专利名称：一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及药学领域，具体地说涉及一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用。
背景技术：
中药注射液源自中医药经典验方，对治疗疾病起着重要的作用，并在临床上广泛应用，但是，中药注射液导致的过敏反应却制约了其进一步的发展。产生过敏反应的原因有中药注射液成分复杂、质量不稳定、含有大分子物质如植物蛋白、鞣酸等以及大量半抗原成分。其中，大分子物质可以通过超滤以及分子筛等方法加以去除，但是中药注射液中的小分子半抗原除了少数已知的，如小檗碱、茶碱、丹参酮等，还有很多未知的半抗原成分，目前还没有一种确切的方法加以分离和鉴定。半抗原又叫做不完全抗原，在免疫学中指只有抗原性而无免疫原性的物质。半抗原分子量小，只有与体内的大分子物质如蛋白质等结合后才能形成完全抗原，常规分离抗原的方法难以分离半抗原。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法， 本发明的另一个目的是提供谷胱甘肽在分离中药注射液中半抗原的应用。技术方案对于利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，本发明是利用谷胱甘肽分离中药注射液中的半抗原，采用固定有谷胱甘肽S转移酶(GST)的层析柱来分离获得能与谷胱甘肽结合的半抗原成分。本发明利用半抗原的亲电子基团易同蛋白质的亲核基团反应这一特性，使半抗原与谷胱甘肽反应生成以共价键结合的复合物，再用能与谷胱甘肽特异性结合的GST将上述复合物从混合液中分离出来。值得注意的是，本发明所述谷胱甘肽包括但不限于谷胱甘肽，所述谷胱甘肽还包括含有谷胱甘肽的多肽以及谷胱甘肽类似物，所述谷胱甘肽能和谷胱甘肽S转移酶发生酶-底物结合反应。另外，本发明所述的混合液是包含若干种已知或未知半抗原以及其他成分的混合液。本发明所述半抗原是可与谷胱甘肽形成共价复合物的半抗原。利用本发明所述方法分离混合液中的半抗原都属于本发明的保护范围。本发明主要包括如下步骤(I)制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱；(2)将混合液与还原型谷胱甘肽溶液充分混匀，反复通过步骤(I)制得的亲和层析柱，用高浓度还原型谷胱甘肽溶液冲洗亲和层析柱洗，洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的谷胱甘肽-半抗原复合物；(3)去除步骤(2)洗脱后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色谱法分离获得谷胱甘肽-半抗原复合物的各个单一组分。
所述步骤⑴中固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，其制备方法是PCR扩增 PGEX4T1质粒中的谷胱甘肽S转移酶DNA序列，将其连接到pET28a(+)质粒中，转化到感受态细菌，继续培养并筛选出能正确表达谷胱甘肽S转移酶的阳性克隆，继续培养使细菌大量繁殖，收集细菌，用超声破碎细菌，离心后取上清液通过镍层析柱，将谷胱甘肽S转移酶固定在层析柱上。所述谷胱甘肽S转移酶是末端含有6个组氨酸的重组蛋白质。本发明是利用6个组氨酸能够与镍离子螯合的特性，将末端含有6个组氨酸的谷胱甘肽S转移酶固定在层析柱上。添加组氨酸标签对于重组蛋白质的分离与纯化十分有利，细菌自身蛋白质不包含连续的6个组氨酸序列，而该序列可以同镍离子形成牢固的螯合物，从而将重组表达的蛋白质固定在亲和层析柱上，这种结合可以被高浓度的咪唑破坏，方便将重组表达的蛋白质解离下来，而达到分离和纯化的目的。该方法步骤简单，可获得大量重组蛋白，并且纯度高，杂蛋白少。有益效果本发明的一种利用谷胱甘肽分离中药注射液中半抗原的方法可以迅速获得大量潜在的半抗原，方法简单易行，耗时短，可以有效节省时间和财力，还可为后续半抗原分析提供有力的技术支持。
具体实施例方式实施例II.制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，利用重组谷胱甘肽S转移酶的 His-Tag连接到镍层析柱，制备成可以和谷胱甘肽进行特异性结合的GST亲和层析柱，具体步骤如下(I)按照商业化试剂盒(B型质粒小量快速提取试剂盒，北京博大泰克)的方法收集pGEX4Tl质粒，用PCR方法扩增质粒中谷胱甘肽S转移酶DNA序列；正向引物序列为GGAGGATCCGTATTCATGTCCCCTATACTAGGT，反向引物序列为GGACTCGAGAACCAGATCCGAITTTGGAGGATGGT。PCR 反应体系如下5· 0μ I 的 10XPCR 缓冲液，5. O μ I 25mMMgCl2,4. O μ I dNTP (IOmM)混合物，I. 0μ I pGEX4Tl质粒，2. O μ I正、反向引物混合物，37. 5 μ I ddH20和
O.5 μ ITaq酶(5单位/ μ I)。梯度PCR的反应条件为94°C，5分钟；94°C 30秒，63°C 30秒， 720C 45秒循环4次；退火温度每降低1°C再循环4次，94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 45秒，循环20次；72°C，10分钟，4°C保温。I %的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，收集碱基在750bp 左右的条带，按照胶回收试剂盒(北京博大泰克)的方法回收PCR产物。用限制性内切酶 BamHI 和 Xho I 进行酶切反应，条件为7. 4 μ I ddH20,1.6μ I IOXK 缓冲液，1μ I BamH I， I μ I Xho I和5 μ I PCR胶回收产物，混合均匀后37°C反应2小时。(2)按照试剂盒的方法收集pET28a(+)质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切，条件为7. 4μ I ddH20,1.6μ I IOXK 缓冲液，1μ I BamH Ι，1μ1 Xho I 和 5μ1 质粒，混合均匀后37°C反应2小时。(3)将步骤⑴和步骤⑵的酶切产物分别用I %的琼脂糖凝胶电泳分离，收集目的条带。胶回收产物进行连接反应，条件为酶切后的PCR产物和pET-28a(+)质粒片段各 5μ1，1.6μ1 Τ4连接酶缓冲液，3. 4μ I ddH20和Ιμ Τ4连接酶，混合均匀，4°C连接过夜。
(4)转化质粒取上述连接产物8 μ I与100 μ I的Τ0Ρ10感受态细菌混合，置于冰水浴中30分钟，然后放入42°C水浴中90秒，迅速取出置于冰上冷却5分钟，加入800 μ I LB 培养基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH调节pH 7. 0,121°C 灭菌15分钟)，以200rpm的速度于37°C振摇45分钟。10，OOOXg离心I分钟，弃去上清， 细菌沉淀用200μ I LB培养基重悬，用接种棒将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH调节pH 7.0，15g琼脂， 121°C灭菌15分钟，在凝固前加入终浓度为30mg/l的卡那霉素，混合均匀后铺在培养皿中) 上，37°C培养12-16小时。(5)转化的细菌在有肉眼可见的菌斑出现时进行阳性克隆筛选。用接种针挑取单个克隆，接入到4ml含30mg/l卡那霉素的LB培养基中，37°C，200rpm振摇培养过夜。收集部分菌液进行PCR及酶切鉴定。合格的阳性克隆再进行DNA序列测定，选出能正确表达蛋白质的阳性克隆。(6)提取上一步中序列正确的阳性克隆的质粒，转化到表达菌株BL21(DE3)的感受态细菌中。铺琼脂板后培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有卡那霉素的LB培养基中继续培养，部分用于保种，其余以200rpm的速度于37°C培养。当OD6tltl达到O. 6-0. 8左右时，加入 75nM的IPTG，继续培养4小时。收集菌液，10，000 X g离心I分钟，弃去上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细菌沉淀两遍，PBS重悬细菌沉淀。用超声仪在冰水浴中破碎细菌，10，OOOXg 离心10分钟,收集上清。(7)将上清溶液恒速通过HiTrap Chelating纯化柱。按照纯化柱说明书用IOml 结合缓冲液洗涤纯化柱，随后分别用20，40，60，100,300,500mM的咪唑洗涤缓冲液梯度洗脱，收集蛋白质溶液。将蛋白质组分用G25分离、纯化。测定浓度后分装、冻干备用。(8)用适量的ddH20溶解谷胱甘肽S转移酶，使溶液通过HiTrap Chelating纯化柱，将其固定在柱上备用。2.用蛋白质过滤装置过滤混合液，收集滤液，制成冻干粉，每克冻干粉用5 30mlddH20溶解后，加入还原型谷胱甘肽溶液，使其终浓度为100 μ Μ，混匀后于37°C恒温水浴，反应30 60分钟。反复通过固定了谷胱甘肽S转移酶的纯化柱。用PBS冲洗纯化柱， 去除未与谷胱甘肽S转移酶结合的组分。再用IOmM还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液(由50mM Tris-HCl配制，pH 8.0)冲洗亲和层析柱，洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的半抗原复合物。冻干，备用。3.上一步骤的洗脱液中含有谷胱甘肽-半抗原复合物及多余的谷胱甘肽，采用高效液相色谱法去除混合物中多余的谷胱甘肽，分离主要的谷胱甘肽-半抗原复合物。高效液相色谱分析条件流动相为甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速为lml/min ； 检测波长为29Inm;柱温是35°C。通过高效液相的分离方法可以获得多个谷胱甘肽-半抗原复合物纯品，用于后续的质谱等鉴定。实施例2本发明还可用于中药注射液中半抗原成分的分离，并可进一步用于半抗原的区分和鉴定。本实施例的混合液采用双黄连注射液，其主要成分是金银花、黄芩、连翘的提取物。制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱方法如实施例I所示，然后用蛋白质过滤装置过滤双黄连注射液，收集滤液，制成冻干粉，每克冻干粉用10 20ml ddH20溶解后，加入还原性谷胱甘肽溶液，使其终浓度为100 μ Μ，混匀后于37°C恒温水浴，反应40 50 分钟。反复通过固定了谷胱甘肽S转移酶的纯化柱。用PBS冲洗纯化柱，去除未与谷胱甘肽S转移酶结合的组分。再用IOmM还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液(由50mM Tris-HCl配制， PH 8.0)冲洗亲和层析柱，洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的半抗原复合物。冻干，备用。用高效液相色谱法去除洗脱液中多余的谷胱甘肽，分离主要的谷胱甘肽-半抗原复合物。高效液相色谱分析条件流动相为甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速为lml/min ;检测波长为291nm ;柱温是35°C。通过高效液相的分离方法可以制备多个谷胱甘肽-半抗原复合物纯品，用于后续的质谱等鉴定。试验例I双黄连注射液中的主要活性成分是金银花、黄芩、连翘，目前已知该方剂中存在绿原酸，绿原酸起到抗菌消炎、保肝利胆的作用，同时也是具有致敏作用的半抗原。本试验例通过小鼠体内淋巴细胞增殖实验证明本发明所述方法可以有效分离双黄连注射液中的致敏成分，包括绿原酸。按照实施例2的方法，将双黄连注射液的冻干粉溶解于还原型谷胱甘肽溶液中， 连续通过固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，将过柱前、后的溶液分别制成冻干粉。将上述注射液冻干粉溶解在DMSO中，配制成5%的溶液，绿原酸配制成O. 2%的 DMSO溶液，分别涂布于Balb/c小鼠的耳朵上，25 μ I/耳，连续涂布3天。以O. 05%二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)为阳性对照。在第6天将小鼠处死,分别取小鼠引流淋巴结，制备淋巴结细胞悬液，二氧化碳培养箱培养I小时，加入5mg/ml MTT，继续培养4小时后，1，000 Xg离心5分钟，弃上清，加入DMSO 100 μ I/孔，使紫色结晶溶解。用酶标仪在波长570nm测定吸光度(A)值。与溶剂对照组小鼠进行比较，计算刺激指数，刺激指数=A( ^^fe)/A(_WM)。刺激指数大于等于3的化合物有致敏性。统计结果如下表所示。表I.局部淋巴结试验结果
受试物淋巴结重量 (mg)淋巴细胞计数 (106/ml)吸光度(A)值刺激指数空白对照6.3 ±1.95.2±1.10.49 士 0.05—DMSO6.7 士 1.85·5 士 1.20.55 士 0.07—0.2%绿原酸14.5 士 2.413.1 士 2.21.76 士 0.193.25%过柱前成分16.9 士 2.914.7 士 2.71.92 士 0.243.55%过柱后成分10.7 士 1.89.1 ±1.40.83 士 0.101.50.05% DNFB20.1 士 2.617.9 士 2.62.28 士 0.214.1由表I可见，DNFB这种已知的半抗原作为阳性对照可以刺激引流淋巴结中的淋巴细胞增殖，刺激指数达到4. I。通过将绿原酸与DMSO比较，绿原酸可引起淋巴细胞增殖，吸光度增加，刺激指数为3. 2，表明绿原酸具有致敏性。而比较通过重组谷胱甘肽S转移酶层析柱前、后的双黄连注射液的成分，发现过柱后的双黄连注射液很少引起淋巴细胞增值，刺激指数小于3，注射液通过重组谷胱甘肽S转移酶层析柱后可以显著降低该注射液的致敏性，显示大部分致敏物质被分离并去除。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱；(2)将混合液与还原型谷胱甘肽溶液充分混匀，反复通过步骤(I)制得的亲和层析柱， 用高浓度还原型谷胱甘肽溶液冲洗亲和层析柱洗，洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的谷胱甘肽-半抗原复合物；(3)去除步骤(2)洗脱后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色谱法分离获得谷胱甘肽-半抗原复合物的各个单一组分。
2.根据权利要求I所述的一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，其特征在于所述谷胱甘肽S转移酶是末端含有6个组氨酸的重组蛋白质。
3.根据权利要求2所述的一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法，其特征在于，所述步骤(I)中固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，其制备方法是PCR扩增 PGEX4T1质粒中的谷胱甘肽S转移酶DNA序列，将其连接到pET28a ( + )质粒中，转化到感受态细菌，继续培养并筛选出能正确表达谷胱甘肽S转移酶的阳性克隆，培养一定时间后破碎细胞，离心后取上清液通过镍离子亲和层析柱，将谷胱甘肽S转移酶固定在层析柱上。
4.谷胱甘肽在分离中药注射液中半抗原的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用谷胱甘肽分离混合液中半抗原的方法及应用，包括如下步骤制备固定有谷胱甘肽S转移酶的亲和层析柱，向混合液中加入还原型谷胱甘肽溶液，混匀后恒温水浴，反复通过亲和层析柱，再用高浓度谷胱甘肽溶液冲洗亲和层析柱以洗脱结合到谷胱甘肽S转移酶上的半抗原复合物；分离步骤洗脱液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色谱法获得谷胱甘肽-半抗原复合物的各个单一组分。用本发明的方法可以迅速分离得到大量潜在的半抗原成分，方法简单易行，耗时短，可以有效节省时间和财力，还可为后续半抗原分析提供有力的技术支持。
文档编号B01D15/10GK102600639SQ201210003620
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者易宏伟 申请人:东南大学