用的术语“流过方法”、“流过模式”和“流过操作”指分离技术，其中生物药物制剂中包含的至少一种靶分子(例如，包含Fe-区的蛋白或抗体)与一种或多种杂质预期流过材料，所述材料通常结合一种或多种杂质，其中靶分子通常不结合(即，流过)。
[0142]在本文中可交换使用的术语“方法步骤”或“单元操作”指在纯化过程中使用一种或多种方法或装置以实现某种结果。在本文所述的方法和系统中可以采用的方法步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、结合和洗脱色谱、病毒灭活、流过纯化以及配制。应当理解每个方法步骤或单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该方法步骤或单元操作预期的结果。例如，在一些实施方案中，如本文所述，澄清步骤和/或流过纯化步骤可以采用一个以上的步骤或方法或装置以完成该方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，用来进行方法步骤或单元操作的一种或多种装置是一次性使用的装置，并且可以去除和/或置换而不必置换方法中的任何其他装置或甚至不必终止方法运行。
[0143]如本文所用，术语“孔径”和“标称孔径”指保留60-98%比率的大部分颗粒的孔径。
[0144]如本文所用，术语“通量”表示通过滤器过滤的体积。
[0145]如本文所用，术语“系统” 一般指整个纯化方法的物理形式，如本文所述，其包括两个或更多个方法步骤或单元操作。在一些实施方案中，系统封闭在无菌环境中。
[0146]在本发明中，使用开放分级层允许较大的颗粒穿透并捕获在捕获在滤器的深层内，而不是收集在表面上(参见实施例2A和2B)。
[0147]本发明的优点是较高的通量，并且保留大的固体(0.5微米-约200微米)，同时消除滤饼形成的问题。在初步澄清滤器中使用开放孔提供这些深层滤器，其固体停留的压力线性增加，而压力没有显著增加，因此导致高通量。滤器的结构尺寸联合层的优化(孔径和厚度)给出卓越的过滤特性，其可以保留大量固体。
[0148]在本发明中，使用开放分级层允许进料流中较大的絮凝颗粒穿入滤器的深层，并且捕获在滤器的孔内，而不是收集在表面上(参见实施例9(A-E)和11 (A-J))。本文提供的初步澄清深层滤器这样排列:“开放的”顶层构成深层滤器的前置过滤区以捕获较大的絮凝颗粒，而底层构成抛光区，其捕获较小的残余的聚集的絮凝颗粒。具有这种类型的排列的初步澄清深层滤器的一个优点是较高的通量，并且保留较大的絮凝颗粒，同时还消除滤饼形成的问题。在本文所教导的初步澄清滤器中使用这类开放孔提供固体停留的压力的线性增加，而压力没有显著增加，因此导致更高、更期望的通量。
[0149]本发明的初步澄清深层滤器的实例在图1A、1B、1C、1D、1E和IF中示出。
[0150]图1C示出具有至少7层的初步澄清深层滤器，并且在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
[0151]图1A和IE示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
[0152]图1B、1D和IF示出具有至少8层的初步澄清深层滤器，并且各自在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用。
[0153]图1A所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
[0154]图1B所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约5微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0155]图1C所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约8微米厚的非织造纤维如聚丙烯的单层(底部)，约0.2cm厚。
[0156]图1D所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0157]图1E所示的初步澄清深层滤器示出在用聚合物絮凝剂(例如，智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。[0158]图1F所示的初步澄清深层滤器示出在化学处理(例如，酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约35微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约15微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约
0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
[0159]本文提供的初步澄清深层滤器的结构尺寸联合初步澄清深层滤器的孔径和/或层厚度的优化导致非常有利的过滤特性，其还保留大量固体。因为深层滤器通过各种机制的组合实现滤过介质的深层，所以进料的柱体积(Vf)比介质的柱体积(Vm)示出不同滤器的有效性。
[0160]此外，各种进料具有不同量的固体，这导致深层滤器的高度可变的性能，因此(Vf)比(Vm)值给出滤器的实际“效率”的更好估计。
[0161]另一重要参数K用来描述滤器效率，同时对原料的固体含量归一化。参数K允许有效比较具有不同固体含量的进料的过滤。
[0162]如等式I所示，K参数实际上是3个可测量的参数柱通量(TP)、收集效率(η)和固体的初始浓度(Ci)的函数。
[0163]K = [TP] X [ η] X [Ci] X 100(I)
[0164]
[0165]如等式2所示，其中柱通量(TP)通过过滤的进料体积(Vf)除以介质体积(Vm)来给出，收集效率(Π)通过捕获的固体体积(Vs。)除以进料中的固体体积(Vs)来给出，而固体的初始浓度通过进料中的固体体积(Vs)除以过滤的进料体积(Vf)来给出。
【权利要求】
1.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料的方法，所述方法包括:a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；b)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料；c)使所述深层滤器介质与所述进料接触；以及d)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述细胞碎片和胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤。
2.权利要求1的方法，其还包括将化学絮凝剂加入步骤(b)的进料中，从而形成包含多种絮凝的细胞碎片和胶体颗粒的化学絮凝的进料。
3.权利要求1的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有〉约25 μ m的标称孔径评级，并且所述滤器絮凝的进料具有 > 约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
4.权利要求1的方法，其中所述澄清方法为初步澄清方法，并且所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
5.权利要求4的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
6.权利要求1的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
7.权利要求6的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5pm-约200pm的粒径分布，并且平均粒径大于约10pm。
9.权利要求2的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
10.权利要求1的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
11.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
12.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
13.权利要求12的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
14.权利要求11的方法，其中所述酸为乙酸。
15.权利要求4的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
16.权利要求2的方法，其中所述深层滤器提供> 约lOOL/MVhr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200pm的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
17.权利要求1的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
18.权利要求17的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
19.一种通过深层过滤但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤来初步澄清包含所关注的生物分子物质以及多种细胞物质的絮凝的进料的方法，所述方法包括:a)提供具有多孔深层滤器介质的深层过滤装置；b)提供化学絮凝剂；c)提供包含所关注的靶生物分子以及多种细胞物质和/或胶体颗粒的进料；d)将所述化学絮凝剂加入所述进料中；e)形成化学絮凝的进料，其包含絮凝的细胞物质和/或胶体颗粒；f)使所述深层滤器介质与所述化学絮凝的进料接触；以及g)分离所述进料中的所关注的靶生物分子与所述絮凝的细胞物质和/或絮凝的胶体颗粒但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤澄清步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述多孔深层滤器介质是各向异性的，所述孔具有> 约25 μ m的标称孔径评级，并且所述絮凝的进料具有 > 约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
21.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少2层非织造纤维的分级层。
22.权利要求21的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
23.权利要求19的方法，其中所述深层滤器包含至少3层非织造纤维的分级层。
24.权利要求23的方法，其中所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度。
25.权利要求19的方法，其中所述细胞物质和胶体颗粒具有约0.5 μ m-约200 μ m的粒径分布，并且平均粒径大 于约10 μ m。
26.权利要求19的方法，其中所述深层滤器介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的进料的开放标称孔径评级。
27.权利要求19的方法，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
28.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为聚合物或酸。
29.权利要求19的方法，其中所述化学絮凝剂为智能聚合物。
30.权利要求29的方法，其中所述智能聚合物为修饰的多胺。
31.权利要求28的方法，其中所述酸为乙酸。
32.权利要求19的方法，其中所述深层滤器提供> 约100L/M2的通量，并且去除絮凝的细胞碎片和絮凝的胶体颗粒。
33.权利要求19的方法，其中所述进料包括细胞培养物、转基因哺乳动物细胞培养物、细菌细胞培养物、非转基因哺乳动物细胞培养物、组织培养物、微生物发酵批次、植物提取物、生物燃料、海水培养物、淡水培养物、废水培养物、处理的污水、未处理的污水、奶培养物、血液培养物以及它们的组合。
34.权利要求19的方法，其中所述非织造纤维包括聚丙烯。
35.权利要求19的方法，其中所述进料是位于生物反应器中的细胞培养物，并且直接从所述生物反应器装入所述深层过滤装置以用于初步澄清加工。
36.权利要求35的方法，其中将澄清的细胞培养流出液直接装入蛋白A结合和洗脱色谱柱以用于色谱加工。
37.一种用于初步澄清包含所关注的靶生物分子以及多种细胞碎片和/或胶体颗粒的进料但不使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微滤步骤的深层过滤装置，其包含多孔深层滤器介质，所述介质具有至少2层非织造纤维的分级层，所述分级层具有约0.3cm-约3cm的总厚度，并且所述孔具有 > 约25 μ m的标称孔径分级。
38.权利要求37的装置，其中所述介质是各向异性的。
39.权利要求37的装置，其中所述介质包含至少3层非织造纤维的分级层。
40.权利要求37的装置，其中所述介质包含非织造纤维的分级层、纤维素和硅藻土的复合物，所述复合物具有足以过滤化学絮凝的原料的开放标称孔径评级。
41.权利要求37的装置，其中所述非织造纤维包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
42.权利要求37的装置，其中所述细胞碎片和所述胶体颗粒具有约0.5 μ m-约200 μ m的粒径分布，并且平均粒径大于约10 μ m。
43.权利要求37的装置，其中所述介质提供> 约lOOL/MVhr的通量，并且去除具有约0.5pm-约200 μ m的粒径分布的絮凝的细胞碎片和胶体颗粒。
44.权利要求37的装置，其中当将化学絮凝剂加入所述进料中时，滤器絮凝的进料具有〉约3%的固体从而导致〈约20NTU的浊度输出。
45.权利要求37的装置，其中所关注的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗剂。
46.一种从样品纯化靶蛋白的方法，所述方法包括:(i)提供包含靶蛋白以及一种或多种杂质的样品；(?)将沉淀剂加入所述样品中，并且利用梯度密度深层滤器去除一种或多种杂质，从而获得澄清的样品；(iii)使来自步骤(ii)的澄清的样品进行结合和洗脱色谱步骤，从而获得洗脱液；(iv)利用一个或多 个连续静态混合器或者一个或多个缓冲罐使来自步骤(iii)的洗脱液与一种或多种病毒灭活剂接触；(v)使病毒灭活步骤的输出进行流过纯化过程，其包括使用选自活性炭、阴离子交换色谱介质、阳离子交换色谱介质和病毒过滤膜的两种或更多种基质；以及(vi)以期望的浓度和缓冲条件配制来自步骤(V)的输出，其中所述方法连续进行，从而至少两个或更多个方法步骤在它们的持续时间的至少一部分期间同时进行。
【文档编号】B01D29/01GK103649297SQ201280033899
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年7月8日
【发明者】N·辛格, 程国顺 申请人:Emd密理博公司
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