专利名称：一种没食子酸配基的琼脂糖亲水吸附色谱介质的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种色谱介质的合成方法，具体地是涉及一种没食子酸配基的琼脂糖 亲水吸附色谱介质的合成方法。本发明属于生物工程的生化分离领域。
背景技术：
生物药物生产过程中分离纯化的费用占成本的绝大部分，其中使用最普遍的是色 谱技术及其组合，目前所用介质主要是凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和、 反相介质，其基质材料有琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是在生物 药物生产中使用最为广泛的基质材料。它是一种天然多糖，具有高孔度；具有高的连 通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积提供很高的吸附能力；易制备成不同琼 脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；低的非特异性吸附使应用面 较广；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；可通过交联使介质具有刚性； 可被大量配基取代而应用于多种色谱技术。琼脂糖介质已经在生物医药领域被使用了40余年，利用琼脂糖基质介质生产的生 物药物种类繁多，例如，干扰素、人生长激素、人血清白蛋白、胰岛素、促红细胞 生成素、各种单克隆抗体和疫苗等。这些产品的开发和生产有助于保障公共卫生安全、 提高人民生活质量。美国公司GE Healthcare Bio-Sciences (原Pharmacia,瑞典)的琼 脂糖介质产品均获得美国食品药品监督管理局的认证，表明琼脂糖基质具有优异的安 全性和可靠性。琼脂糖介质5.7亿美元约120万升的世界市场被该公司控制了 60%， 而我国生物制药所使用的琼脂糖介质98%以上依赖进口，每年约耗资5亿元人民币， 随着生物药物需求的快速增长、新生物药物种类的增加，对琼脂糖基质介质的需求也 将迅猛增长。目前国内有一些企业、研究院所及高校从事该介质的研究开发，但产品 种类少、质量稳定性较差、市场占有率非常低，是我国生物技术产业发展急待解决的战略问题。氢键吸附色谱属于亲水相互作用色谱的一种，是近年来在中药活性成分分离纯化 研究过程中提出的概念，常用的氢键吸附色谱介质包括琼脂糖凝胶和聚酰胺，已成功 应用于多种中药多酚类化合物的分离纯化，对强极性有机小分子化合物能够实现较好 的保留，可分离获得高纯度的中药活性成分。琼脂糖凝胶适于作为氢键色谱吸附剂。目前国内外市场上没有专用的琼脂糖基质 氢键吸附色谱介质。30 nm平均粒径的琼脂糖凝胶微球因粒径小，刚性不足，为了能将其灌装工业色谱柱，需要通过交联提高刚性。国内外琼脂糖介质产品因其主要用于生物大分子蛋白质的分离纯化，大多介质粒径在60-120 nm，采用一步或两步交联即可，本项目的纯 化目标是分子量明显低于蛋白质的多肽，需要更高的分辨率，也就要求更小的微球粒 径， 一步或两步交联提供的刚性不能完全满足本项目的需要。从检出文献看，国内已有多家单位采用琼脂糖为基质制备色谱柱填料，如中科 院过程所、北京化工大学、清华大学、中国药科大学、北京理工大学、上海医药工业 研究院、北京大学、中科院生物物理所、南京医科大学、中科院大连化物所、北京北 清创业科技开发有限公司、西安交大保赛生物技术股份有限公司、北京东凯元医药生 物技术研究院等。但我国目前琼脂糖基质介质产品的种类少、市场占有率低，98%以 上的国内市场被国外产品占据，研制具有自主知识产权的琼脂糖介质是急待解决的战 略问题。琼脂糖凝胶介质表面有大量可供反应的羟基，可以通过直接法、间接法引入高密 度的配基，作为亲水吸附色谱的分离介质。没食子酸是亲水吸附色谱的良好供体。发明内容本发明的目的在于提供一种以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶微球为基质，制备具 有高刚性的、高选择性的、以没食子酸为配基的亲水吸附色谱分离材料的合成方法。 用于多酚蛋白质、亲水性多肽和天然有机小分子的分离纯化。本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。本发明提供的使用以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质、以没食子酸为配基的 亲水吸附介质的合成方法，包括如下步骤1) 12%浓度、30 pm平均粒径琼脂糖凝胶微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；2) 加入10-30 g縮水甘油醚，搅拌60-120 min;3) 加入3ml的20%氢氧化钠，搅拌8-12h;4) 加丙酮搅拌l-2h;5) 用5倍体积的丙酮洗10-20 min，用5倍体积的水洗10-20 min;6) 加200ml水，加入5-15g硫酸钠，搅拌2-3 h;7) 加入3ml的20。/。氢氧化钠，搅拌l-2h;8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 。C搅拌3-5 h;9) 用5倍体积的水洗；10) 加入200ml水，加5-15g硫酸钠，搅拌2-3 h;11) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1-2 h;12) 加入30-60 ml表氯醇，35-60 。C搅拌10-15 h;13) 用IO倍体积的水洗；14) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1-2 h;15) 加入10-20 ml烯丙基溴搅拌6-8 h;16) 用盐酸调pH4-6;17) 加入5-10 ml溴水，搅拌2-3 h;18) 加入3-10g没食子酸，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12-20 h;19) 用盐酸调pH4-6;20) 用IO倍体积水洗。
图1为没食子酸配基的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质纯化胸腺五肽色谱图。 图2为没食子酸配基的琼脂糖凝胶氢键吸附色谱介质纯化丹参水提取物色谱图。
具体实施方式
实施例1、没食子酸配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质合成方法11) 12%浓度、30 pm平均粒径琼脂糖凝胶微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；2) 加入10g縮水甘油醚，搅拌60min;3) 加入3ml的20Q/o氢氧化钠，搅拌8 h;4) 加丙酮搅拌lh;5) 用5倍体积的丙酮洗10 min，用5倍体积的水洗10 min;6) 加200ml水，加入5g硫酸钠，搅拌2h;7) 加入3ml的20。/。氢氧化钠，搅拌lh;8) 加入10ml表氯醇，35-60。C搅拌3h;9) 用5倍体积的水洗；10) 加入200 ml水，加5 g硫酸钠，搅拌2 h;11) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1 h;12) 加入30ml表氯醇，35-60 。C搅拌10 h;13) 用IO倍体积的水洗；14) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1 h;15) 加入10 ml烯丙基溴搅拌6 h;16) 用盐酸调pH4;17) 加入5ml溴水，搅拌2h;18) 加入3g没食子酸，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12h;19) 用盐酸调pH6;20) 用IO倍体积水洗。实施例2、没食子酸配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质合成方法21) 12%浓度、30 ^un平均粒径琼脂糖凝胶微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；2) 加入30g縮水甘油醚，搅拌120min;3) 加入3ml的20%氢氧化钠，搅拌12h;4) 加丙酮搅拌2h;5) 用5倍体积的丙酮洗20min,用5倍体积的水洗20 min;6) 加200ml水，加入15g硫酸钠，搅拌3h;7) 加入3ml的20%氢氧化钠，搅拌2h;8) 加入10-30 ml表氯醇，40。C搅拌5h;9) 用5倍体积的水洗；10) 加入200ml水，加15g硫酸钠，搅拌3h;11) 加入3ml的20n/。氢氧化钠，搅拌2h;12) 加入60 ml表氯醇，35 。C搅拌15 h;13) 用IO倍体积的水洗；14) 加入3ml的20n/。氢氧化钠，搅拌2h;15) 加入20ml烯丙基溴搅拌8h;16) 用盐酸调pH6;17) 加入10ml溴水，搅拌3h;18) 加入10g没食子酸，20ml的20氢氧化钠，搅拌20h;19) 用盐酸调pH6;20) 用IO倍体积水洗。
权利要求
1、一种以没食子酸为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质的亲水吸附色谱介质的合成方法。
2、 如权利要求l所述的以没食子酸为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基 质的亲水吸附色谱介质的合成方法，包括如下的步骤1) 12%浓度、30 pm平均粒径琼脂糖凝胶微球100 ml，在砂芯漏斗上用水洗后替 换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；2) 加入10-30 g縮水甘油醚，搅拌60-120 min;3) 加入3ml的20。/。氢氧化钠，搅拌8-12h;4) 加丙酮搅拌l-2h;5) 用5倍体积的丙酮洗10-20 min，用5倍体积的水洗10-20 min;6) 加200ml水，加入5-15g硫酸钠，搅拌2-3 h;7) 加入3ml的20%氢氧化钠，搅拌l-2h;8) 加入10-30 ml表氯醇，35-60 。C搅拌3-5 h;9) 用5倍体积的水洗；10) 加入200ml水，加5-15g硫酸钠,搅拌2-3 h;11) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1-2 h;12) 加入30-60 ml表氯醇，35-60 。C搅拌10-15 h;13) 用IO倍体积的水洗；14) 加入3 ml的20%氢氧化钠，搅拌1-2 h;15) 加入10-20 ml烯丙基溴搅拌6-8 h;16) 用盐酸调pH4-6;17) 加入5-10 ml溴水，搅拌2-3 h;18) 加入3-10g没食子酸，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12-20h;19) 用盐酸调pH4-6;20) 用10倍体积水洗。
全文摘要
本发明涉及一种以没食子酸为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质的亲水吸附色谱介质的合成方法。高浓度、高交联度琼脂糖凝胶介质表面有高密度的可供反应的羟基，用烯丙基溴活化，与溴水反应，加入没食子酸作为配基，所制备的介质在亲水吸附反应中作为氢键供体。本合成方法制备的介质刚性强，配基密度高，选择性强，适宜分离多酚蛋白质、亲水性多肽和天然有机小分子。
文档编号B01J20/286GK101530783SQ20091008031
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月19日 优先权日2009年3月19日
发明者孟桂凤, 邢思亮 申请人:北京康铭优盛生化技术有限公司