层析介质的利记博彩app

专利名称：层析介质的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及层析法领域。更精确地，本发明涉及一种新型层析介质，即，一种 提供有不同的盖的疏水性介质，由于疏水性介质的孔隙率和/或盖的孔隙率，排除超过 一定尺寸的分子。在生物技术中，迄今为止提出的层析法基于与目标的相互作用的不同的模式。 因此，例如，在离子交换层析法中，官能团为与其相反电荷的反荷离子永久结合的离子 基团，而在疏水性相互作用层析法(HIC)中，固定相与待分离的组分之间的相互作用基 于疏水性。基于疏水性相互作用的层析法通常分为命名为HIC和RPC的两种类型。HIC是指使用非常亲水性的基质的蛋白质的疏水性相互作用层析法，其中疏水 性配体与蛋白质的固定化程度非常低，以避免已分离的蛋白质变性。为了吸附待分离的 蛋白质，需要在水中使用高浓度的无机盐。通常通过在洗脱步骤中逐步降低离子强度来 实现解吸。RPC是指使用与疏水性非极性分子/配体(通常为包含4-18个碳原子的脂族碳 链)官能化程度非常高的基质(通常基于二氧化硅)的层析法。通常无需加入盐可实现 吸附。最常通过逐步增加在洗脱溶液中有机溶剂的含量来进行解吸或洗脱。含有18个碳链的RPC介质与蛋白质牢固结合。在结合过程中蛋白质也有不同 程度的变性。为了洗脱蛋白质，需要使用特别的条件。但是，具有较短链(4个碳)的 RPC介质可与包含添加剂(例如三氟乙酸)的基于水/乙腈的洗脱液一起使用，用于蛋白 质分离。固定相(也称为分离基质)包含载体和与载体偶联的配体，所述载体通常为许多 基本上为球形的颗粒。在大多数分离基质中，载体具有多孔性，以在每个颗粒中允许较 大量的配体，因此具有更多结合的目标化合物。载体最通常为天然或合成的聚合物，并 且可采用多种不同的方式来生产球形颗粒。也使用二氧化硅和玻璃珠。常用于该目的的 天然聚合物为多糖葡聚糖和琼脂糖。对于通过层析和分批法分离生物分子，基质(珠、整料、填充膜，等等)的孔隙 率非常重要。聚合物介质的优点在于容易在宽范围内改变孔径大小及其高化学稳定性， 例如对高pH值的耐受性。在所有文献中可接受的总的原则是对于大分子使用具有大孔径 的介质。在这些孔中的传质是由于扩散过程而不是对流。在共同待审的SE 0800263-6申请中，描述了一种基于旋转式圆盘技术的方法 (Walter 和 Prewett，Walton, W.H. ； Prewett, W.C. (1949)Proc.Phys.Soc.B.62, 341-350)来 生产具有所选孔隙率的琼脂糖珠来排除大分子。人源化单克隆抗体(mAb)非常有希望作为生物药物。在纯化mAb中所面临的 最大的挑战之一为在细胞培养基中将其与宿主细胞蛋白质(HCP)分离。当今可使用多种 mAb分离技术，包括在蛋白质A上的亲和层析法、离子交换层析法和疏水性相互作用层 析法(HIC)。所有这些技术涉及使用流动相(吸附缓冲液)，必须调节该流动相以实现mAb-分子与配体之间的相互作用。例如，在HIC中，必须向流动相中加入大量的盐，并 且在离子交换层析法的情况下，必须调节流动相的pH，使得与离子交换配体相比，mAb 带相反的电荷。此外，当mAb被配体吸附时，必须调节流动相以实现mAb的解吸。期望得到一种层析介质，该层析介质的孔径分布和表面性能可防止大分子(例 如mAb)进入珠，并且在内部可吸附蛋白质和其他肽或生物分子，而与缓冲液条件无 关。用于分离生物分子的离子交换剂在低离子强度下能吸附大多数带电荷的生物分子， 但是当离子强度提高至超过一定水平时，这些介质失去吸附样品分子的能力。发明概述本发明提供了一种介质，该介质在核心实体中具有高疏水性，使得在非常低离 子强度和非常高离子强度下、在宽pH范围内，蛋白质均可相互作用或被吸附。第一方面，本发明涉及一种分离介质，所述分离介质包含多孔性疏水性核心实 体；和覆盖所述核心实体的整个外部的多孔性亲水性盖，其中所述盖仅允许低于一定尺 寸的分子渗透分离介质的核心实体的内部并与之相互作用。在一个优选的实施方案中，还优选所述疏水性核心实体仅允许低于一定尺寸的 分子渗透分离介质的核心实体的内部并与之相互作用。所述多孔性亲水性盖为围绕所述核心实体的多孔性外层或夹套/壳。所述分离介质优选提供有高度疏水性核心，以便结合蛋白质和其他疏水性分 子，而与样品的特性和运行条件无关，运行条件例如在层析法的情况下，为离子强度和 pH,或者在分批法的情况下为上清液。所述分离介质优选为珠形状，但是也可为膜。介质的尺寸排阻特性由其多孔性成分之一或两者的孔隙率决定。以上所指的一 定尺寸低于排除以下目标分子/有机体/颗粒的尺寸例如细胞、细胞颗粒、病毒、病毒 样颗粒、质粒、任何类型的抗体、脂类、蛋白质、肽和核酸。该介质将小尺寸分子与上 述类型的较大的分子有效分离。所述疏水性核心实体本身可为疏水性的，且可基于疏水性聚合物。例如，苯乙 烯/乙基苯乙烯/DVB、包含疏水性取代基的乙烯基醚和丙烯酸酯以及含氟烷烃的聚合 物。或者，所述疏水性核心实体本身为亲水性的，且基于被疏水性相互作用配体官 能化的亲水性聚合物。所述疏水性相互作用配体可包含脂族烃(例如Ci-C^烷基，优选 C4_C16烷基)和/或芳族烃(例如苯基、蒽(antracene)、萘(naphtalene))。与配体无关， 配体密度应总是优化的，以便在低离子强度下吸附并且目的是得到所需的介质高度疏水 性性质。优选，配体密度应超过标准HIC-水平，即，> 90iimol/ml核心实体。疏水性核心实体允许吸附样品中的分子(具有最低分子量和/或最小尺寸)，该 分子在低离子强度例如0-1M，优选0-0.4M，最优选0-0.1M下和在pH间隔2_11下能渗 透盖o在一个实施方案中，所述核心实体除了所述疏水性配体以外还包含其他配体， 所述其他配体可位于所述核心实体上和/或与所述核心实体相关和/或位于所述疏水性配 体上。所述其他配体可为疏水性的，且可包含非主要带电荷的基团。优选，所述其他配 体为静电相互作用配体，即，带正电荷和/或带负电荷的配体。例如，这些其他配体可 为带有正电荷的辛基胺配体，提高了小的带负电荷的分子与核心实体的结合。应调节另外加入的带电荷的配体的量，使得它们对与主要的疏水性配体的疏水性相互作用的影响 不太大。在一个优选的实施方案中，所述核心实体和盖由琼脂糖制成，并且所述疏水性 配体为包含4-16个碳原子的烃配体，优选辛基配体。优选，核心实体的孔径防止超过一定尺寸的分子进入所述孔。或者，或者除此 以外，在盖中提供聚合物水凝胶(例如葡聚糖)以填充所述孔，从而进一步降低和调节孔 径，以防止高分子量分子进入所述孔。在再一个实施方案中，所述亲水性盖包含任何类型的层析配体，该配体与样品 内的具有最高分子量和/或最大尺寸的分子可逆结合。一些小分子可能也与盖结合，但 是在洗脱步骤过程中，这些小分子最可能渗透盖并与核结合。对于某些应用，例如蛋白质组分析，可将磁性颗粒掺入到分离介质的核心实 体。本发明还涉及一种分离介质，该分离介质包含上述盖珠介质与常规层析介质 (例如HIC、IE或亲和介质)的混合物。优选所述盖珠介质占总介质体积的最高达10%。 在该混合介质的一个优选的实施方案中，所述盖珠介质包含辛基配体，并且所述层析介 质包含阳离子交换介质。该混合介质的益处在于提高大分子与小分子之间的分辨率。在第二方面，本发明涉及在低离子强度下、在pH为2-11下，使用上述分离介质 来从样品中吸附低于一定尺寸的分子，优选在一个单一步骤中进行。所述方法可用于纯 化超过或低于所述尺寸的分子。因此，该方面涉及使用所述分离介质的方法，所述方法 包括吸附分子的步骤和任选的一个或多个其他步骤。在具体的应用中，以上所指的孔径随着目标分子的尺寸而变，并且由目标分子 的尺寸决定。优选该一定尺寸范围相应于选自以下的分子/有机体/颗粒的尺寸范围细 胞、细胞颗粒、细菌、病毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、脂类、蛋白质、肽、核酸。所 述样品可例如为培养上清液，并且所述高分子量分子可为单克隆抗体。所述分离介质在 细胞收获时加入非常有用，用于快速除去不期望的酶，如蛋白酶、肽酶和核酸酶，例如 胰蛋白酶、糜蛋白酶、DNase和RNase。所述分离介质可用于层析模式或分批模式。可 使用任何柱或分批形式。对于某些应用，例如对于临床I期和II期研究的生物药物的纯 化，在RTP (准备加工)形式中优选一次性柱。在一个备用实施方案中，被吸附的低分子量例如低于60000D的分子可为期望 的分子，例如生物标记或药物标记，例如通过降低洗脱液的极性，将其从核心实体中洗 脱，并进一步分析。另一个实例为将目标分子吸附在核心实体中，但不用于进一步分 析，例如用于脂类去除。当所述目标分子为大分子/有机体/颗粒时，例如细胞、细胞颗粒、细菌、病 毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、蛋白质，目标分子可在流通物中得到，因此，不被介质 吸附。或者，所述目标分子为大分子/有机体/颗粒，例如细胞、细胞颗粒、细菌、病 毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、蛋白质，它们被吸附在盖上。所述目标分子随后通过适 于所选吸收模式(例如离子交换盐和/或pH梯度，IMAC:咪唑梯度，硼酸盐糖或 pH梯度，HIC:降低盐浓度)的技术来洗脱。
本发明的分离介质的优选用途为纯化单克隆抗体。另一个优选用途为其中所述 目标分子为小于1000kD的分子或颗粒。该实施方案适用于纯化病毒，例如流感病毒，但 是也适用于其他大分子，例如IgM抗体。附图概述

图1说明经测试的三种不同的珠设计。1A 琼脂糖20 Fast Flow (20 %琼脂糖颗 粒)和旋转式圆盘，IB :盖-葡聚糖琼脂糖6 Fast Flow。IgG =单克隆抗体；P =分子 量小于约70000的蛋白质。发明详述本发明涉及一种层析介质，该层析介质在基质中具有亲水性和疏水性区域两 者，并且可基于本身为疏水性的基质，或者基于含有疏水性配体的亲水性基质，并且提 供有亲水性外层。所述介质还可基于被疏水性配体(例如珠中的疏水性内核)内部官能 化的亲水性基质。合成路径的实例 本身疏水性原料，例如覆盖有亲水性和多孔性层的DVB珠。 本身亲水性原料，其被疏水性官能团完全官能化，并且随后覆盖有亲水性和 多孔性层。将亲水性基质层活化并与疏水性配体内部偶联(图1)。 将疏水性基质层活化，并且使外部亲水性官能化。本发明还提供了一种从液体的其他组分中分离大分子量分子例如抗体的方法， 比起现有技术的方法，所述方法需要较少的时间和加工步骤。这通过以下方法来实现， 其中使包含所需高分子量分子(例如抗体)的液体与层析介质接触，并且在非结合模式或 可逆结合模式中回收基本上纯的高分子量分子。另一个优点在于即使在非常低的离子强 度下，低分子量分子例如宿主细胞蛋白质也被吸附于介质的内部。层析介质的载体基质和核心实体可基于有机材料或无机材料。优选为有机聚合 物形式，其不溶于水，但是在水中或多或少可溶胀。合适的聚合物为多羟基聚合物，例 如基于多糖，如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉，等等；和完全合成的聚合 物，如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羟烷基乙烯基醚)、聚(羟烷基丙烯酸酯)和 聚甲基丙烯酸酯(例如聚缩水甘油甲基丙烯酸酯)；聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯 的聚合物；以及其中包括两种或更多种相应于上述聚合物的单体的共聚物。例如通过交 联和通过吸附或共价结合与不溶性物体偶联，可使可溶于水中的聚合物衍生化为不溶性 的。通过具有可转化为OH的基团的单体的接枝聚合，或例如通过结合或吸附合适的化 合物(例如亲水性聚合物和其他亲水性化合物)使最终的聚合物亲水化，可将亲水性基团 引入到疏水性聚合物(例如单乙烯基苯和二乙烯基苯的共聚物)上。可使用包括环氧化 物或反应性卤化物的反应。可用于载体基质的合适的无机材料为二氧化硅、玻璃、氧化锆、石墨、氧化
钽，等等。优选的载体基质不含对水解不稳定的基团，例如硅烷醇、酯、酰胺基以及因此 存在于二氧化硅中的基团。在本发明的一个特别感兴趣的实施方案中，载体基质为不规则或球形颗粒形 式，对于高性能应用，其尺寸范围为1-1000 iim，优选5-50iim，对于制备目的，其尺寸范围为50-300 iim。载体基质的一种感兴趣的形式具有高于或低于液体样品或待使用的缓冲液溶液 (例如发酵物料)的密度。这种基质特别适用于用于流化床或膨胀床层析法以及不同的 分批法(例如在搅拌的罐中)的大规模操作。流化床和膨胀床法描述于WO 92/18237和 WO 92/00799。这些基质最实用的用途为将密度比流化液体的密度高的颗粒/珠与上向 流组合。在样品溶液包含颗粒和粘性材料的情况下，这种采用膨胀床模式的载体基质特 别有益。术语“亲水性载体基质”在实践中是指基质可接近的表面为亲水性的且对蛋白 质友好，即，该表面不会不可逆的吸附蛋白质和使蛋白质变性。通常在亲水性基础基质 上的可接近的表面暴露多个极性基团，例如包含氧和/或氮原子的基团。这种极性基团 的实例为羟基、氨基、羧基、磺酸酯(S和SP配体)、低级烷基的醚(例如(-CH2CH2O-) nH,其中n为2、3、4和更大的整数)。亲水性表面涂层(可能为亲水性增量剂形式)在概念上属于载体基质。在普通的/公认的HIC介质中，需要通过向流动相中加入盐以提高极性来实现 蛋白质的结合。随后通过降低盐的浓度，从基质中释放已结合的蛋白质。因此，该方法 的缺点在于需要向原料中加入盐，因为这样可能引起问题，并因此增加大规模使用者的 成本。通常在盐浓度为0.75-4M之间将蛋白质吸附至普通HIC-介质(Jansson，J._C.和 Ryden, L., Protein Purification-Principles, High Resolution Methods and Applications (蛋白 质纯化一原理、高分辨率方法及应用)，VCH，Weinheim,第220-221页)。本发明涉及一种介质，该介质在MAb纯化过程中，使得与小足以渗透至分离基 质的疏水性核中的分子(例如HCP)的相互作用最大，并且与样品中的最大的蛋白质(例 如MAb-分子和MAb-二聚体)的相互作用最小。此外，本发明的一个实施方案能够使 用不额外加入盐的流动相，并且对于含有中性或几乎中性盖(非结合盖)的实施方案，无 需洗脱缓冲液(解吸缓冲液)来回收期望的高分子量分子或有机体。测试了针对宿主细 胞蛋白质而不是大的单克隆抗体捕获的珠设计的三种不同的方法。在一种方法中，设计 基于高含量琼脂糖(20%)的琼脂糖珠来得到一种珠，该珠具有排除大蛋白质(单克隆抗 体)的孔隙率(图1A)。在再一种方法中，生产基于琼脂糖6 Fast Flow和凝胶过滤盖的原 型。通过使葡聚糖与珠的外区段偶联得到盖。设计在葡聚糖填充的区段中得到的孔径， 以防止大分子例如mAb进入珠的核中(图1B)。第三种方法基于旋转式圆盘介质，该介 质描述于共同待审的SE专利申请0800263-6。在这种情况下，还设计通过引入中性外区 段来排除大蛋白质的珠(图1A)，所述中性外区段通过由共同拥有的层活化专利EP 0966 488 B1 (Process for introducing a functionality (引入官能团的方法))所描述的方法获得。在疏水性配体与不同的原型连接的过程中，使用一种合成方法来防止配体与珠 的表面偶联，并且，采用这种方式，由于单克隆抗体与珠外部的疏水性相互作用而消除 吸附。命名为盖-OH核-辛基介质的原型是指辛基配体仅在珠的核中连接。此外，调 节珠的核中配体的量，使用具有非常低离子强度的吸附缓冲液，使得宿主细胞蛋白质被 吸附，将离子强度调节至与生物分子的层析法相关的任何pH值。实验部分本文提供的这些实施例仅用于举例说明的目的，不应看做是限制由所附权利要求所限定的本发明。实施例1 基于琼脂糖20 Fast Flow (A)、琼脂糖6 Fast Flow (B)和旋转式圆盘介
质(C)的辛基介质的制备基质的体积是指澄清床体积，基质的重量是指抽吸干重，并用克给出。对于 大规模反应，由于使用磁力棒搅拌器促使破坏珠，因此搅拌是指悬浮的马达驱动的搅拌 器。在封闭的小瓶中进行小规模反应(最高达20ml凝胶)，并且搅拌是指使用振荡工作台。使用常规方法来分析官能团和确定烯丙基化、环氧化的程度、或者离子交换剂 基团在珠上的取代程度。A盖-OH核-辛基琼脂糖20 Fast Flow的制备A1 琼脂糖 20 Fast Flow 的制备通过于95°C下加热约10小时，将琼脂糖(50g)溶解于水(250g)中。在乳化容 器中，将该溶液加入到甲苯(375ml)和乙基纤维素(35g)中，温度保持在70°C。该乳化 容器配备有浆式搅拌器。将搅拌器的速度从150rpm逐步增至340rpm，温度保持在70°C。 当通过显微镜判断琼脂糖颗粒具有所需尺寸时，将速度降至150rpm。随后将乳液冷却， 让珠形成凝胶。用乙醇和水洗涤珠。将水加入到250ml珠中，至总重量为310g。 向该悬浮液中加入38g Na2S04、 3.0ml50%Na()H*0.25gNaBH4，将温度升至47°C。随后在6小时期间，用泵加入表氯 醇(31.4ml)和氢氧化钠溶液(21.6ml)。加入完成后，于47°C下继续反应过夜。随后将 浆料冷却，并使用60%乙酸中和至pH为5-6。最后，在玻璃滤器上用蒸馏水仔细洗涤凝 胶。随后将珠在43 ii m和166 u m布上筛分。A2 OH-盖烯丙基琼脂糖20 Fast Flow的制备烯丙基活化的琼脂糖20 Fast Flow。将50g浙干的琼脂糖20 Fast Flow (Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)与 15ml 50 % NaOH 溶液、6g Na2S04 和 O.lg NaBH4混合。将混合物于50°C下搅拌1小时，接着加入30ml烯丙基缩水甘油基醚 (AGE)。将反应浆料于50°C下搅拌17小时。随后在玻璃滤器上用蒸馏水、乙醇洗涤凝 胶，最后再次用蒸馏水洗涤。部分溴化和NaOH处理(OH-盖的制备)。将10ml浙干的烯丙基化的琼脂糖20 Fast Flow在5ml蒸馏水和0.4g乙酸钠中搅拌。加入在加盖的小瓶中用10ml蒸馏水溶解的 125iU溴，并继续搅拌5分钟。水洗后，将浙干的凝胶与7.5ml 2M NaOH—起于50°C下 搅拌18小时，接着水洗。通过滴定测得在珠的核中剩余的烯丙基含量为0.37mmol/ml。A3 核偶联在珠的核中辛基的偶联。将4.5ml OH-盖琼脂糖20 Fast Flow (见上述)完全溴 化并洗涤。将浙干的凝胶与1.25ml辛硫醇在4.5ml 2MNaOH和1ml乙醇中的溶液混合， 接着于50°C下搅拌16小时。用水、乙醇和水洗涤后，将凝胶储存在20%乙醇中。B 盖-葡聚糖核-辛基琼脂糖6 Fast Flow的制备B1 盖-葡聚糖烯丙基琼脂糖6 Fast Flow的制备琼脂糖6 Fast Flow的烯丙基化。根据以上所述将琼脂糖6 Fast Flow烯丙基化，
通过滴定测得烯丙基含量为259 u mol/ml。
部分溴化。将烯丙基化的琼脂糖6 Fast Flow (100ml)在烧瓶中称重，加入900ml 蒸馏水和1.3g硫酸钠。随后在剧烈搅拌下，用移液管加入0.3当量溴(400 iU)。约5分 钟(此时溴已消耗完)后，在玻璃滤器上用蒸馏水洗涤凝胶。葡聚糖偶联。将51ml部分溴化的凝胶转移至烧瓶，加入30g葡聚糖AB在125ml 蒸馏水中的溶液。搅拌30分钟后，加入lOgNaOH和0.5gNaBH4，将浆料加热至50°C， 并搅拌过夜。约18小时后，使用乙酸(60%溶液)将pH调节至约7。随后在玻璃滤器 上用蒸馏水洗涤凝胶。B2 核偶联在珠的核中辛基的偶联。将10ml浙干的凝胶(与琼脂糖6 FastFlow偶联的葡聚 糖，见上述)与蒸馏水一起放在烧杯中，并开始剧烈顶置式搅拌。加入溴，直至浆料剩 余深橙色/黄色。搅拌10分钟后，加入甲酸钠(约1.5g)，直至浆料完全褪色。随后在 玻璃滤器上用蒸馏水洗涤凝胶。将浙干的溴化的凝胶在烧瓶中称重，并加入10ml蒸馏 水和2.3ml辛硫醇。随后使用NaOH (50 %溶液)将pH调节至约12.5。随后将混合物于 50°C下搅拌过夜。20小时后，用蒸馏水和乙醇洗涤凝胶。C - -OH -絲臓麵静馳艦C1 旋转式圆盘介质的制备6%琼脂糖溶液用作原料。研究温度、冷却速率、粘度、速度和琼脂糖流速(至 圆盘)相对于孔隙率的响应。旋转式圆盘装置由ABB Industriservice根据给定的说明书制造(见下面)钢品质SS 2343-02 (对于所有指定的项目)聚合物材料PTFE，聚碳酸酯(拱顶保护)，EPDM (乙烯丙烯二烯单体)，硅橡胶。拱顶高度900mm捕获盆直径2400mm，包括排水通道捕获盆斜率3°圆盘数量6圆盘直径200mm一般圆盘厚度最大5.2mm边缘处的圆盘厚度12.4mm，包括135°斜率上部压力补偿室直径(对于液体琼脂糖溶液):73mm上部压力补偿室高度6mm分布针数量6针的内径0.7mm通过针将琼脂糖溶液加入到6个圆盘中。通过使用6个圆盘而不是1个圆盘， 增加了容量。对于6个圆盘中的每一个，琼脂糖流量均相同。这意味着源自每个圆盘 的珠尺寸均相同。将圆盘的速度范围调节在3001-3010rpm内，且拱顶内的相对湿度为 100%。如果相对湿度小于100%，则存在水从琼脂糖液滴中蒸发的风险。使用调节至69.7°C且粘度在397_421mPa内的烯丙基化的6%琼脂糖溶液加入到 旋转式圆盘。将琼脂糖溶液至圆盘的流速调节至170ml/分钟。捕获水温度为20.1°C。
与表氯醇交联后，旋转式圆盘珠的孔隙率呈现于表1。使用不同的葡聚糖来估测 孔隙率，并且使用蓝色葡聚糖2000得到空隙体积。生产旋转式圆盘原型，以得到不允许 免疫球蛋白渗透珠的孔隙率。这意味着分子量大于约150000g/mol的分子应该不能扩散 至珠中。表1.用于旋转式圆盘原型的五种不同的葡聚糖标准品的Kav_值
权利要求
1.分离介质，所述分离介质包含多孔性疏水性核心实体；和覆盖所述核心实体的整 个外部的多孔性亲水性盖，其中所述盖仅允许低于一定尺寸的分子渗透分离介质的核心 实体的内部并与之相互作用。
2.权利要求1的分离介质，其中所述疏水性核心实体仅允许低于一定尺寸的分子渗透 分离介质的核心实体的内部并与之相互作用。
3.权利要求1或2的分离介质，其中所述疏水性核心实体本身为疏水性的且基于疏水 性聚合物。
4.权利要求1或2的分离介质，其中所述疏水性核心实体本身为亲水性的且基于被疏 水性相互作用配体官能化的亲水性聚合物。
5.权利要求4的分离介质，其中所述疏水性相互作用配体包含脂族或芳族烃。
6.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中在O-IM的低离子强度下、在2-11 的pH间隔内，所述疏水性核心实体允许吸附低分子量分子和/或小尺寸分子。
7.权利要求4或5的分离介质，其中所述核心实体除了所述疏水性配体以外还包含其 他配体，所述其他配体可位于所述核心实体上和/或与所述核心实体相关和/或位于所述 疏水性配体上。
8.权利要求7的分离介质，其中所述其他配体为静电相互作用配体。
9.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中所述核心实体的孔径防止超过一定 尺寸的分子进入所述孔。
10.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中所述亲水性盖包含与样品内的分子 可逆结合的配体。
11.上述权利要求4-10中一项或多项的分离介质，其中所述核心实体和盖由琼脂糖制 成，并且所述疏水性配体为C4-C16配体。
12.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中在盖中提供水凝胶以填充所述孔， 从而进一步降低和调节孔径，以防止高分子量分子进入所述孔。
13.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中将磁性颗粒掺入到所述核心实体中。
14.上述权利要求中一项或多项的分离介质，其中所述盖和/或核心实体通过层活化 官能化。
15.上述权利要求中一项或多项的分离介质，所述分离介质与层析介质混合，其中所 述分离介质占总介质体积最高达10%。
16.权利要求15的分离介质，其中所述分离介质包含辛基配体，并且所述层析介质为 阳离子交换介质。
17.上述权利要求中一项或多项的分离介质用于在超过或等于OM的低离子强度下、 在pH为2-11，从样品中吸附低于一定尺寸的分子的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述一定尺寸相应于由选自以下的分子/有机体/颗粒 表示的尺寸范围细胞、细胞颗粒、细菌、病毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、脂类、蛋 白质、肽或核酸。
19.权利要求17或18的用途，其中所述目标分子为小于60000D的小分子或颗粒。
20.权利要求17或18的用途，其中所述目标分子为小于IOOOkD的分子或颗粒。
21.权利要求17-20中一项或多项的用途，其中所述目标分子为大分子/有机体/颗 粒，例如细胞、细胞颗粒、细菌、病毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、蛋白质，它们不被 吸附在分离介质上而是在流通物中得到。
22.权利要求17-21中一项或多项的用途，其中所述目标分子为大分子/有机体/颗 粒，例如细胞、细胞颗粒、细菌、病毒、病毒样颗粒、质粒、抗体、蛋白质，它们被吸 附在盖上。
全文摘要
本发明涉及层析法领域。更精确地，本发明涉及一种新型层析介质，即，一种提供有不同的盖的疏水性介质，由于疏水性介质的孔隙率和/或盖的孔隙率，排除超过一定尺寸的分子。本发明还涉及使用所述分离介质来纯化不进入分离介质的大分子以及进入分离介质并从中洗脱的小分子。
文档编号B01D15/34GK102015094SQ200980114972
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月21日 优先权日2008年4月22日
发明者B-L·约翰逊, G·格拉德, J·伯格斯特伦, J-L·马洛伊塞尔, N·诺尔曼, T·E·塞德曼 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司